生育酚氧化產(chǎn)物生育酚醌的研究進(jìn)展

鄭立友，莫妮娜，胡秀秀，賈惠婷，王 政，謝亮亮，謝 丹，金 俊，金青哲，郭紅艷

(1.安徽工程大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 蕪湖214000； 2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122)

植物油脂富含生育酚，但不同種類(lèi)的植物油脂所含生育酚的類(lèi)型和含量大不相同[1]。生育酚醌(TQ)是生育酚的主要脂質(zhì)過(guò)氧化代謝物，其在生物系統(tǒng)中具有抗菌活性[2]、抗氧化活性[3]、選擇性細(xì)胞毒性[4-7]等多種作用，近年來(lái)逐漸受到關(guān)注，其有4種主要結(jié)構(gòu)：α-TQ、β-TQ、γ-TQ、δ-TQ(見(jiàn)圖1)。

圖1 生育酚醌(TQ)的主要結(jié)構(gòu)

TQ是一類(lèi)潛在的食品安全危害因子。研究表明，因α-TQ中六元環(huán)被完全取代，不具有芳基化活性，而β-TQ、γ-TQ、δ-TQ由于六元環(huán)未被完全取代，具有芳基化活性，因而具有一定的細(xì)胞毒性[8-9]。相較于生育酚研究的深度及廣度，TQ的研究起步較晚，相關(guān)研究亟待開(kāi)展。目前植物油脂經(jīng)常用于加熱使用(微波、烘箱和煎炸等過(guò)程)，勢(shì)必會(huì)有TQ的生成。因此，本文歸納總結(jié)了TQ的檢測(cè)、食品加工中TQ的生成規(guī)律影響因素及其毒性和抗氧化等方面的研究現(xiàn)狀，進(jìn)而指出了現(xiàn)階段研究存在的問(wèn)題，并提出了TQ研究的發(fā)展方向，旨在為充分研究TQ提供一定的研究基礎(chǔ)參考，避免丙烯酰胺、氯丙醇酯等類(lèi)似食品安全事件的再次發(fā)生。

1 生育酚醌的檢測(cè)方法

1.1 液相色譜法

因液相色譜無(wú)需進(jìn)行樣品衍生化處理，樣品預(yù)處理相對(duì)簡(jiǎn)單，因此其被廣泛應(yīng)用于生育酚及其醌類(lèi)物質(zhì)的檢測(cè)。目前主要采用甲醇/乙腈-水為主要流動(dòng)相的反相液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行生育酚及其醌類(lèi)化合物的檢測(cè)分析，如：Kruk等[10]通過(guò)反相高效液相色譜系統(tǒng)RP-HPLC，配備熒光檢測(cè)器，發(fā)射波長(zhǎng)290 nm，吸收波長(zhǎng)330 nm)，配合鋅柱柱后衍生技術(shù)測(cè)定衣藻提取物中的α-TQ和γ-TQ的含量，發(fā)現(xiàn)兩者含量受植物生長(zhǎng)環(huán)境及生長(zhǎng)階段的影響較大；Kreps等[11]采用正相色譜同步測(cè)定生育酚單體(α-、β-、γ-、δ-生育酚)和總醌的含量，同時(shí)采用RP-HPLC梯度洗脫條件下測(cè)定γ-TQ。

目前，高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用作為物質(zhì)高效分離檢測(cè)手段，已開(kāi)始用于測(cè)定生育酚及其氧化產(chǎn)物TQ等[12-13]。前期本文作者通過(guò)超高效液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿飛行時(shí)間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)分別檢測(cè)并鑒定了生育酚及TQ等物質(zhì)[14]，后續(xù)將進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件，建立同步檢測(cè)的方法。

目前液相色譜配備紫外檢測(cè)器(HPLC-UV)應(yīng)用最為廣泛，隨著檢測(cè)手段及檢測(cè)技術(shù)的升級(jí)，液質(zhì)聯(lián)用法將更為普及。本文主要列舉了部分有關(guān)TQ和生育酚的液相色譜測(cè)定方法，具體參數(shù)如表1所示。

表1 HPLC測(cè)定TQ的分析檢測(cè)方法

續(xù)表1

1.2 其他方法

薄層色譜法也被用于TQ的分離檢測(cè)[25]。另外，也有學(xué)者采用氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)TQ，如Melchert等[26]采用羥丙基葡聚糖凝膠(Sephadex LH-20) 進(jìn)行樣品預(yù)處理、預(yù)分離，并采用GC-MS進(jìn)行TQ(游離型和硅烷化型)含量的測(cè)定，在全掃描模式下，檢測(cè)限和定量限分別為1 μL進(jìn)樣體積含有1 ng和10 ng物質(zhì)，達(dá)到了較好的定量定性效果。

