劉 洋,劉 琦,田雨露,董滿(mǎn)宇,徐 霞,關(guān)夢(mèng)茜,江 源,*

1 中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100875 2 北京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)部, 北京 100875

城市工業(yè)和生活廢水的排放,使得大量含氮、磷物質(zhì)進(jìn)入河流,導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化,造成河流的嚴(yán)重污染和水生生態(tài)系統(tǒng)的退化[1]。浮游細(xì)菌作為水體環(huán)境中元素循環(huán)和能量流動(dòng)的主要承擔(dān)者,在生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[2—5]。河流中的浮游細(xì)菌與水環(huán)境具有較為復(fù)雜的相互作用,其群落多樣性的變化能敏感地反映出水體環(huán)境的變化[6—7]。有研究表明,人類(lèi)活動(dòng)產(chǎn)生的外源性營(yíng)養(yǎng)輸入會(huì)對(duì)水體浮游微生物群落產(chǎn)生顯著影響[8]。由于居民的生活用水等通常來(lái)自于周邊河流,水體中致病微生物的種類(lèi)和來(lái)源也與公共衛(wèi)生問(wèn)題密切相關(guān)[9]。研究水體浮游細(xì)菌群落特征隨水環(huán)境的變化將有助于深入揭示人類(lèi)活動(dòng)對(duì)水生態(tài)的影響特征。

然而,以往有關(guān)的研究多集中于季節(jié)、水體理化指標(biāo)、營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)等對(duì)浮游細(xì)菌群落的影響方面,通常并未考慮河岸帶土地利用因素的影響作用。河岸帶的土地利用結(jié)構(gòu)和組成,對(duì)水體環(huán)境中的營(yíng)養(yǎng)鹽濃度以及水文過(guò)程等均會(huì)產(chǎn)生深刻影響,進(jìn)而影響到河流浮游微生物的群落結(jié)構(gòu)[10—11]。河岸帶范圍內(nèi)較高精度的土地利用空間數(shù)據(jù)可以借助遙感技術(shù)獲得,通過(guò)將之整合進(jìn)水環(huán)境因素對(duì)浮游細(xì)菌群落影響的分析之中,有助于辨明河岸帶土地利用組成結(jié)構(gòu)與水環(huán)境以及浮游細(xì)菌群落間的關(guān)系,進(jìn)而為解決水污染及其導(dǎo)致的環(huán)境問(wèn)題,例如水華等提供新的研究視角和研究方法。

本文中的案例研究區(qū)位于灤河中、上游一帶,其匯入的潘家口水庫(kù)和大黑汀水庫(kù)是“引灤入津”工程的重要水源地。水體浮游細(xì)菌群落與水質(zhì)的關(guān)系,將直接反映“引灤入津”工程中的水資源質(zhì)量,也關(guān)聯(lián)著天津市民的飲水安全。通過(guò)研究河岸帶土地利用和水環(huán)境因子以及與河流浮游微生物群落多樣性間的關(guān)系,明確水環(huán)境對(duì)浮游微生物群落的影響,揭示河岸帶土地利用變化的水生態(tài)效應(yīng),將有助于加深對(duì)河流生態(tài)系統(tǒng)的了解,并為灤河流域的土地利用結(jié)構(gòu)優(yōu)化和河流生態(tài)健康保護(hù)提供案例參考和科學(xué)支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)域概況

研究區(qū)位于華北平原東北部的灤河流域中上游區(qū)域(115°32′—118°53′E, 40°11′—42°45′N(xiāo)),總面積3.6×104km2。灤河發(fā)源于內(nèi)蒙古和河北的壩上高原,干流迂回曲折,全長(zhǎng)約620 km,水系發(fā)達(dá),支流眾多,自西北向東南流經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)和河北省的多個(gè)縣、旗、區(qū),其中上游諸支流匯入灤河干流后,于河北省遷西縣流入潘家口水庫(kù)和大黑汀水庫(kù),年平均徑流量13.3×108m3[12—13]。研究區(qū)地處典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候區(qū),多年平均氣溫6.1℃；月平均氣溫7月最高(21.9℃),1月最低(-12.0℃)。年平均降水量444.1mm(http://data.cma.cn)。研究區(qū)內(nèi)林地、農(nóng)業(yè)用地、建設(shè)用地、草地、水域和其他用地占比分別為56.9%、18.3%、3.9%、17.9%、1.6%和1.5%,其中草地主要分布在西北部的上游地區(qū),農(nóng)業(yè)用地主要分布在河流兩岸的沿河平坦階地一帶,建設(shè)用地主要分布在南部各個(gè)支流與干流的匯流處(圖1)。

