中華獼猴桃根抗肝癌分子調控機制研究

孫慶慶， 陳曉泉， 陳潞君， 曲美霖， 李 京

1. 聯(lián)勤保障部隊臨潼康復療養(yǎng)中心，陜西 西安710600；2. 陜西省腫瘤醫(yī)院 中西醫(yī)科，陜西 西安710061；3. 中國醫(yī)科大學，遼寧 沈陽110122；4. 沈陽藥科大學，遼寧 沈陽110016；5. 遼寧中醫(yī)藥大學，遼寧 沈陽110032

肝癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。 目前，肝癌的治療措施主要包括手術、介入、靶向、免疫治療等，但均面臨有效率低、藥物耐藥、腫瘤復發(fā)等問題[1-3]。 近年來，中藥在治療肝癌方面發(fā)展迅速，在改善患者臨床癥狀、減輕痛苦、延長生存期方面發(fā)揮著重要作用[4-7]。 中華獼猴桃根在治療肝癌中發(fā)揮著至關重要的作用，但其抗肝癌的作用機制復雜，目前尚未完全闡明，臨床應用受到限制。 因此，有必要深入研究其抗肝癌的分子作用機制。 本研究從中藥網(wǎng)絡藥理學及分子對接角度對中華獼猴桃根治療肝癌可能的靶點進行數(shù)據(jù)挖掘，旨在探討中華獼猴桃根對肝癌具體的分子作用機制。 現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集 中華獼猴桃根的活性化學成分及靶點基因來自中草藥系統(tǒng)藥理學平臺(TCMSP，https:/ /tcmsp-e. com/)、SymMAP 數(shù)據(jù)庫、HERB 數(shù)據(jù)庫、pubchem 數(shù)據(jù)庫，以及相關文獻報道。 從癌癥基因組圖譜數(shù)據(jù)庫(the cancer genome atlas，TCGA)和國際癌癥基因組聯(lián)合體數(shù)據(jù)庫(International Cancer Genome Association Database，ICGC)下載截至2021 年12 月收錄的肝癌患者腫瘤組織與正常肝組織的轉錄組數(shù)據(jù)及臨床信息。 代謝相關基因來自MSigDB 數(shù)據(jù)庫和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫。

1.2 研究方法

1.2.1 中華獼猴桃根有效活性成分及靶點篩選 首先從TCMSP 數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“Actinidia Chinensis Planch”，挖掘與中華獼猴桃根相關的活性成分，利用molsoft 網(wǎng)站和preADMET 網(wǎng)站對文獻中報道的相關活性成分進行DL 評分，篩選出類藥性DL≥0.18 的化合物為中華獼猴桃根的有效活性成分。 從SymMAP 數(shù)據(jù)庫、HERB 數(shù)據(jù)庫及pubchem 數(shù)據(jù)庫檢索出每個活性成分對應的相關靶點。 利用Uniprot 數(shù)據(jù)庫中下載的“homo sapiens”的所有基因數(shù)據(jù)，整理所得靶點蛋白和基因信息，進行標準化校正。

1.2.2 靶點基因的篩選 利用R 4.1.1 軟件，以P ＜0.05 及l(fā)ogFC ＞1 為篩選條件，獲得肝癌組織中差異表達的代謝基因。 將差異代謝基因與中華獼猴桃根活性成分的靶基因做交集處理，獲得交集基因，即中華獼猴桃根主要作用于肝癌代謝相關的基因靶點。

1.2.3 蛋白互作網(wǎng)絡構建 通過Cytoscape 3.9.0軟件建立“中華獼猴桃根藥效成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡，獲取節(jié)點的度值較大的靶點。 將中華獼猴桃根抗肝癌靶點導入STRING 數(shù)據(jù)庫，利用“Multiple proteins”模塊工具進行“蛋白質-蛋白質”的相互作用分析，參數(shù)“organism”設置為“homo sapiens”，參數(shù)“minimum required interaction score”設置為“medium confidence(0.400)”，參數(shù)“network display options”設置為“hide disconnected nodes in the network”，其他參數(shù)設置均為系統(tǒng)默認值。

