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    交叉引物恒溫擴增技術在初診疑似肺結核患者診斷中的應用價值

    2022-08-05 02:19:42蔣淑萍劉昌偉李斌徐小琴羅文基余柏林張月
    中國防癆雜志 2022年8期
    關鍵詞:抗酸敏感度液體

    蔣淑萍 劉昌偉 李斌 徐小琴 羅文基 余柏林 張月

    目前,診斷肺結核主要依靠細菌學檢測,方法有多種,如萋-尼抗酸染色法(acid-fast stain,AFS),此方法操作簡單、快捷及經濟,但敏感度較低,容易漏檢;培養(yǎng)法是檢測結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)的金標準,但耗時較長,需1~2個月才能出結果,且極易受環(huán)境、人為操作等影響,同時后期還可能需要繼續(xù)進行菌種鑒定,影響結核病的早期診斷;組織病理學檢查雖有較高的準確性,但有創(chuàng)傷性;分子生物學技術能直接檢測MTB特有的核酸序列,且操作方便、快速及敏感度和特異度高,是目前結核病診斷的發(fā)展趨勢,但其價格昂貴,不適合基層醫(yī)院普遍開展[1-3]。因此,探索一種更合適的早期診斷方法至關重要。交叉引物核酸恒溫擴增技術(cross-priming amplification,CPA)是一種新型恒溫擴增技術,具有操作簡單、報告快速及相對便宜等特點,具有廣泛應用前景[4-5]。以固體培養(yǎng)法為參照對CPA技術檢測效能評價已見報道,但以液體培養(yǎng)法為參照進行評價罕見報道。為此,本研究通過以BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)液體培養(yǎng)法為參照,與AFS 法比較,評估CPA技術在MTB檢測中的效能。

    資料和方法

    一、研究對象

    1.一般資料:收集2020年1月至2021年5月在深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心就診的初診疑似肺結核患者2507例,排除99例非結核分枝桿菌感染者,共納入2408例進行分析。其中男1607例,女801例;年齡6~93歲,中位年齡[M(Q1,Q3)]為32(26~45)歲。納入標準:(1)咳嗽、咳痰時間>2周,自愿到院接受各項相關檢查;(2)初診疑似肺結核;(3)未經抗結核治療;(4)能送檢至少1份合格痰標本;(5)患者及家屬知情并簽訂知情同意書。排除標準:(1)未同時進行3種方法檢測者;(2)非結核分枝桿菌感染或定植者;(3)不自愿配合者;(4)檢測期間,由于技術原因導致結果缺失者;(5)任一方法檢測結果為無效者。(6)AFS陽性而MPB64抗原陰性者。

    2.倫理:本研究經深圳市龍華區(qū)慢性病防治中心倫理委員會批準同意([2020]03號)。

    二、儀器與試劑

    4%氧氧化鈉(廣東汕頭西隴化工有限公司);p H值6.8的磷酸緩沖鹽溶液(無錫傲銳東源生物科技有限公司);萋-尼抗酸染色試劑(上海皓信生物科技有限公司);MGIT 960液體培養(yǎng)試劑(美國BD公司);MTB抗原試劑盒(杭州創(chuàng)新生物檢控技術有限公司);CPA檢測試劑(杭州優(yōu)思達生物技術有限公司)。

    三、方法

    1.標本采集:對患者進行留痰宣教后,患者自行留取就診當日及時痰、夜間痰及就診次日清晨痰共3份,每份2~5 ml,及時送檢。收到標本后將3份標本混合成1份,然后同時采用AFS法、MGIT 960液體培養(yǎng)法及CPA技術進行檢測。

    2.AFS法:參照《結核病實驗室檢驗規(guī)程》[6]抗酸桿菌顯微鏡檢查標準化操作程序進行。藍色背景下抗酸桿菌呈紅色,連續(xù)觀察300個不同視野,未發(fā)現(xiàn)抗酸桿菌為陰性;發(fā)現(xiàn)3~9個/300個視野或更多為陽性。

    3.MGIT 960 液體培養(yǎng)法:嚴格按照MGIT 960系統(tǒng)操作說明書進行操作,培養(yǎng)時間設定為42 d。儀器報告陽性后,即取培養(yǎng)液進行抗酸染色及MPB64抗原檢測。若抗酸染色和MPB64抗原檢驗均陽性者則為培養(yǎng)陽性;若二者全部為陰性或抗酸染色陰性和MPB64抗原陽性者,判為污染菌,需將培養(yǎng)液當標本消化處理后再培養(yǎng);若抗酸染色陽性而MPB64抗原陰性者則疑似非結核分枝桿菌,本研究予以排除。儀器培養(yǎng)42 d后報陰性者則為培養(yǎng)陰性。