圖1 灤河流域及采樣點(diǎn)分布示意圖Fig.1 Distribution of sampling sites in the Luanhe River basin

1.2 樣品采集

依據(jù)分層采樣原則,樣點(diǎn)覆蓋灤河干流中上游河岸帶各類(lèi)土地利用類(lèi)型,同時(shí)也盡可能考慮空間分布的均勻性、交通可達(dá)性等因素,共布設(shè)樣點(diǎn)21個(gè),于2018 年4月—5月(春季)進(jìn)行水樣采集,流程如下：

(1)用于測(cè)定水質(zhì)指標(biāo)的水樣：使用1L有機(jī)玻璃采水器在采樣點(diǎn)所在位置河心或距離河岸5 m 處進(jìn)行水樣采集(深度約為0.5m),采集3次并在容器中充分混合。將混合后的水樣分為2份,一份為不做任何處理的原始水樣；另一份水樣經(jīng)孔徑為0.45 μm的Whatman GF/C玻璃纖維膜(Whatman,UK)過(guò)濾,過(guò)濾后的濾膜避光冷藏保存,用于測(cè)定葉綠素a(Chla)和總懸浮固體(SS)。兩份水樣均加入少量濃硫酸(H2SO4)酸化保存。盛裝水樣的聚乙烯樣品瓶預(yù)先用1∶10鹽酸溶液浸泡24h,用蒸餾水洗凈并晾干；玻璃纖維素濾膜預(yù)先在450℃溫度下烘烤6h,并用萬(wàn)分之一天平稱(chēng)取其質(zhì)量,以供后續(xù)懸浮性固體的測(cè)定。水樣保存在低溫保存箱中,并在短時(shí)間內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室,在-20℃的條件下冷凍儲(chǔ)存。

(2)用于16S rDNA測(cè)序的水樣：使用預(yù)先消毒過(guò)的聚乙烯桶收集,采集原則同上,每個(gè)樣點(diǎn)收集三份平行樣本(每個(gè)0.9L)。水樣先后通過(guò)2種孔徑的濾膜(2.0μm, 0.8μm,Whatman,UK)進(jìn)行過(guò)濾,以去除砂礫和雜質(zhì),增加后續(xù)富集效率,并使得絕大多數(shù)浮游微生物通過(guò)[14—16]。最后使用孔徑為0.22μm的混合纖維素濾膜(Whatman,UK)對(duì)水樣進(jìn)行過(guò)濾,將浮游細(xì)菌富集在濾膜上。濾膜用鋁箔包裹后保存在液氮罐中(-196℃)。

1.3 水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

水質(zhì)指標(biāo)測(cè)定分為現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定和實(shí)驗(yàn)分析兩部分,共測(cè)定12個(gè)指標(biāo)。(1)現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定：溶解氧(DO)使用便攜式溶解氧儀(YSI Incorporated Company,USA)測(cè)定；流速(Vel)使用流速儀(FLOWATCH,JDC Electronic SA, Switzerland)測(cè)定；電導(dǎo)率(EC)、pH和水溫(Tem)使用電導(dǎo)率儀(METTLER-SG DUO,Mettler Toledo international LTD,USA)測(cè)定[17]。(2)實(shí)驗(yàn)分析：高錳酸鹽指數(shù)(CODMn)、總氮(TN)和總磷(TP)使用原始水樣測(cè)定；CODMn采用高錳酸鹽滴定法；TN 采用紫外分光消解法；TP 采用鉬銻抗分光光度法；氨氮(NH3-N)和硝酸鹽氮(NO3-N)使用過(guò)濾水樣測(cè)定；NH3-N 采用納氏試劑比色法；NO3-N 采用紫外分光光度法；懸浮性固體(SS)和葉綠素a(Chla)使用濾膜上的殘余物進(jìn)行測(cè)定；SS 采用稱(chēng)重法測(cè)定；Chla 采用丙酮分光光度法進(jìn)行測(cè)定[18]。

