喜馬紅景天葉綠體基因組特征及其系統(tǒng)發(fā)育分析

張 雨 蘇 旭，3 劉玉萍* 劉 濤 鄭長(zhǎng)遠(yuǎn) 蘇丹丹 王亞男 呂 婷

（1. 青海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西寧 810008；2. 青海師范大學(xué)青海省青藏高原藥用動(dòng)植物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810008；3. 青海師范大學(xué)高原科學(xué)與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810016）

葉綠體是存在于所有綠色植物和某些自養(yǎng)生物細(xì)胞中的一種重要細(xì)胞器，也是它們進(jìn)行光合作用的重要場(chǎng)所，具有合成多種蛋白質(zhì)、淀粉等功能。葉綠體基因組是葉綠體內(nèi)帶有遺傳信息的一套DNA序列，葉綠體基因組一般較小，大小介于120～180 kb。研究認(rèn)為，絕大多數(shù)陸生植物的葉綠體基因組非常保守，為共價(jià)閉合的四分體結(jié)構(gòu)，即包括2 個(gè)反向的重復(fù)區(qū)域（Inverted re?peats，IRa/IRb）、1 個(gè)短單拷貝區(qū)域（small single copy，SSC）和1 個(gè)長(zhǎng)單拷貝區(qū)域（large single copy，LSC）4 個(gè)部分。葉綠體基因組在研究系統(tǒng)發(fā)育、遺傳多樣性、物種形成機(jī)制等方面具有重要作用。隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，植物葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)得以迅速擴(kuò)大。近年來(lái)，諸多藥用植物的葉綠體基因組已被完成測(cè)序和數(shù)據(jù)分析，取得了較好的研究成效，如通過(guò)對(duì)姜黃（）、天目地黃（）、刺蒼耳（）和牛蒡（）等多種植物葉綠體基因組研究，解析了它們的葉綠體基因組特征和密碼子偏好性，確定了各自的系統(tǒng)位置及其與近緣物種的親緣關(guān)系；同時(shí)，先前學(xué)者對(duì)多種紅景天屬（）植物如紅景天（）、狹葉紅景天（.）等的葉綠體基因組特征及其物種系統(tǒng)發(fā)育分析關(guān)系也作了探討，但這些研究?jī)H涉及葉綠體基因特征及物種系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并未對(duì)其進(jìn)行全面深層次的探討。

紅景天屬是景天科（Crassulaceae）中一類(lèi)多年生草本或亞灌木植物，中國(guó)分布有73 種、7 變種，青藏高原有32種、2變種。大部分紅景天屬植物在我國(guó)被作為藥用植物，《本草綱目》和《晶珠本草》對(duì)其均有記錄?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究顯示，紅景天屬多種植物的提取物具有重要的藥用成分和藥理作用。譬如，關(guān)偉等研究發(fā)現(xiàn)高山紅景天提取物——紅景天苷具有良好的抗抑郁作用。尤為重要的是，喜馬紅景天（）是紅景天屬的一種重要多年生藥用植物，主要分布于我國(guó)青海、西藏、云南和四川西部等地，是青藏高原的一個(gè)高山特有種；喜馬紅景天通常生長(zhǎng)于海拔3 500～5 000 m 的山坡、林下、灌叢中。喜馬紅景天全草入藥，具有治療咳血、咯血、婦女白帶等功效。迄今，國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者喜馬紅景天的研究主要集中于其化學(xué)成分鑒定、藥理作用和遺傳多樣性等方面，然而關(guān)于喜馬紅景天葉綠體基因組的系統(tǒng)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。據(jù)此，本研究以喜馬紅景天為試驗(yàn)材料，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)喜馬紅景天的葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)其進(jìn)行密碼子偏好性、SSR 位點(diǎn)、IR 區(qū)邊界收縮和擴(kuò)張及系統(tǒng)親緣關(guān)系等多種分析，為今后喜馬紅景天群體遺傳多樣性、種群歷史動(dòng)態(tài)乃至景天科植物系統(tǒng)發(fā)育與親緣關(guān)系研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

喜馬紅景天新鮮葉片采自青海省海西州德令哈市蓄集鄉(xiāng)（37°49′11″N，97°23′8″E，海拔4 345 m），獲取葉片后立刻放于變色硅膠中儲(chǔ)存，憑證標(biāo)本存于中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所青藏高原生物標(biāo)本館（HNWP）。