2 食品中生育酚醌生成規(guī)律影響因素

TQ主要在富含生育酚的植物油脂加熱過(guò)程中形成，其中150～220℃為其生成的最佳溫度；加工溫度較低，TQ的含量較低。因植物油脂中生育酚單體含量差異較大，熱加工過(guò)程中產(chǎn)生的TQ構(gòu)成(種類(lèi)及含量)也有較大的差異。

首先，溫度是影響TQ生成的主要因素。Murkovic等[27]通過(guò)加熱強(qiáng)化α-生育酚的玉米油時(shí)發(fā)現(xiàn):90℃下α-TQ含量隨加熱時(shí)間的延長(zhǎng)(0～11 h)逐步增加，在11 h時(shí)α-TQ含量高達(dá)130 mg/kg；180℃下加熱7 h，α-TQ含量高達(dá)275 mg/kg，而后含量趨于穩(wěn)定；220℃下α-TQ生成速率最快，加熱1 h其含量已達(dá)到150 mg/kg，但由于該溫度下α-TQ不穩(wěn)定，隨著加熱時(shí)間的延長(zhǎng)，其含量呈逐步下降的趨勢(shì)，這也與文獻(xiàn)[23]報(bào)道的結(jié)果相一致。Verleyen等[21]研究表明，脂質(zhì)模擬體系中α-生育酚在高溫煎炸(150～250℃)下發(fā)生熱氧化反應(yīng)生成α-TQ。一般情況下，同一溫度下，隨著加熱時(shí)間(一定范圍內(nèi))的延長(zhǎng)，TQ的含量逐漸升高，但溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致TQ含量降低?？梢?jiàn)，不同溫度下，α-TQ生成規(guī)律不一。

其次，油脂基質(zhì)中生育酚的初始含量也是影響TQ生成的因素之一。Rennick等[22]通過(guò)180℃加熱葵花籽油和大豆油發(fā)現(xiàn):未添加α-生育酚情況下，加熱葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至87 mg/kg和104 mg/kg，加熱大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至29 mg/kg和53 mg/kg；添加α-生育酚的情況下，加熱葵花籽油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至127 mg/kg和164 mg/kg，加熱大豆油5 h和10 h，α-TQ含量分別增加至159 mg/kg和187 mg/kg。可見(jiàn)，基底中生育酚含量越高，隨著生育酚的消耗，一定條件下TQ的生成量也就越多。

再次，氧化條件也對(duì)TQ的生成有較大影響。Kreps等[25]通過(guò)Rancimat加速氧化葵花籽油(180℃)發(fā)現(xiàn):通空氣加熱2 h后α-TQ的含量達(dá)到最大值150 mg/kg，但同時(shí)在加熱過(guò)程中因α-TQ不穩(wěn)定發(fā)生降解，加熱2～10 h其含量呈下降趨勢(shì)；而不通空氣情況下，α-TQ含量在整個(gè)加熱過(guò)程中呈逐漸增加的趨勢(shì)?？梢?jiàn)，加速氧化會(huì)加速TQ的生成。

最后，加熱方式也顯著影響TQ的生成規(guī)律。Kreps等[11]研究了微波加熱對(duì)TQ生成的影響，發(fā)現(xiàn)微波可加速TQ的生成，微波加熱菜籽油10 min即可生成 8 mg/kg的γ-TQ。另外，其研究了煎炸方式(淺表煎炸、深度煎炸)對(duì)煎炸油中TQ生成規(guī)律的影響，發(fā)現(xiàn)淺表煎炸產(chǎn)生的TQ顯著高于深度煎炸產(chǎn)生的量。同時(shí),對(duì)γ-TQ的空間分布情況研究發(fā)現(xiàn)，淺表煎炸50 min內(nèi)，菜籽油生成了22 mg/kg 的γ-TQ，其中5～7 mg/kg的γ-TQ轉(zhuǎn)移至煎炸食品薯?xiàng)l中，而深度煎炸50 min，菜籽油中僅產(chǎn)生了6 mg/kg的γ-TQ。

