姜黃素通過調(diào)控NLRP3炎癥小體抑制急性脊髓損傷后的炎癥反應

蘇嘯塵，王國強，李江波，姬 樂，李 萌，張銀剛，姬文晨*

(1西安交通大學第一附屬醫(yī)院骨科，西安 710061；2陜西省人民醫(yī)院骨科;*通訊作者,E-mail:jiwenchenbaoyan@163.com)

隨著社會的不斷發(fā)展，車禍及高處墜落傷等暴力因素所導致的創(chuàng)傷越來越多，一旦發(fā)生爆裂性脊柱骨折，往往伴有脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)，會造成嚴重的肢體功能障礙，對于患者遠期的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴重危害[1]。胸腰段是脊柱的一個特殊節(jié)段，占脊柱骨折的90%，容易發(fā)生骨折并造成SCI[2]。原發(fā)性損傷往往在損傷即刻發(fā)生，無法逆轉(zhuǎn)；繼發(fā)性損傷則是后續(xù)功能紊亂的重要原因，一般包括炎癥反應、過氧化反應、自由基和細胞通道破壞等一系列級聯(lián)反應，其中炎癥反應被認為是重中之重，早期抑制炎癥反應對于SCI后期功能的恢復至關重要[3-5]。姜黃素治療SCI在既往研究中已經(jīng)被證實具有積極的意義，具備抗氧化、抗炎癥的作用[6-8]，但其抗炎的具體機制是什么，是否與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關，尚未見相關報道?；诖耍菊n題擬采用姜黃素治療大鼠急性損傷，探討其在調(diào)控NLRP3炎癥小體中的作用，為臨床治療SCI提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗采用2月齡雌性SD大鼠，均為清潔級，體質(zhì)量200～220 g。動物由西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(陜)12-018。本研究經(jīng)西安交通大學醫(yī)學部倫理委員會批準，批準文號：2022-117。

1.2 主要儀器與試劑

IL-1β試劑盒(Abcam公司，美國)，IL-6試劑盒(Abcam公司，美國)，NLRP3(Abcam公司，美國)，Caspase-1(Abcam公司，美國)，ASC(Abcam公司，美國)，蘇木精染色液(西安三浦化學試劑有限公司，中國)，伊紅染色液(武漢博士德生物工程有限公司，中國)，石蠟切片機(Leica公司，德國)。

1.3 脊髓損傷模型的建立與實驗分組

按照課題組前期方法制作脊髓損傷動物模型[9,10]。根據(jù)后續(xù)實驗要求，每組需存活10只大鼠，為防止術中和術后意外死亡，每組初始各使用15只大鼠。將大鼠隨機分為3組，每組15只。對照組打開椎板，不做任何處理；脊髓損傷組打擊造模成功，不做任何處理；姜黃素組打擊造模成功后，經(jīng)腹腔注射姜黃素(100 mg/kg)，連續(xù)7 d。

術前禁食6 h后，以10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后備皮消毒，以T10為中心行背部正中切口，長約2.5 cm，逐層分離肌肉及組織，充分暴露T9～T11節(jié)段，生理鹽水沖洗止血，咬骨鉗去除T10棘突及椎板，保留硬膜完整，充分暴露T10脊髓后，假手術組直接逐層縫合切口，其他兩組則使用擊打器擊打T10，打擊能量60 cm·g，若觀察到損傷局部迅速出現(xiàn)充血水腫，雙后肢抽搐，尾巴擺動，則造模成功。

1.4 BBB評分

術后1，2，4周進行BBB評分，評估大鼠后肢功能的恢復，分數(shù)越高說明功能恢復越好[11]。

1.5 HE染色觀察炎性細胞浸潤情況

術后4周，各組取3只大鼠，心臟灌注后，進行如下操作：脊髓損傷組和姜黃素組，以打擊點為中心取脊髓組織2 cm，對照組取相同平面的正常脊髓組織2 cm，采用4%的多聚甲醛固定，制作蠟塊后常規(guī)切片(厚度為5 μm)，完成HE染色。