1.2基因組DNA提取和測(cè)序

利用改良的CTAB 法獲取喜馬紅景天葉片中的基因組DNA；采用1%瓊脂糖凝膠電泳分析DNA 完整性、Nanodrop 檢測(cè)DNA 純度（OD）和濃度，然后對(duì)基因組DNA進(jìn)行純化，直至DNA樣品檢測(cè)合格；應(yīng)用Covaris 超聲波破碎儀隨機(jī)打斷純化后的DNA，使其形成小片段，經(jīng)序列末端修復(fù)、加A尾、加測(cè)序接頭、純化、PCR擴(kuò)增等多步操作完成文庫(kù)的制備；文庫(kù)質(zhì)檢后，使用Illumina高通量測(cè)序平臺(tái)NovaSeq 6000對(duì)葉綠體基因組進(jìn)行測(cè)序。

1.3葉綠體基因組組裝和注釋

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載紅景天葉綠體基因組序列（GenBank 登錄號(hào)：MH410216.1）作為參考序列，應(yīng)用NOVOplasty軟件對(duì)喜馬紅景天葉綠體基因組進(jìn)行組裝，采用默認(rèn)參數(shù)；然后利用PGA（Plas?tid Genome Annotator）軟件對(duì)葉綠體基因組注釋?zhuān)J(rèn)參數(shù)；注釋完成后，采用Chloroplot 軟件繪制喜馬紅景天葉綠體基因組圖譜。

1.4密碼子偏好性和簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

運(yùn)用CodonW1.4.2 軟件統(tǒng)計(jì)分析喜馬紅景天葉綠體基因組密碼子的偏好性RSCU（relative synonymous codon usage）；采用網(wǎng)站在線(xiàn)工具（https：//webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php？action=1）對(duì)喜馬紅景天葉綠體基因組序列簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs）分析，其中單核苷酸的設(shè)置為10、二核苷酸為6、三、四、五和六核苷酸最小重復(fù)數(shù)都為5。

1.5 IR區(qū)邊界收縮和擴(kuò)張分析

IR 區(qū)的收縮和擴(kuò)張會(huì)造成葉綠體基因組長(zhǎng)度的變化。為此，選取喜馬紅景天的5個(gè)近緣種圣地紅景天（.）、四輪紅景天（.）、狹葉紅景天、背藥紅景天（.）和大花紅景天（.），利用IRscope（http：//irscope.shinyapps.io/irapp/）分析其IR 區(qū)的收縮和擴(kuò)張情況，繪制對(duì)比圖。

1.6系統(tǒng)發(fā)育分析

以薔薇科（Rosaceae）中歐李（，MN259192.1）作為外類(lèi)群，對(duì)喜馬紅景天及其18 個(gè)近緣種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。首先，利用Phylo?Suite 軟件包中的MAFFT將所有物種的葉綠體基因組序列進(jìn)行比對(duì)并校正；然后，應(yīng)用PhyloSu?ite 軟件包中的IQ tree進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，bootstrap值設(shè)為5 000。

1.7單核苷酸多態(tài)性分析

采 用 在 線(xiàn) 工 具OGDRAW（http：//ogdraw.mpimp-golm.mgp.de/cgi-bin/ogdraw.pl）對(duì)喜馬紅景天及其18個(gè)近緣種的葉綠體基因組進(jìn)行四分區(qū)域注釋并提取序列，然后利用MAFFT 軟件對(duì)它們進(jìn)行多重序列比對(duì)，最后使用DnaSP 軟件對(duì)序列特征和SNP進(jìn)行篩選。

2 結(jié)果與分析

2.1葉綠體基因組基本特征

喜馬紅景天葉綠體基因組全長(zhǎng)為151 074 bp，呈現(xiàn)典型的四分結(jié)構(gòu)，其中包括1個(gè)長(zhǎng)度為82 309 bp的長(zhǎng)單拷貝區(qū)、1 個(gè)長(zhǎng)度為17 017 bp 的短單拷貝區(qū)和1對(duì)長(zhǎng)度為25 874 bp的互補(bǔ)重復(fù)區(qū)（見(jiàn)圖1）。喜馬紅景天葉綠體基因組GC 含量為37.8%；長(zhǎng)單拷貝區(qū)、短單拷貝區(qū)和互補(bǔ)重復(fù)區(qū)的GC 含量分別為35.7%、31.8%、42.9%（見(jiàn)表1）。喜馬紅景天葉綠體基因組編碼130 個(gè)基因，包括編碼蛋白基因、編碼tRNA 基因和編碼rRNA 基因，其數(shù)量分別為86、37、7 個(gè)（見(jiàn)表2）。因基因功能的不同，喜馬紅景天葉綠體基因組可分為有關(guān)基因表達(dá)（75 個(gè)）、光合作用（46 個(gè)）、開(kāi)放閱讀和其他編碼蛋白（4個(gè)），以及未知功能（5個(gè)）的幾大類(lèi)基因。