1.4 細(xì)菌16S rDNA的提取、處理和測(cè)序

將附有浮游細(xì)菌的0.22μm混合纖維素薄膜溶解于2 mL丙酮(Beijing Chemical Works,A.R.)中,使用E.Z.N.A. Water DNA Kit 試劑盒(Omega,USA)提取DNA。使用簡(jiǎn)并PCR引物799F[19]和1193R[20]對(duì)細(xì)菌的16S rDNA基因可變區(qū)V5—V7進(jìn)行PCR擴(kuò)增,每份三組平行。反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性30 s；98℃變性10 s,55℃復(fù)性15s,72℃延伸60 s,循環(huán)25次；72℃延伸5 min。反應(yīng)產(chǎn)物作為第二輪PCR的擴(kuò)增模板,除引物換為含有Illumina接頭和連接區(qū)序列的引物外,其他反應(yīng)條件不變。對(duì)第二輪PCR的產(chǎn)物進(jìn)行純化并混合,得到最終的測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)送交華大基因,依托HiSeq 2500測(cè)序平臺(tái)(Illumina Inc.,USA)進(jìn)行高通量測(cè)序。

使用QIIME1.9.1、USEARCH 10.0處理16S rDNA序列,丟棄錯(cuò)誤率超1%的序列,最終得到3414503條高質(zhì)量序列(平均每個(gè)樣本65664條,最小值為27829條,最大值為100572條)。以97%的閾值對(duì)序列進(jìn)行聚類(lèi),得到18360個(gè)操作分類(lèi)單元(Operational Taxomic Unit,OTU)。使用PyNAST方法去除非細(xì)菌的16S rDNA序列后,得到15856個(gè)OTU,使用Usearch 10生成OTU表。OTU表中的每一個(gè)樣本都被重抽樣至30000條序列的樣本大小,以每個(gè)OTU的豐度除以30000的樣本大小,計(jì)算OTU的相對(duì)豐度。使用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行注釋,從而得到含有物種信息的OTU表。

1.5 空間數(shù)據(jù)提取

土地利用數(shù)據(jù)來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)信息中心國(guó)際科學(xué)數(shù)據(jù)服務(wù)平臺(tái),數(shù)據(jù)基于2016年30m分辨率的Landsat TM/ETM 影像(http://www.cnic.cas.cn/)。土地利用解譯為6大類(lèi)：(1)林地,包括喬木林和灌木林；(2)農(nóng)業(yè)用地,包括菜地、果園和其他農(nóng)用地；(3)建設(shè)用地,包括居民、交通、商業(yè)和工業(yè)用地；(4)草地；(5)水域,包括河流、濕地和水庫(kù)；(6)其他用地。根據(jù)美國(guó)地質(zhì)調(diào)查局的30m分辨率數(shù)字高程模型(DEM)獲取河道平均坡度和地貌形態(tài)數(shù)據(jù)(http://glovis.usgs.gov/),基于國(guó)家基礎(chǔ)地理信息中心的1∶250000 矢量水系圖獲取水系數(shù)據(jù)(http://ngcc.sbsm.gov.cn/),使用軟件ArcGIS 10.1中的水文分析(Spatial Analyst Tools-Hydrology)模塊提取每個(gè)樣點(diǎn)的上游集水區(qū)。對(duì)于每個(gè)樣點(diǎn)的集水區(qū),先根據(jù)河流水系圖的雙側(cè)250m圓角矩形緩沖區(qū)進(jìn)行剪切,得到距河流垂直距離在250m以?xún)?nèi)的河岸帶緩沖區(qū)；再使用以樣點(diǎn)為圓心的3000m圓形緩沖區(qū)對(duì)上一步的河岸帶緩沖區(qū)進(jìn)行剪切,獲得從樣點(diǎn)起至上游3000m范圍內(nèi)距河流垂直距離在250m以?xún)?nèi)的樣點(diǎn)河岸帶緩沖區(qū)(圖2)。統(tǒng)計(jì)各樣點(diǎn)的緩沖區(qū)內(nèi)草地、林地、農(nóng)業(yè)用地、建設(shè)用地的面積占該四種土地利用類(lèi)型面積總和的比例,用于后續(xù)分析。