1.2.4 GO 功能及KEGG 通路富集分析 對交集基因進行GO 功能富集分析，篩選條件為P ＜0.05，利用colorspace 包、stringi 包、DOSE 包、clusterProfiler 包、pathview 包等R 包繪制出基因涉及的生物學功能、途徑、細胞定位3 方面的生物過程。 KEGG 通路富集分析中華獼猴桃根治療肝癌過程中顯著改變的代謝通路，篩選條件為P ＜0.05，利用enrichplot 包、ggplot2 包、pathview 包分析KEGG 富集的關鍵通路。

1.2.5 分子對接 通過PDB 數(shù)據(jù)庫搜索蛋白靶點，利用vina 軟件進行分子對接， 結合能≤-5.0 kcal/mol提示藥效分子與蛋白之間的結合活性較高。 應用PyMOL 軟件對結合能絕對值較大的對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 藥效成分及差異代謝基因靶點篩選結果 TCMSP平臺最終篩選出15 種中華獼猴桃根有效成分化合物，涉及靶點基因326 個。 MSigDB 數(shù)據(jù)庫和Gene Cards 數(shù)據(jù)庫獲得1 095 個代謝相關基因，提取代謝基因在TCGA 數(shù)據(jù)庫肝癌表達譜中的表達量，將篩選后的321 個差異表達的代謝基因納入研究，并與326 個靶點基因進行交集映射，得到ACACA、ACSL4、AKR1C3、CYP1A2、CYP2C19 等表達上調或下調的20 個抗癌基因。

2.2 蛋白互作網(wǎng)絡及藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡構建結果 將20 個靶點基因導入STRING 數(shù)據(jù)中構建蛋白互作網(wǎng)絡(圖1a)。 將互作網(wǎng)絡導入Cytoscape創(chuàng)建中華獼猴桃根的藥效成分與對應靶點的網(wǎng)絡映射，主要涉及槲皮素、山奈酚、β-谷甾醇、芒柄花素、蘆薈大黃素、胡蘿卜素等13 種活性成分，對應ACACA、 ACSL4、 AKR1C3、 CYP1A2、 CYP2C19、CYP2C9 等20 個潛在靶點(圖1b)。

圖1 蛋白互作網(wǎng)絡及藥物活性成分-靶點網(wǎng)絡構建結果(a. 交集基因的蛋白互作網(wǎng)絡圖；b. “中華獼猴桃根活性成分-靶點基因-疾病”網(wǎng)絡圖)

圖2 GO 富集分析結果 圖3 KEGG 通路富集分析結果

2.3 GO 功能與KEGG 通路富集分析結果 GO 富集分析結果顯示，其生物學過程主要在脂肪酸代謝過程、長鏈脂肪酸代謝過程、不飽和脂肪酸代謝過程、烯烴化合物代謝過程、脂肪酸生物合成過程等。見圖2。 KEGG 通路富集分析結果顯示，信號通路主要涉及化學致癌作用-DNA 加合物、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、藥物代謝-細胞色素P450、細胞色素P450 對異生物質的代謝等。 見圖3。

2.4 分子對接結果 藥物活性成分-靶點-潛在通 路分析結果顯示，共涉及9 個代謝途徑，POLD1、AKR1C3、CYP2C9、ACACA 等4 個靶點基因，槲皮素、山奈酚2 種有效成分。 見圖4。 對篩選得到的2 個有效成分與4 個靶點基因進行分子對接，結果顯示，槲皮素-POLD1 結合能為-9.7 kcal/mol，山奈酚-AKR1C3 結合能為- 9.2 kcal/mol，槲皮素-CYP2C9 結合能為-9.2 kcal/mol，槲皮素-ACACA結合能為-9.1 kcal/mol，山奈酚-POLD1 結合能為-9.1 kcal/mol， 山 奈 酚-CYP2C9 結 合 能 為-8.1 kcal/mol，山奈酚、槲皮素與4 個核心靶點蛋白結合能絕對值均較高，可能是中華獼猴桃根治療肝癌過程中發(fā)揮療效的關鍵成分。 槲皮素-POLD1、山奈酚-AKR1C3、槲皮素-CYP2C9 結合能的絕對值較高，分子對接圖見圖5。

圖4 藥物活性成分-靶點-潛在通路網(wǎng)絡圖

圖5 分子對接模式圖(a. 山奈酚-AKR1C3；b. 槲皮素-CYP2C9；c. 槲皮素-POLD1)