    4.MPB64抗原檢測方法:取待鑒定的液體培養(yǎng)液100μl滴至檢測板樣本檢測區(qū),15~60 min內觀察檢測結果。檢測線(T)和質控線(C)均出現(xiàn)紫紅色條帶者為陽性,檢測線(T)沒出現(xiàn)紫紅色條帶而質控線(C)出現(xiàn)紫紅色條帶者為陰性,質控線(C)沒出現(xiàn)紫紅色條帶者均需重新檢測。

    5.CPA 技術:采用Easy NAT 恒溫擴增-試紙條法試劑盒及核酸提取試劑對MTB-DNA 進行提取,操作均嚴格按照說明書要求進行。若痰液標本黏稠度較高,取適量標本以4%NaOH 消化(根據(jù)黏稠度加入1~2倍),然后進行離心、生理鹽水洗滌、加核酸提取試劑及100℃金屬浴等處理,得到上清DNA模板,然后取DNA模板液于玻璃化反應體系管中進行核酸恒溫擴增,完成后取出反應管置入一次性防污染檢測裝置,扣緊進行檢測,1~2 min讀取結果。結果判斷標準:(1)陽性:質控線(C)和檢測線(T)同時顯色,或僅出現(xiàn)T線顯色,這表明樣本中含有MTB,且含菌量已達到或超出了試劑盒的最低檢出限。(2)陰性:僅C線顯色,這表明樣本中并不含有MTB 或其含菌量未達到試劑盒最低檢出限。(3)無效:C線和T線均未顯色,這表明操作有誤、試劑盒受損或有擴增抑制物,如遇此情況,需要查明導致結果無效的原因,重新檢測。

    6.相關指標計算:敏感度=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%;陽性預測值=真陽性例數(shù)/(真陽性例數(shù)+假陽性例數(shù))×100%;陰性預測值=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陰性例數(shù))×100%;符合率=(真陽性例數(shù)+真陰性例數(shù))/患者總例數(shù)×100%。

    7.質量控制:痰檢質量室間質量評價由北京結核病診斷技術創(chuàng)新聯(lián)盟以及深圳市慢性病防治中心組織進行,質評結果全部合格。室內質控2020年涂陽培陰率為0.25%,液體培養(yǎng)污染率為7.93%,CPA檢測無效率0。

    8.觀察指標:不同方法MTB陽性檢出率、敏感度、一致性及培養(yǎng)陽性時間與敏感度的相關性。

    四、統(tǒng)計學處理

    應用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用“百分率(%)”描述,差異性比較采用χ2檢驗;非正態(tài)性計量資料以”中位數(shù)(四分位數(shù))”描述;結果一致性采用Kappa檢驗,Kappa值≥0.75為一致性很好,0.40≤Kappa值<0.75為一致性較好,Kappa值<0.40時為一致性較差;相關性采用卡方趨勢性檢驗,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    結果

    一、三種方法MTB陽性檢出率比較

    AFS法、MGIT 960液體培養(yǎng)法及CPA技術MTB陽性檢出率分別為8.89%(214/2408)、27.99%(674/2408)及15.49%(373/2408),不同方法之間差異有統(tǒng)計學意義(χ2=314.619,P=0.000),其中MGIT 960液體培養(yǎng)法明顯高于CPA技術和AFS法,而CPA 技術高于AFS法,差異均有統(tǒng)計學意義(χ2=110.572,P=0.000;χ2=292.158,P=0.000;χ2=49.046,P=0.000)。

    二、CPA技術檢測效能評估

    以MGIT 960 液體培養(yǎng)結果作為參照標準,CPA檢測MTB的敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及符合率分別為52.37%、98.85%、94.64%、84.23%及85.84%(2067/2408),而AFS法分別為31.45%、99.88%、99.07%、78.94%及80.73%(1944/2408),其中CPA技術的敏感度明顯高于AFS 法,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=108.290,P=0.000)。以MGIT 960液體培養(yǎng)結果為參照標準,CPA技術與MGIT 960液體培養(yǎng)法一致性較好(Kappa=0.592),而AFS法較差(Kappa=0.395)。同時AFS法陽培陰率為0.08%(2/2408),培養(yǎng)污染率為5.40%(130/2408),而CPA 檢測無效例數(shù)為0(表1)。

    表1 以MGIT 960液體培養(yǎng)結果為參照評估CPA技術檢測MTB效能

    三、CPA檢測敏感度與培養(yǎng)報陽時間相關性

    MGIT 960液體培養(yǎng)報陽時間為3~42 d,中位數(shù)(四分位數(shù))為14(10,19)d,其中68.10%的標本報陽在7~19 d,而CPA 檢測敏感度隨培養(yǎng)報陽時間增加而降低。經趨勢性卡方檢驗,CPA 敏感度隨培養(yǎng)報陽時間的增加而呈下降趨勢(Z趨勢=257.788,P=0.000),兩者呈負相關(r=-0.988,P=0.000)(表2)。