1.6 ELISA檢測組織炎癥因子IL-1β和IL-6

術后4周，各組取3只SD大鼠,切取包括脊髓損傷處上下各2 cm的組織，用PBS在冰上勻漿，4 ℃，10 000 r/min離心30 min，隨后收集上清液進行ELISA。按照ELISA試劑盒說明書檢測IL-1β和IL-6。

1.7 Western blot檢測NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達

術后4周，各組取4只SD大鼠,切除包括脊髓損傷處上下各2 cm的脊髓組織，進行如下操作：RIPA裂解液提取脊髓總蛋白后進行定量，取各組等量(50 μg)總蛋白在SDS-PAGE上電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上后5%去脂奶粉封閉3 h，一抗NLRP3(1 ∶1 000稀釋)、Caspase-1(1 ∶1 000稀釋)和ASC(1 ∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，按1 ∶2 000稀釋辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗孵育，曝光洗片后，用Image Lab 8.0軟件檢測蛋白的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 術后各組大鼠死亡率

對照組和脊髓損傷組各1只麻醉意外，脊髓損傷組1只泌尿系感染死亡，姜黃素組腹腔注射姜黃素后腹膜炎2只死亡(見表1)。由于術后護理得當，給予補液，補充能量，抗感染治療，并輔助排便，護理泌尿系等措施，大鼠整體死亡率較低。后續(xù)實驗每組需要10只SD大鼠，對照組、脊髓損傷組和姜黃素組大鼠剩余數(shù)量多于10只，故采用隨機挑選法，從各組剩余大鼠內(nèi)挑選10只進行實驗。

表1 術后各組SD大鼠死亡率

2.2 BBB評分

術后1周和2周，脊髓損傷組和姜黃素組大鼠后肢功能BBB評分差異無統(tǒng)計學意義；術后4周，姜黃素組BBB評分高于脊髓損傷組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。術后各個時間點對照組BBB評分無統(tǒng)計學差異，但脊髓損傷組和姜黃素組大鼠后肢功能BBB評分顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖1)。

與對照組相比，#P<0.05；與脊髓損傷組相比，*P<0.05圖1 不同組大鼠術后4周內(nèi)的運動功能評分Figure 1 BBB scores of rats within 4 weeks after operation in different groups

2.3 HE染色

術后4周，對照組脊髓組織形態(tài)正常，可見大量形態(tài)規(guī)則的神經(jīng)元，而脊髓損傷組和姜黃素組脊髓形態(tài)紊亂，可見炎癥細胞浸潤，而且脊髓損傷組的炎癥細胞數(shù)量多于姜黃素組(圖2)。

圖2 術后4周各組脊髓組織HE染色 (×200)Figure 2 HE staining of spinal cord tissue at 4 week after operation in each group (×200)

2.4 ELISA檢測IL-1β和IL-6表達

術后4周，與對照組相比，脊髓損傷組和姜黃素組的炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-6表達明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與脊髓損傷組相比，姜黃素組炎癥介質(zhì)IL-1β和IL-6表達明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖3)。

與對照組相比，*P<0.05；與脊髓損傷組相比，#P<0.05圖3 術后4周各組脊髓組織炎癥介質(zhì)的表達Figure 3 Expression of inflammatory mediators in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

2.5 Western blot檢測NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達

術后4周，Western blot檢測各組蛋白的表達，結(jié)果顯示：與對照組比較，脊髓損傷組和姜黃素組的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達增高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與脊髓損傷組比較，姜黃素組的NLRP3，ASC和Caspase-1蛋白的表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見圖4)。

與對照組相比，*P<0.05；與脊髓損傷組相比，#P<0.05圖4 術后4周各組脊髓組織中蛋白的表達Figure 4 Protein expression in spinal cord tissue at 4 week after operation in each group

