堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽工藝的研究

郝曉華，鄭凱南，劉可心

（忻州師范學(xué)院生物系，山西忻州 034300）

藜麥中完全蛋白含量達(dá)到了14%～ 22%（陳思雯，2020），而完全蛋白屬于一類優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，其所含氨基酸種類非常多，除了含有9 種必需氨基酸，還含有豐富的非必需氨基酸（李燕青等，2018）。在藜麥中最值得一提的是一般谷物中缺乏的賴氨酸含量非常高，賴氨酸可促進(jìn)人體組織生長(zhǎng)和修復(fù)（王培宇，2020）。作為必需營(yíng)養(yǎng)元素蛋白質(zhì)是不能被直接吸收的，需要經(jīng)過(guò)胃腸道中多種消化酶的作用，將蛋白質(zhì)分解為低分子的多肽或氨基酸后，在小腸內(nèi)被吸收，沿著肝門靜脈進(jìn)入肝臟（邱友益，2011），并且小分子多肽與單個(gè)氨基酸相比，小分子多肽更容易被吸收（李佳，2016）。

研究表明，多肽幾乎參與到人體所有的組織和細(xì)胞,從生長(zhǎng)、發(fā)育、生殖、代謝甚至到人的情緒控制，因此將其稱為傳遞生命信息的化學(xué)使者（尹樂斌等，2021）。小分子活性肽能促進(jìn)人體激素分泌、促進(jìn)吸收、調(diào)節(jié)人體免疫能力（高洋等，2017）。多肽如何通過(guò)外源性補(bǔ)充幫助人類預(yù)防和治療疾病,改善生理機(jī)能，提高生命品質(zhì)，是目前十分重視的課題（劉閃，2014）。張浩玉等（2020）對(duì)于酶法制備綠豆多肽的工藝取得了很好的成效，李偉民等（2020）通過(guò)尋找新型蛋白資源對(duì)于荷葉多肽的制備也有進(jìn)一步的成果，李可心等（2020）通過(guò)改變藜麥培養(yǎng)條件，得到了制備多肽的極好條件，但是目前鮮見利用堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽工藝的報(bào)道，因此本研究利用堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽，確定藜麥多肽的最佳提取條件，為藜麥肽的制備提供理論基礎(chǔ)（尹佳等，2020；姜東，2020；王培宇，2020）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器 培養(yǎng)皿、酶標(biāo)儀、可見分光光度計(jì)、研缽、離心機(jī)、恒溫水浴鍋、電子天平、100 mL容量瓶、移液槍、玻璃棒、冰箱、電磁爐、試管、試管夾、燒杯、10 mL 量筒、錐形瓶、pH 計(jì)。

1.1.2 主要試劑 白藜麥芽、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、蒸餾水、氫氧化鈉、氯化氫、堿性蛋白酶、乙醇、磷酸，以上試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酶解工藝 藜麥芽的培養(yǎng)：先選取50 g 顆粒均勻且飽滿、完整度好的白藜麥種子，用蒸餾水清洗后置于培養(yǎng)皿中，加入清水使其覆蓋過(guò)種子即可，等待12 h 后移至覆蓋有一層濾紙和兩層紗布的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)等待種子發(fā)芽。

稱取5 g 白藜麥芽，等分成5組，每組加入一定量的蒸餾水，研磨至粉碎獲得白藜麥芽溶液，在溶液中加入氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液為堿性，室溫下攪拌3 min，攪拌充分后通過(guò)添加氫氧化鈉溶液或氯化氫溶液將溶液pH 微調(diào)至一個(gè)固定的pH。

在準(zhǔn)備好的溶液中加入一定量的堿性蛋白酶，置于恒溫水浴鍋中，使其在恒定的溫度下反應(yīng)，酶解反應(yīng)結(jié)束后將酶液迅速置于沸水中滅酶15 min。冷卻至室溫后將其在4200 r/min 下離心15 min，棄去沉淀物取上清液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將100 mg 的牛血清蛋白溶于蒸餾水中，定容至100 mL，得1 mg/mL 的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，4 ℃下保存。取100 mg 考馬斯亮藍(lán)G-250 溶于50 mL 乙醇，加入100 mL 85%磷酸，用蒸餾水稀釋至1000 mL，濾紙過(guò)濾（張浩玉等，2020）。取6 支干凈干燥的試管，分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 和0.7 mL牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，用蒸餾水補(bǔ)齊至1 mL，分別加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250，振蕩使混合均勻，室溫下反應(yīng)3 min，在595 nm 處比色測(cè)定。以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出回歸方程。