圖1 喜馬紅景天葉綠體基因組環(huán)形圖譜圖的中心包括物種名稱(chēng)和有關(guān)基因組的特定信息（長(zhǎng)度和基因數(shù)量）；圓圈內(nèi)外的基因分別以順時(shí)針和逆時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄；彩色代表編碼不同功能組的基因；基因名稱(chēng)與其密碼子使用偏好被標(biāo)記在最外層Fig.1 Circularized map of the chloroplast genome of R.himalensisThe species name and specific information regarding the genome（length and the number of genes）are depicted in the center of the plot；Genes on the outside and inside of the circle are transcribed in clockwise and counterclockwise directions，respectively；Genes belonging to different function?al groups are color coded；The gene names and their optional codon usage bias are labeled on the outermost layer；The SSC，LSC and inverted repeat region（sIRA and IRB）are indicated

表1 喜馬紅景天葉綠體基因組堿基組成Table 1 Base composition of the chloroplast genome in R.himalensis

表2 喜馬紅景天葉綠體基因組注釋信息Table 2 Gene annotation of the chloroplast genome of R.himalensis

2.2密碼子偏好性

從喜馬紅景天葉綠體基因組中共獲得87 條CDS（coding DNA sequence）序列。為了保證研究結(jié)果的科學(xué)性，去除了葉綠體基因組長(zhǎng)度小于200 bp 的CDS 序列，選用71 條CDS 序列用于密碼子的偏好性分析。研究表明，喜馬紅景天葉綠體基因組共檢測(cè)出25 513 個(gè)密碼子，其中編碼亮氨酸（Leu）的密碼子數(shù)量最多，為2 721 個(gè)，占總密碼子數(shù)的10.67%（見(jiàn)表3）。相對(duì)同義密碼子（RS?CU）大于1 的有30個(gè)密碼子，僅1 個(gè)密碼子的堿基以G結(jié)尾，其余密碼子均以A/U結(jié)尾（見(jiàn)圖2）。

圖2 喜馬紅景天各氨基酸的RSCU分析Fig.2 RSCU analysis of each amino acid in R.himalensis

表3 喜馬紅景天各氨基酸相對(duì)同義密碼子使用度Table 3 RSCU analysis of protein coding region in R.himalensis

2.3簡(jiǎn)單重復(fù)序列分析

研究結(jié)果表明，喜馬紅景天葉綠體基因組僅包含單核苷酸和二核苷酸2 種不同類(lèi)型共44 個(gè)SSRs（見(jiàn)表4）。其中，單核苷酸重復(fù)序列最多，共40 個(gè)，有A（19 SSRs）和T（21 SSRs）2 種重復(fù)類(lèi)型；二核苷酸重復(fù)序列僅有4 個(gè)，包括AT（1 SSRs）和TA（3 SSRs）2 種重復(fù)類(lèi)型（見(jiàn)表4）。在44 個(gè)SSRs中，有14 個(gè)SSRs 位于基因的編碼區(qū)（coding se?quence，CDS）；有30個(gè)SSRs位于基因的非編碼區(qū)，其中8 個(gè)SSRs 位于基因的內(nèi)含子（intron）區(qū)域，22個(gè)SSRs 位于基因間隔區(qū)（intergenic spacer，IGS）（見(jiàn)表5）。

表4 喜馬紅景天葉綠體基因組簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）信息Table 4 The number of SSRs identified in the chloro‐plast genome of R.himalensis

表5 喜馬紅景天葉綠體基因組SSR信息Table 5 SSR information of the chloroplast genome in R.himalensis

2.4 IR 區(qū)收縮與擴(kuò)張分析

葉綠體基因組的IR區(qū)域具有收縮和擴(kuò)張的特點(diǎn)，會(huì)引起葉綠體基因組長(zhǎng)度的變化。本研究通過(guò)對(duì)喜馬紅景天與其5 個(gè)近緣種葉綠體基因組邊界的比較，發(fā)現(xiàn)紅景天屬6種植物具有大致相似的基因組成和結(jié)構(gòu)，即都有4 個(gè)基因位于IR 區(qū)邊界處，分別是LSC/IRb 的、IRb/SSC 的、SSC/IRa的和IRa/LSC 的（見(jiàn)圖3）。然而，紅景天屬6 種植物在基因組長(zhǎng)度、和基因缺失以及基因收縮等特征上存在差異，如喜馬紅景天與大花紅景天基因組長(zhǎng)度相差693 bp，喜馬紅景天IRa 和IRb 區(qū)存在和基因缺失以及LSC 區(qū)具有基因收縮，而喜馬紅景天的5個(gè)近緣種IRb 區(qū)僅存在基因的收縮和擴(kuò)張（見(jiàn)圖3）。