    表2 CPA檢測敏感度與MGIT 960液體培養(yǎng)報陽時間相關性

    討 論

    結核病是由MTB感染,并經呼吸道傳播的一種嚴重慢性傳染性疾病。隨著人們在飲食習慣和作息時間的改變及社會壓力劇增等因素的共同影響下,人體免疫力下降,從而導致近年來結核病發(fā)病率呈持續(xù)上升趨勢,且年輕化。MTB感染潛伏期長達4~8周,早期無任何臨床癥狀或癥狀輕微,易被疏忽,確診時病情已發(fā)展到活動階段,錯過了最佳的治療時機,嚴重影響患者及時診斷、治療及傳播防控[7-9]。因此,加強結核病早期診斷對控制病情發(fā)展及傳播至關重要。

    CPA是我國自主研發(fā)的第一個具有自主知識產權的體外核酸擴增技術,主要包括玻璃引物、交叉引物、探針及具有鏈置換功能的DNA 聚合酶,針對MTB特異性基因片段進行擴增,然后利用免疫層析乳膠標記的試紙條進行檢測,能排除非結核分枝桿菌的影響,而AFS法則不能,從而提高CPA 技術檢測效能[10-12]。本研究結果顯示,以MGIT 960液體培養(yǎng)結果為參照,CPA 技術MTB 陽性檢出率(15.49%)明顯高于AFS法(8.89%),但CPA 技術的MTB陽性檢出率明顯低于MGIT 960液體培養(yǎng)法(27.99%),而特異度高,這可能與CPA技術最低檢測下限和檢測原理有關。同時CPA 技術檢測MTB的敏感度(52.37%)明顯高于AFS法(31.45%),差異有統(tǒng)計學意義,與劉蘭瑞等[2]的研究結果基本一致,且CPA技術與MGIT 960液體培養(yǎng)法檢查結果一致性(Kappa=0.592)明顯好于AFS法(Kappa=0.395),這表明CPA 技術在初診疑似肺結核診斷中與AFS法比較有較高的敏感度和一致性,可提高MTB陽性檢出率。另外結果顯示,AFS法陽培陰率為0.08%及MGIT 960液體培養(yǎng)法培養(yǎng)污染率為5.40%,但未發(fā)現(xiàn)CPA 技術檢測無效案例,且CPA技術檢測全過程只需要2 h,可與AFS法相媲美。

    有研究表明,以固體培養(yǎng)法結果為參照,CPA技術檢測MTB的敏感度約為84.1%~100%。本研究結果顯示,以MGIT 960液體培養(yǎng)結果為參照,CPA技術檢測MTB的敏感度僅有52.37%,明顯低于以固體培養(yǎng)法結果為參照的CPA 技術的敏感度,這可能與MGIT 960液體培養(yǎng)法的培養(yǎng)敏感度比固體培養(yǎng)法檢出能力更高,能將MTB含菌量更低的標本培養(yǎng)出陽性等有關[13-16]。另外,有研究表明,液體培養(yǎng)檢出陽性結果時間與痰中分枝桿菌的數(shù)量有關,標本含菌量越低,報陽時間越長[17]。本研究結果顯示,MGIT 960液體培養(yǎng)中位報陽天數(shù)為14 d,68.10%的標本在7~19 d內報陽,與其他報道存在一定差異[18-21],這可能與不同地區(qū)標本中MTB含量不同有關。同時CPA敏感度隨培養(yǎng)報陽時間的增加而呈下降趨勢(Z趨勢=257.788,P=0.000),且兩者呈負相關(r=-0.988,P=0.000),這表明CPA技術檢測MTB的敏感度與標本中的MTB含菌量有關。此外,本研究收集了49 份MGIT 960液體培養(yǎng)陽性而CPA 陰性標本,逐級增加標本量進行檢測,其中14份標本由陰性轉變?yōu)殛栃?,有些甚至痰量增加? ml才出現(xiàn)陽性,從而可以推測對于CPA技術結果陰性而又高度懷疑結核病患者,可通過增大檢測標本量,并對其進行消化和梯隊濃縮的方案在一定程度上能提高CPA 技術檢出效能。

    綜上所述,CPA 作為一種新型分子檢測方法,在初診疑似肺結核診斷中與AFS法比較有較高的陽性檢出率、敏感度、特異度和一致性。同時CPA技術不需價格高昂的特殊設備,檢測過程中不會產生有害物質造成二次污染,且操作簡單方便、快速及經濟,具有較高的臨床應用價值,但其試劑盒檢測下限有待提高。

    利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

    作者貢獻蔣淑萍:實驗設計、實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、起草文章及審閱、獲取研究經費、技術支持;劉昌偉:實驗設計、分析/解釋數(shù)據(jù)、審閱、統(tǒng)計分析、行政及技術支持與指導;李斌:實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)、審閱、行政及材料支持;徐小琴、羅文基、余柏林及張月:實施研究、采集數(shù)據(jù)、分析/解釋數(shù)據(jù)及審閱

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