圖2 河岸帶緩沖區(qū)的截取方式Fig.2 Method of extraction of riparian buffer

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Shapiro-Wilks檢驗(yàn)水環(huán)境因子是否符合正態(tài)分布,對(duì)不符合的數(shù)據(jù)進(jìn)行l(wèi)n(x+1)變換。將每個(gè)樣點(diǎn)平行樣本的OTUs豐度取均值,選取其中出現(xiàn)頻率 ≥ 90%的OTU作為核心群落[21]。根據(jù)淡水細(xì)菌數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTUs進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋,將不能與數(shù)據(jù)庫(kù)匹配的,即未在傳統(tǒng)的靜水水體(例如湖泊)細(xì)菌學(xué)研究中出現(xiàn)過(guò)的OTU記為“非典型淡水分類(lèi)群細(xì)菌”[22]。多樣性指數(shù)的計(jì)算在R語(yǔ)言環(huán)境中使用軟件包“Vegan”完成。選取Chao1豐富度指數(shù)(Chao1 richness estimator,Chao1)和Shannon′s多樣性指數(shù)(Shannon′s Diversity Index,SHDI)作為群落α-多樣性的表征。選擇計(jì)算各樣本OTU水平上的Bray-Curtis距離(Bray-Curtis Dissimilarity)矩陣,作為對(duì)β-多樣性的表征。使用Spearman 相關(guān)分析計(jì)算核心群落占比、非典型淡水細(xì)菌類(lèi)群、多樣性指數(shù)和距源頭距離之間的相關(guān)性,和α-多樣性指數(shù)與水環(huán)境因子、土地利用因子之間的相關(guān)性。使用Mantel檢驗(yàn)和偏Mantel檢驗(yàn),計(jì)算細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離矩陣和地理空間因子(距源頭距離)、水質(zhì)、土地利用因子的歐式距離矩陣之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 灤河各水質(zhì)指標(biāo)特征

灤河各水質(zhì)指標(biāo)顯示(表1)：河流理化指標(biāo)中,pH平均為8.54,呈弱堿性；水溫(Tem)平均為13.82 ℃；流速(Vel)平均為1.35 km/h；電導(dǎo)率(EC)平均為417.78 μS/cm；懸浮性固體(SS)平均為30.36 mg/L；溶解氧(DO)平均為8.91 mg/L,達(dá)到Ⅰ類(lèi)水質(zhì)；高錳酸鹽指數(shù)(CODMn,)平均為5.22 mg/L,達(dá)到Ⅲ類(lèi)水質(zhì)。河流營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)中,總磷(TP)平均為0.11 mg/L,達(dá)到Ⅲ類(lèi)水質(zhì)；總氮(TN)平均為2.63 mg/L,為劣Ⅴ類(lèi)水質(zhì)；氨氮(NH3-N)平均為0.30 mg/L,達(dá)到Ⅱ類(lèi)水質(zhì)；硝酸鹽氮(NO3-N)平均為1.82 mg/L。生物指標(biāo)葉綠素a(Chla)平均12.71 μg/L。

表1 灤河各水質(zhì)指標(biāo)特征Table 1 Characteristics of water quality parameters in Luanhe River

2.2 灤河中上游浮游細(xì)菌群落的組成特征

使用RDP數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)每個(gè)OTU的代表序列進(jìn)行注釋后,對(duì)其進(jìn)行從門(mén)到屬水平的分類(lèi)。在檢出的15856個(gè)OTU中,共檢測(cè)到分類(lèi)地位明確的細(xì)菌界28門(mén)(Phylum)、72綱(Class)、113目(Order)、265科(Family)和936屬(Genus)。其中變形菌門(mén)(Proteobacteria)由于種類(lèi)眾多,根據(jù)核糖體rRNA序列的差異,將其拆分為5個(gè)綱,分別冠以α、β、γ、δ和ε前綴,以便于研究。