3 生育酚醌的毒性

TQ具有一定的毒性，但具有兩面性。Lindsey等[28]發(fā)現(xiàn)在生物體系內(nèi)(平滑肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)過(guò)程)脂質(zhì)過(guò)氧化中γ-TQ 具有高細(xì)胞毒性(細(xì)胞鋪滿(mǎn)培養(yǎng)階段，10～25 μmol/L；細(xì)胞增殖階段，1～10 μmol/L)，實(shí)驗(yàn)中觀(guān)察到可引起細(xì)胞的凋亡。在此研究結(jié)果基礎(chǔ)上，Thornton等[4]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ、δ-TQ均呈現(xiàn)一定的細(xì)胞(平滑肌細(xì)胞)毒性，誘發(fā)細(xì)胞有絲分裂，并呈劑量依賴(lài)性，且γ-TQ毒性更強(qiáng)。與此同時(shí)，γ-TQ對(duì)藥物敏感的急性淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(CEM)和多重耐藥淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞系(CEM/VLB100)也具有高細(xì)胞毒性，并推測(cè)γ-TQ毒性可能源于Michael加合物生成。Cornwell等[29]研究發(fā)現(xiàn)，α-TQ無(wú)細(xì)胞毒性，而γ-TQ、δ-TQ在CEM 和CEM/VLB100均具有高細(xì)胞毒性(LD50<10 μmol/L)，且γ-TQ、δ-TQ相較于阿霉素(一種抗腫瘤藥物)具有更高的細(xì)胞毒性，同樣對(duì)CEM細(xì)胞具有選擇性細(xì)胞毒性。γ-TQ、δ-TQ屬于親核烷基化試劑，可生成Michael加合物和醌甲基類(lèi)似物，烷基化反應(yīng)是親核醌類(lèi)物質(zhì)致毒性的原因所在。Jones等[30]研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ對(duì)損傷細(xì)胞膜、活細(xì)胞數(shù)量的減少和凋亡激活等表現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴(lài)性的影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，γ-TQ引起WiDr結(jié)腸腺癌細(xì)胞、HL-60白血病細(xì)胞和小鼠胸腺瘤細(xì)胞的凋亡主要源于其調(diào)控了參與凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)的不同蛋白的表達(dá)，如細(xì)胞色素C的釋放和凋亡Caspase復(fù)合體形成[31-32]。由于γ-TQ、δ-TQ屬于芳基化醌類(lèi)化合物，Wang 等[33]研究進(jìn)一步指出芳基化醌類(lèi)毒性機(jī)制主要源于Michael加合物生成和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，而非僅僅源于Michael加合物生成。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)TQ顯著抑制雄激素反應(yīng)性前列腺癌細(xì)胞增殖、雄激素受體活性和雄激素受體蛋白表達(dá)[34]。

因TQ對(duì)人急性淋巴母細(xì)胞白血病和早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞具有強(qiáng)大的細(xì)胞毒性作用和誘導(dǎo)凋亡、逃脫耐藥性的特點(diǎn)，在醫(yī)學(xué)腫瘤的治療方面賦予了其作為強(qiáng)效化療劑的潛力[32]，這也與醌類(lèi)物質(zhì)具有一定的抗癌、抗腫瘤活性相一致。

4 生育酚醌的抗氧化活性

近年來(lái)，隨著對(duì)醌類(lèi)物質(zhì)認(rèn)識(shí)和研究的深入，不少學(xué)者對(duì)醌類(lèi)物質(zhì)的抗氧化活性也進(jìn)行了相關(guān)研究[35-37]。現(xiàn)階段關(guān)于TQ的抗氧化活性有體內(nèi)和體外研究，主要集中于體外研究。Bindoli等[38]研究發(fā)現(xiàn)，α-TQ可抑制脂質(zhì)體中抗壞血酸/Fe2+誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化。Lindsey等[28]研究發(fā)現(xiàn)：在非生物模擬體系中，α-TQ的抗氧化活性與α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性差異不顯著，而γ-TQ則在低濃度(1～100 μmol/L)下表現(xiàn)出抗氧化活性，而在高濃度(1 000 μmol/L)則表現(xiàn)出促氧化作用；在生物體系內(nèi)(平滑肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)過(guò)程)脂質(zhì)過(guò)氧化中，α-TQ、α-生育酚、γ-生育酚的抗氧化活性也無(wú)顯著差異。Thornton等[4]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，模擬體系中α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均在低濃度(1～10 μmol/L)下表現(xiàn)出抗氧化活性，而在高濃度(10～1 000 μmol/L)則表現(xiàn)出促氧化作用，且同樣濃度下γ-TQ的促氧化作用強(qiáng)于α-TQ、δ-TQ。與此同時(shí)，在平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中低濃度(1～50 μmol/L)的α-TQ、γ-TQ、δ-TQ均為抗氧化劑。Siegel等[39]研究發(fā)現(xiàn)，醌氧化還原酶可在細(xì)胞中將α-TQ還原成氫醌(TQH2)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)α-TQ是一種有效的抗氧化劑，主要源于其可阻礙輔酶Q的電子轉(zhuǎn)移，此外，α-TQ也可被微粒體及線(xiàn)粒體中的酶還原生成TQH2，其抗氧化效果進(jìn)一步增強(qiáng)[40]。