3 討論

肝癌的發(fā)生發(fā)展與其代謝過程密不可分。 代謝重編在促進肝癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。 肝癌細胞為了快速生長、增殖的需要，發(fā)生一系列代謝重編過程以適應生存環(huán)境，如糖酵解異常活躍、脂肪酸從頭合成、氨基酸及核苷酸代謝異?；钴S等。中華獼猴桃根具有清熱解毒、活血化瘀等功效，其可能通過調節(jié)肝癌細胞中能量代謝以抵抗腫瘤的生長侵襲。 此外，其還可以通過調節(jié)肝癌患者的氣血瘀滯、血脈不通等狀態(tài)，改善肝癌患者缺氧的微環(huán)境，影響癌細胞的能量合成，抑制腫瘤細胞快速增殖[8]。

腫瘤細胞的代謝重編涉及多種途徑[9-11]。 徐瑩等[12]研究表明，獼猴桃根提取物可促進Akt 基因表達，抑制其磷酸化，通過p-Akt/PTEN 信號通路抑制肝癌細胞增殖，阻滯細胞周期，誘導細胞凋亡。 此外，He 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，獼猴桃根提取物還可以通過調控PCSK9 介導的信號通路抑制膽固醇代謝，進而產生抗肝癌活性。 這提示，中華獼猴桃根在肝癌代謝重編的調節(jié)中發(fā)揮重要作用，并且可以通過多種機制進行調節(jié)。 本研究構建了“中華獼猴桃根藥效化合物-靶基因-肝癌”網(wǎng)絡，最終得到AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個肝癌預后代謝相關基因。 AKR1C3 高表達與肝癌患者較差的存活率相關，其可通過激活NF-κB 信號傳導，促進STAT3的磷酸化，參與MAPK/ERK 信號通路等正調控肝癌細胞增殖和轉移[14-15]。 CYP2C9 在正常肝組織中廣泛參與外源及內源物質的代謝，在調節(jié)細胞周期、細胞增殖及細胞凋亡中起重要作用。 有研究發(fā)現(xiàn)，CYP2C9 高表達可能是有利的肝癌預后信號，因此，CYP2C9 可能作為進一步改善肝癌患者預后的治療靶點[16-17]。 耿西林等[18]研究發(fā)現(xiàn)，ACACA 在肝癌細胞中表達上調，可通過促進Snail 介導的上皮-間質轉化，增強細胞侵襲與遷移能力，進而促進肝癌轉移。 在腫瘤組織中，高表達的ACACA 可以促進脂肪生成以滿足腫瘤細胞的快速生長和增殖，抑制其活性可使腫瘤細胞脂肪酸合成受阻，達到抑制腫瘤生長及增殖的目的[19-20]。 歐賢紅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，POLD1 基因表達與編碼蛋白的表達在肝癌組織中顯著高于癌旁組織，其上調與肝癌細胞的惡性增殖有關。

本研究發(fā)現(xiàn)，中華獼猴桃根中的山奈酚和槲皮素是作用于AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個靶點的主要活性成分。 山奈酚和槲皮素均屬于黃酮類化合物。 山奈酚在調節(jié)肝癌代謝紊亂、阻礙肝癌細胞生長方面具有重要價值，主要通過降低人肝癌細胞中的PI3K/AKT/mTOR 和p-mTOR 信號通路及缺氧誘導因子1 表達，增強Janus 激酶1、酪氨酸激酶2、STAT1/2、磷酸酶和張力蛋白同源物的表達，參與線粒體途徑和內質網(wǎng)應激途徑，抑制肝癌細胞增殖，誘導細胞凋亡[22]。 槲皮素在體內外也具有較好的抗肝癌活性，主要通過抑制葡萄糖轉運蛋白1 表達，降低HK2 蛋白水平，調節(jié)P13K/Akt/mTOR 信號通路和MAPK/ERK1/2 信號通路，進而影響肝癌細胞中的葡萄糖代謝和細胞能量產生，抑制肝癌細胞轉移并誘導凋亡[23]。

綜上所述，槲皮素和山奈酚可能是中華獼猴桃根干預肝癌細胞代謝重編過程中起主要活性的藥效成分，其可能通過作用于AKR1C3、CYP2C9、ACACA、POLD1 這4 個靶點，參與調節(jié)腫瘤細胞中的代謝重編過程。 本研究存在一定不足，本研究僅在理論水平初步預測了中華獼猴桃根治療肝癌的作用機制，有待開展相關實驗研究進一步分析。