1.2.3 多肽含量的測(cè)定 將試驗(yàn)收集到的上清液定容到100 mL，搖勻后移取10 mL 溶液到離心管中，以4000 r/min 離心10 min，使上清液澄清，吸取1 mL 上清液，再加入5 mL 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液混合，以蒸餾水為空白，室溫下反應(yīng)3 min，測(cè)定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線關(guān)系式，計(jì)算多肽含量。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究底物濃度、酶添加量、酶解pH、酶解溫度、酶解時(shí)間5 個(gè)因素對(duì)藜麥芽中多肽含量的影響。（1）在底物濃度10%、溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、pH 9.0 的條件下，分別酶解2、3、4、5、6 h，測(cè)定多肽含量。（2）在pH 9.0、溫度50 ℃、加酶量2000 U/g、酶解3 h 條件下，調(diào)節(jié)底物濃度為6%、7%、8%、9%、10%，測(cè)定多肽含量。（3）在底物濃度8%、加酶量2000 U/g、pH 9.0，溫度分別為40、45、50、55、60 ℃下酶解3 h，測(cè)定多肽含量。（4）在加酶量2000 U/g、底物濃度10%、酶解溫度50 ℃條件下，調(diào)節(jié)pH 分別為7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，酶解3 h，測(cè)定多肽含量。（5）在溫度50 ℃、底物濃度9%、pH 9.0 的條件下，分別確定酶添加量為1000、1500、2000、2500、3000 U/g 反應(yīng)3 h，測(cè)定多肽含量。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以多肽含量為指標(biāo)，酶解pH、酶添加量、溫度和時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化制備藜麥芽多肽的最佳條件（常春等，2021）。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 和Microsoft office 2010 處理和分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 分別配制0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mg/mL 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.2 的方法測(cè)定吸光度。橫坐標(biāo)為牛血清蛋白濃度x，縱坐標(biāo)為吸光度y，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，所得回歸方程為y=0.3043x-0.0044（R2=0.9992）。

圖1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間對(duì)多肽含量的影響 由圖2 可知，藜麥芽多肽的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，隨著時(shí)間的增加，多肽含量開始緩慢增加，在酶解時(shí)間為3 h 時(shí)多肽含量達(dá)到最大，隨著酶解時(shí)間的繼續(xù)增加，多肽含量開始下降，酶解時(shí)間6 h時(shí)，多肽含量達(dá)到最低。產(chǎn)生這個(gè)結(jié)果的原因可能是當(dāng)堿性蛋白酶和底物剛接觸時(shí)發(fā)生了快速的酶解反應(yīng)，但是隨酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)，多肽受環(huán)境影響分解增加，且隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，酶活性逐漸降低，新產(chǎn)生的多肽少于分解的多肽，導(dǎo)致多肽含量整體呈下降趨勢(shì)。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)多肽含量的影響

2.2.2 堿性蛋白酶添加量對(duì)多肽含量的影響 由圖3 可知，藜麥芽多肽含量隨著堿性蛋白酶添加量的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，隨著堿性蛋白酶的增加，多肽含量增加，在酶添加量達(dá)到2000 U/g 的時(shí)候最大。可能是因?yàn)樵谟邢薜牡孜镏忻傅脑黾邮狗磻?yīng)充分發(fā)生，多肽含量增加。達(dá)到頂峰后多肽含量逐漸緩慢下降，可能是當(dāng)酶添加量達(dá)到一定量時(shí)，在有限的底物中，繼續(xù)增加酶用量不能形成更多的酶底中間復(fù)合物，而大分子之間的位阻效應(yīng)形成了空間障礙抑制了酶促反應(yīng)的進(jìn)行，或是蛋白質(zhì)的過(guò)度水解破壞了肽鍵使多肽含量降低。