為更為全面客觀(guān)地評(píng)價(jià)TQ的抗氧化活性，學(xué)者對(duì)TQ的體內(nèi)抗氧化模型進(jìn)行了研究。研究表明，α-TQ具有阿爾茨海默病(AD)的治療前景[41-42]。AD的病理變化與可溶性β-淀粉樣蛋白(Aβ)寡聚體、神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激有關(guān)。Yang[5]、Wang[43]等在前期體外研究發(fā)現(xiàn)α-TQ能夠抑制Aβ的聚集，減少Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了α-TQ的體內(nèi)作用，發(fā)現(xiàn)α-TQ可使可溶性Aβ寡聚體的水平明顯降低，抑制NF-κB信號(hào)通路活化，減少AD小鼠的炎癥病理反應(yīng)，降低AD小鼠的氧化應(yīng)激水平，進(jìn)而可有效阻遏阿爾茨海默病的產(chǎn)生與惡化。可見(jiàn)，TQ也具有一定的體內(nèi)抗氧化活性，值得進(jìn)一步挖掘開(kāi)發(fā)。

5 結(jié) 語(yǔ)

近年來(lái)，人們對(duì)生育酚的檢測(cè)及性質(zhì)做了廣泛的研究，但國(guó)內(nèi)對(duì)于TQ的研究尚未開(kāi)展系統(tǒng)性報(bào)道。TQ是一類(lèi)潛在的食品安全危害因子，但其又有一定的抗癌、抗氧化活性。有關(guān)TQ相關(guān)研究尚存在以下問(wèn)題：①目前各TQ單體的定量檢測(cè)存在一定的困難，主要源于標(biāo)準(zhǔn)品的缺失。雖然有市售的α-TQ，但其他單體物質(zhì)仍需要實(shí)驗(yàn)者自行合成再去定量，缺乏標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，也就缺乏了物質(zhì)定量的準(zhǔn)確性和統(tǒng)一性。因此，各TQ單體的制備需要進(jìn)一步規(guī)范化。②因油脂加工方法和油脂烹調(diào)方式多樣，生育酚向TQ轉(zhuǎn)化的規(guī)律需進(jìn)一步系統(tǒng)研究，包括油脂脫臭階段高溫下TQ的生成情況，煎炸油煎炸不同種類(lèi)食品(薯?xiàng)l、雞塊等)時(shí)，TQ的生成、遷移及空間分布情況等，以及抑制TQ在植物油脂中的生成量及向食品遷移量的方法。③各TQ單體的毒性等研究需進(jìn)一步擴(kuò)展，如采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)(如秀麗線(xiàn)蟲(chóng)模型或斑馬魚(yú)模型等)更為全面地研究TQ的毒性及其致毒的分子機(jī)制。

針對(duì)以上存在的問(wèn)題，關(guān)于TQ的后續(xù)研究應(yīng)主要集中于以下幾個(gè)方面：①注重TQ標(biāo)準(zhǔn)品的合成，建立標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，便于檢測(cè)方法的建立。注重檢測(cè)方法的實(shí)用與便利，積極探索建立TQ的檢測(cè)方法，以便科學(xué)定量食品中TQ含量。②系統(tǒng)研究TQ在特定食品加工過(guò)程中的含量變化，為科學(xué)控制TQ在食品加工及烹調(diào)過(guò)程中的生成及遷移奠定一定的理論基礎(chǔ)。③TQ的毒性需要進(jìn)一步研究，如對(duì)于正常細(xì)胞的致毒性需要研究論證,作為潛在的食品健康危害因子，需進(jìn)一步通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)佐證其毒性及其致毒分子機(jī)制。