圖3 紅景天屬6種植物的葉綠體基因組IR區(qū)邊界分析Fig.3 Boundary analysis of IR regions of chloroplast genomes from six Rhodiola plants

2.5系統(tǒng)進(jìn)化分析

以歐李為外類(lèi)群，基于景天科19 個(gè)物種葉綠體基因組構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，景天科19 個(gè)物種構(gòu)成一個(gè)單系類(lèi)群，靴帶支持率（bootstrap）高達(dá)100%（見(jiàn)圖4）；同時(shí)，單系類(lèi)群形成具有高支持率（100%）的兩大分支（Clade 1 和Clade 2），其中Clade 1 由凹葉景天（）佛甲草（.）、大唐米（.）、長(zhǎng)葉瓦蓮（）、喜馬紅景天、圣地紅景天、狹葉紅景天、長(zhǎng)鞭紅景天（）、云南紅景天（）、紅景天、矮生紅景天（.）、四輪紅景天、紅花紅景天（.）、異鱗紅景天（.）、圓葉八寶（）、晚紅瓦松（）和石蓮（）17 個(gè)物種構(gòu)成，Clade 2 由褐斑伽藍(lán)（）和大葉落地生根（）2個(gè)物種組成（見(jiàn)圖4）；研究結(jié)果顯示，喜馬紅景天位于分支1內(nèi)，其與圣地紅景天親緣關(guān)系最近（見(jiàn)圖4）。

圖4 基于20個(gè)葉綠體基因組數(shù)據(jù)構(gòu)建的景天科物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)“★”代表分支節(jié)點(diǎn)的靴帶支持率為100%Fig.4 Phylogenetic tree of crassulaceae species constructed based on 20 chloroplast genome data“★”represents the bootstrap support rate of 100%on the branch

2.6單核苷酸多態(tài)性（SNP）分析

葉綠體基因組SNP 分子標(biāo)記因密度高、鑒別力強(qiáng)和便于分析等特點(diǎn)，在植物種質(zhì)資源精準(zhǔn)鑒定中具有重要作用。研究結(jié)果表明，喜馬紅景天及其18個(gè)近緣種葉綠體基因組四分區(qū)域SNP位點(diǎn)相對(duì)較多。其中，LSC 區(qū)域長(zhǎng)度為80 962～83 252 bp，存在11 303 個(gè)SNP 位點(diǎn)；SSC 區(qū)域長(zhǎng)度為16 630～17 054 bp，存在3 380 個(gè)SNP 位點(diǎn)；IR 區(qū)域長(zhǎng)度為25 427～25 811 bp，存在873個(gè)SNP位點(diǎn)；SSC區(qū)域變異頻率最高（見(jiàn)表6）。

表6 喜馬紅景天及其18 個(gè)近緣種葉綠體基因組四分區(qū)域SNP位點(diǎn)數(shù)量Table 6 The number of SNP loci in the four regions of chloroplast genome in R. himalensis and its 18 related species

3 討論

葉綠體是高等綠色植物最重要的細(xì)胞器之一，也是光合作用的場(chǎng)所，擁有獨(dú)立完整的基因組，絕大多數(shù)植物為單親遺傳。先前研究表明，葉綠體基因組已被廣泛用于植物分類(lèi)修訂、群體遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性、種群動(dòng)態(tài)歷史和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等諸多研究領(lǐng)域。近年來(lái)，葉綠體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)逐步完善，尤其在藥用植物葉綠體基因組測(cè)序方面取得長(zhǎng)足的進(jìn)展。譬如，張慧等基于高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)益母草（）葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序、組裝和注釋?zhuān)@得完整的葉綠體基因組序列，同時(shí)認(rèn)為益母草與水蘇屬（）植物親緣關(guān)系較近；Zhou等通過(guò)對(duì)大黃屬（）多種植物葉綠體基因組的研究，開(kāi)發(fā)了大黃屬植物的超級(jí)DNA 條形碼。研究表明，植物葉綠體基因組具有強(qiáng)大的物種鑒別能力，尤其用于親緣關(guān)系較近的類(lèi)群界定方面效果明顯，因此測(cè)序并研究更多的藥用植物葉綠體基因組顯得十分必要。據(jù)此，我們對(duì)喜馬紅景天葉綠體基因組進(jìn)行了測(cè)序。