圖3 酶添加量對(duì)多肽含量的影響

2.2.3 pH 對(duì)多肽含量的影響 由圖4 可知，藜麥芽多肽含量隨著pH 的增大依舊呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，pH 增加的同時(shí)反應(yīng)速率也在增加，多肽含量也在增加，當(dāng)pH 到達(dá)10.0 的時(shí)候，多肽含量達(dá)到了最大值，這是因?yàn)閴A性蛋白酶促作用需要在堿性環(huán)境下進(jìn)行，隨著堿性的增加酶活性也達(dá)到最佳狀態(tài)，而pH 較小不利于堿性蛋白酶的作用，達(dá)到峰值后隨pH 的增加多肽含量開始逐漸下降，這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在過(guò)酸或者過(guò)堿的環(huán)境中結(jié)構(gòu)會(huì)受到很大的影響，過(guò)堿會(huì)導(dǎo)致酶的理化性質(zhì)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，進(jìn)一步使酶活性下降，從而影響酶與底物的結(jié)合，因此多肽含量會(huì)下降。

圖4 pH 對(duì)多肽含量的影響

2.2.4 底物濃度對(duì)多肽含量的影響 由圖5 可知，隨著底物濃度的增加藜麥芽多肽含量呈現(xiàn)出先增后降的趨勢(shì)，說(shuō)明堿性蛋白酶在底物濃度較低時(shí)反應(yīng)緩慢，隨著底物濃度的增加多肽含量增加，底物濃度達(dá)到9%的時(shí)候，多肽含量達(dá)到了最大值，此時(shí)的酶解反應(yīng)最為充分。當(dāng)多肽含量達(dá)到最大值之后再繼續(xù)增加底物濃度出現(xiàn)多肽含量降低的情況，可能是由于隨著體系底物蛋白濃度的增加，水解體系中多肽濃度隨之增加，多肽類產(chǎn)物對(duì)蛋白酶的反饋抑制作用增強(qiáng)，從而導(dǎo)致水解體系中有效酶活降低。

圖5 底物濃度對(duì)多肽含量的影響

2.2.5 酶解溫度對(duì)多肽含量的影響 由圖6 可知，隨著酶解溫度的不斷升高，多肽含量出現(xiàn)了先增加后減少的趨勢(shì)。在40 ℃的時(shí)候含量最低，達(dá)到50 ℃后多肽含量達(dá)到了最大值，繼續(xù)升高溫度多肽含量開始緩慢下降。這原因可能是溫度較低或較高會(huì)抑制酶的活性導(dǎo)致一部分酶失活影響了酶催化效率，每一種酶都有最適溫度，達(dá)到最適溫度時(shí)酶促反應(yīng)速率最快。所以50 ℃就是堿性蛋白酶酶解藜麥芽制備多肽的最適溫度。

圖6 溫度對(duì)多肽含量的影響

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化酶解制備工藝 通過(guò)對(duì)各個(gè)單因素試驗(yàn)結(jié)果的分析，固定底物濃度為9%，選用酶解時(shí)間（A）、酶解溫度（B）、酶解pH（C）、酶添加量（D）為自變量，多肽含量為響應(yīng)值，如表1 采用四因素三水平的正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化。在表2中，通過(guò)對(duì)極差R 的分析，極差R 越大表明影響越大，得出影響制備藜麥芽多肽含量的各個(gè)因素主次順序?yàn)镈＞A＞B＞C。因此，酶添加量是對(duì)制備多肽影響最大的因素，酶解pH 是對(duì)制備多肽影響最小的因素。從正交試驗(yàn)結(jié)果得出酶解制備多肽的最佳提取方案為A1B2C2D2。

表1 正交試驗(yàn)因素水平

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 如表3 所示，為驗(yàn)證正交試驗(yàn)所得的結(jié)果具有可行性，在上述最佳制備條件下進(jìn)行3 次平行重復(fù)試驗(yàn)并測(cè)定藜麥芽中制備出來(lái)的多肽含量。經(jīng)驗(yàn)證，藜麥芽中制備出來(lái)的多肽含量為（0.4105±0.0021）mg/mL，大于正交試驗(yàn)分析所得的最大值，表明該制備工藝合理可行。

表3 多肽含量驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果mg/mL

3 結(jié)論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，各單因素對(duì)多肽提取率影響的主次順序?yàn)椋好柑砑恿?，酶解時(shí)間，酶解溫度，酶解pH。結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶酶解法制備藜麥芽多肽的最優(yōu)工藝條件為：酶添加量2000 U/g，酶解溫度50 ℃，酶解時(shí)間3 h，酶解pH 10.0，底物濃度9%。在此條件下多肽含量達(dá)到了（0.4105±0.0021）mg/mL。表明該制備工藝穩(wěn)定、可行。