研究共確定出12個(gè)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌門(mén)(綱),它們?cè)谥辽僖粋€(gè)樣本中相對(duì)豐度大于1%。依據(jù)相對(duì)豐度的大小排序,分別為：放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria,平均28.95%)、β-變形菌綱(β-Proteobacteria,平均28.90%)、α-變形菌綱(α-Proteobacteria,平均10.62%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes,平均6.14%)、γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria,平均5.57%)、δ-變形菌綱(δ-Proteobacteria,平均4.51%)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes,平均3.93%)、酸桿菌門(mén)(Acidobacteria,平均3.87%)、綠彎菌門(mén)(Chloroflexi,平均2.24%)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia,平均1.06%)、浮霉菌門(mén)(Planctomycetes,平均1.01%)、硝化螺桿菌門(mén)(Nitrospirae,平均0.75%),其余20種細(xì)菌門(mén)(綱)組成了低豐度類(lèi)群,平均為1.46%。變形菌門(mén)和放線(xiàn)菌門(mén)的平均相對(duì)豐度高于50%,是灤河干流中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位的門(mén)類(lèi)。

圖3 灤河干流中上游浮游細(xì)菌群落組成Fig.3 Composition of bacterioplankton community in upper-middle reach of Luanhe river

灤河中上游浮游細(xì)菌的核心群落共有209個(gè)OTU,占OTU總數(shù)(15 856個(gè))的1.29%,序列數(shù)占總序列數(shù)的43.04%。核心群落的相對(duì)豐度占比與距源頭距離存在顯著正相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)為 0.909(P<0.01)。非典型淡水分類(lèi)群細(xì)菌的相對(duì)豐度與距源頭距離存在顯著負(fù)相關(guān),Spearman相關(guān)系數(shù)為-0.935(P<0.01)。

2.3 灤河中上游浮游細(xì)菌群落的α-多樣性特征

Chao1豐富度指數(shù)和Shannon′s多樣性指數(shù)計(jì)算描述的統(tǒng)計(jì)特征如下(表2)。

表2 浮游細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)的描述統(tǒng)計(jì)Table 2 Descriptive statistics of α-diversity Index of bacterioplankton community

OTU數(shù)和Shannon′s多樣性指數(shù)均成階梯狀下降趨勢(shì),而Chao1豐富度指數(shù)則在河流中段首先增大,隨后迅速降低(圖4)。

圖4 α-多樣性指數(shù)隨流向的變化Fig.4 Variation of α-diversity indexes along the flow direction

浮游細(xì)菌群落的α-多樣性指數(shù)與各項(xiàng)環(huán)境因子的Spearman相關(guān)性分析如表3所示。

表3 浮游細(xì)菌群落α-多樣性指數(shù)與環(huán)境因子和土地利用因子的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis between α-diversity index of bacterioplankton community and environment and land use factors

距源頭距離、建設(shè)用地占比(URBAN)、氨氮(NH3-N)、硝酸鹽氮(NO3-N)、總氮(TN)、電導(dǎo)率(EC)、總懸浮固體(SS)和溶解氧(DO)與OTU數(shù)、Chao1豐富度指數(shù)和Shannon′s多樣性指數(shù)間均存在顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。

草地占比(GRASS)與OTU數(shù)、Shannon′s多樣性指數(shù)(P<0.05)和Chao1豐富度指數(shù)均存在顯著正相關(guān)(P<0.01)；而總磷(TP)則與三項(xiàng)指標(biāo)均不存在相關(guān)性。