3 討論

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)作為脊柱骨折最嚴重的并發(fā)癥之一，致殘性高，治愈率低，如果損傷平面涉及上頸椎，部分患者在損傷后短時間內(nèi)死亡，給社會和家庭造成嚴重的經(jīng)濟負擔[12]。目前，臨床治療SCI主要有以下幾種方法：手術治療主要機制是減除骨塊對神經(jīng)的壓迫，恢復脊柱穩(wěn)定性，防止進一步損傷；保守治療通常使用營養(yǎng)神經(jīng)藥物甲鈷胺，血管活性藥物前列地爾，以及類固醇激素甲強龍改善局部微環(huán)境；康復治療，通過理療、針灸、電刺激等方法促進肢體功能恢復[13-15]。然而，上述方法對于SCI的治療雖然有一定效果，但離理想狀態(tài)還相差甚遠，所以深入研究SCI的病理學機制，盡早給予干預，防止繼發(fā)性損傷顯得尤為重要。

炎癥反應被認為是SCI微環(huán)境紊亂的重要原因，減輕炎癥反應對于抑制細胞凋亡、維持神經(jīng)元的存活有著重要意義[16]。有研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在SCI后的炎癥反應中起著重要作用，SCI可以促進NLRP3、pro-Caspase-1及ASC蛋白的轉(zhuǎn)錄并發(fā)生寡聚化，組成為成熟的NLRP3-ASC-pro-Caspase-1蛋白復合體，即NLRP3炎癥小體，進而促進炎癥因子的釋放，最終導致神經(jīng)功能繼發(fā)性損傷，所以，抑制NLRP3炎癥小體的活化對于SCI的治療至關重要[17,18]。姜黃素是姜黃植物根莖的提取物，既往應用姜黃素治療SCI取得了一定的成果[19,20]。郝琴等[21,22]認為姜黃素可以促進SCI大鼠后肢功能的恢復，最佳腹腔注射計量為100 mg/kg，主要是通過抑制細胞凋亡和減輕炎癥反應來提高神經(jīng)功能。然而，姜黃素抑制炎癥反應及發(fā)揮抗凋亡作用是否與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關尚未見相關報道。

為了解決這一問題及進一步探討SCI的修復機制，我們設計完成此次課題，參照既往研究結(jié)果將姜黃素的給藥濃度定為100 mg/kg，給藥時間為術后連續(xù)7 d。術后4周，姜黃素組BBB評分高于脊髓損傷組，但低于對照組，這表明姜黃素組可提高SCI后動物肢體的運動能力，是一種有效治療SCI的方法，但距離正常大鼠仍然差距較遠。術后4周，相于對照組，姜黃素組的脊髓形態(tài)紊亂，炎癥細胞浸潤較多，炎癥介質(zhì)IL-1β、IL-6升高，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達增高，但相對于脊髓損傷組，姜黃素組炎癥細胞浸潤減少，炎癥介質(zhì)表達降低，NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達降低，這就說明姜黃素可以顯著抑制SCI后的炎癥反應，且與調(diào)控NLRP3小體有著重要關系，因為炎癥介質(zhì)的降低與NLRP3相關蛋白的降低呈正相關。

與此同時，本課題研究中也發(fā)現(xiàn)一些問題，首先是姜黃素溶解后通過腹腔注射會導致一部分大鼠死亡，通過解剖認為腹膜炎是其死亡的重要原因，所以改進姜黃素的使用方法是未來研究的方向之一，尤其近年來納米載體的逐步興起，為后續(xù)研究帶來新的思路，是否可以采用納米載體攜帶姜黃素通過尾靜脈注射，從而提高藥物的起效濃度，值得進一步研究。其次是本實驗在HE染色結(jié)果觀察炎性細胞浸潤時，只是宏觀地進行了判斷，只能初步確定腹腔注射姜黃素可以抑制脊髓損傷后的炎癥反應，后續(xù)研究我們會對其進行定量計數(shù)，來深入探究其抑制炎癥的具體機制并推進實驗其他部分的進展。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)姜黃素可能通過抑制脊髓損傷后的炎癥反應，促進大鼠后肢功能的恢復，探討其可能的作用機制，發(fā)現(xiàn)可能與調(diào)控NLRP3炎癥小體有關，這一結(jié)果對于后期進一步研究SCI的修復機制有著重要意義。