喜馬紅景天葉綠體基因組長(zhǎng)度為151 074 bp，其長(zhǎng)度符合被子植物葉綠體基因組長(zhǎng)度范圍，并且同報(bào)道過(guò)的其他被子植物葉綠體基因組結(jié)構(gòu)相吻合，為四分體結(jié)構(gòu)GC 含量37.8%。喜馬紅景天葉綠體基因組在基因種類(lèi)和結(jié)構(gòu)上與絕大多數(shù)景天科植物的葉綠體基因組基本一致。密碼子偏好性可以反映基因乃至物種的起源和進(jìn)化方式，并且能夠?qū)蚬δ芗捌渚幋a蛋白的表達(dá)具有影響。通過(guò)對(duì)喜馬紅景天葉綠體基因組密碼子偏好性的分析，本研究發(fā)現(xiàn)喜馬紅景天大于1的相對(duì)同義密碼子有30 個(gè)，僅1 個(gè)密碼子的堿基以G結(jié)尾，其余所有密碼子均以A/U 結(jié)尾，具有明顯的AU 偏向性，我們認(rèn)為這可能是由于核苷酸突變和回復(fù)突變導(dǎo)致的。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSRs）是葉綠體基因組中一段長(zhǎng)度為1～6 bp的重復(fù)序列，具有含量豐富、多態(tài)性高和單親遺傳等優(yōu)點(diǎn)，常被用于植物物種鑒定、種群系統(tǒng)進(jìn)化、遺傳圖譜構(gòu)建和種質(zhì)資源遺傳多樣性研究等領(lǐng)域。本研究結(jié)果顯示，喜馬紅景天葉綠體基因組共檢測(cè)到40 個(gè)單核苷酸、4 個(gè)二核苷酸SSRs。其中，二核苷酸SSRs 的重復(fù)單元以AT/TA 為主，其SSRs 序列組成與先前報(bào)道的被子植物相一致，從而證實(shí)了SSRs 主要由短的poly A和poly T構(gòu)成的這個(gè)觀(guān)點(diǎn)；尤其是本研究檢測(cè)到的SSRs 序列可為今后紅景天屬藥用植物分子遺傳學(xué)研究提供候選的分子標(biāo)記。葉綠體基因組存在IR 區(qū)域擴(kuò)張與收縮的特點(diǎn)，這是一種進(jìn)化上的常見(jiàn)現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天屬多數(shù)植物葉綠體基因組的IRb/SSC 邊界位于基因和基因的重疊區(qū)，并且這2個(gè)基因具有不同程度的收縮與擴(kuò)張；但喜馬紅景天葉綠體基因組的IRb/SSC邊界無(wú)基因重疊，具有基因丟失現(xiàn)象，IRa 區(qū)基因丟失，LSC 區(qū)基因存在收縮現(xiàn)象，因此本研究認(rèn)為紅景天屬植物L(fēng)SC/IRb、IRb/SSC、SSC/IRa 和IRa/LSC 的邊界變化是IR 區(qū)擴(kuò)張與收縮的主要原因。

紅景天屬植物是傳統(tǒng)的中藥材，屬內(nèi)物種數(shù)量較多，尤其不同種間以及同種不同個(gè)體間具有復(fù)雜的形態(tài)變異，從而導(dǎo)致物種鑒定及系統(tǒng)發(fā)育存在較多爭(zhēng)議。先前學(xué)者研究指出，完整的葉綠體基因組用途廣泛，最大的用途即可作為超級(jí)DNA 條形碼應(yīng)用于植物物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系判定。本文基于葉綠體基因組序列通過(guò)對(duì)景天科19 個(gè)物種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建、四分區(qū)域注釋和SNP 分析，發(fā)現(xiàn)景天科植物是一個(gè)單系類(lèi)群且靴帶支持率高達(dá)100%，喜馬紅景天與圣地紅景天親緣關(guān)系較近；SSC 區(qū)域SNP 變異頻率最高。總之，我們認(rèn)為利用葉綠體基因組數(shù)據(jù)，不僅能夠確定喜馬紅景天的系統(tǒng)位置，闡明喜馬紅景天的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為今后景天科植物系統(tǒng)發(fā)育分析提供理論依據(jù)，而且運(yùn)用葉綠體基因組SNP 位點(diǎn)結(jié)合高分辨率熔解曲線(xiàn)、數(shù)字PCR 等分析技術(shù)，可以建立精準(zhǔn)的植物鑒別和檢測(cè)技術(shù)。