2.4 灤河中上游浮游細(xì)菌群落的β-多樣性特征及其與水環(huán)境因子和土地利用因子的關(guān)系

基于Bray-Curtis距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)揭示了灤河中上游各樣點(diǎn)所取平行樣本中細(xì)菌群落的分布模式(圖5)。細(xì)菌群落PCoA排序圖的第一軸(PC1)和第二軸(PC2)分別能解釋55.27%和16.27%的物種差異,其中PC1軸與距源頭距離存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(Spearman相關(guān)系數(shù)-0.891,P<0.05)。樣本分為三部分：位于排序圖右側(cè)的樣本,距源頭距離較近,核心群落占比較低,而非典型淡水分類(lèi)群細(xì)菌占比較高；位于排序圖左下側(cè)的樣本,距源頭距離較遠(yuǎn),核心群落占比較高,而非典型淡水分類(lèi)群細(xì)菌占比較低。位于排序圖上側(cè)的樣本,位于河段的中部,其較為分散的分布模式暗示中游樣本的群落組成存在一定的差異,體現(xiàn)出過(guò)渡性的特征。

圖5 河流沿途樣點(diǎn)各平行樣本的浮游細(xì)菌群落組成的PCoA 分析Fig.5 PCoA analysis of bacterioplankton community of parallel samples along the river各樣點(diǎn)的平行樣本按距源頭距離由近及遠(yuǎn)編號(hào),距源頭距離最近的樣本編號(hào)為S001,以此類(lèi)推

使用Mantel檢驗(yàn)和偏Mantel檢驗(yàn),對(duì)各項(xiàng)水環(huán)境因子的歐式距離矩陣和細(xì)菌群落組成的Bray-Curtis距離矩陣進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn),結(jié)果顯示：距源頭距離與細(xì)菌群落組成存在顯著相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0.723(P<0.01),在將其他水質(zhì)因子作為控制變量后,兩者依然顯著相關(guān)(P<0.01)(表4)。電導(dǎo)率、總氮、硝酸鹽氮、氨氮、總懸浮固體、溶解氧、葉綠素a、pH、流速均與細(xì)菌群落組成存在顯著相關(guān)(P<0.05)；在將距源頭距離作為控制變量后,只有總氮、硝酸鹽氮、氨氮仍與細(xì)菌群落組成存在顯著相關(guān)(P<0.05),這說(shuō)明這三種氮營(yíng)養(yǎng)鹽指標(biāo)其含量不完全隨滯水時(shí)間的增加而改變,存在空間異質(zhì)性。

表4 群落Bray-Curtis距離矩陣與水質(zhì)因子歐式距離矩陣的Mantel檢驗(yàn)Table 4 Mantel test between community composition and water environment factors excluding land use factors

將土地利用占比作為控制變量后,距源頭距離與細(xì)菌群落組成仍存在顯著相關(guān)(P<0.01)(表5)。土地利用因子中,只有建設(shè)用地占比(URBAN)與細(xì)菌群落組成存在顯著相關(guān)(P<0.05)；將距源頭距離作為控制變量后,建設(shè)用地占比與細(xì)菌群落組成在α=0.05的顯著性水平上不再相關(guān),但在α=0.1的顯著性水平上依然相關(guān)(P<0.1),說(shuō)明建設(shè)用地對(duì)細(xì)菌群落的影響存在空間異質(zhì)性。

表5 群落Bray-Curtis距離矩陣與土地利用因子歐式距離矩陣的Mantel檢驗(yàn)Table 5 Mantel test between community composition and land use factors

將溶解氧、總磷、高錳酸鹽指數(shù)和水溫作為控制變量后,建設(shè)用地占比與細(xì)菌群落組成依然存在顯著相關(guān)(P<0.05)；將總氮、氨氮、pH、葉綠素a和流速作為控制變量后,建設(shè)用地占比與細(xì)菌群落組成在α=0.05的顯著性水平上不再相關(guān),但在α=0.1的顯著性水平上依然相關(guān)(P<0.1)；將硝酸鹽氮和電導(dǎo)率作為控制變量后,建設(shè)用地占比與細(xì)菌群落組成不再存在顯著相關(guān)。這說(shuō)明在灤河干流中上游,建設(shè)用地可通過(guò)影響含氮物質(zhì)排放,以及改變流速、pH等指標(biāo),對(duì)細(xì)菌群落組成產(chǎn)生影響。

3 討論

3.1 距河流源頭的距離對(duì)浮游細(xì)菌群落多樣性的影響

距源頭距離與灤河中上游浮游細(xì)菌群落的Bray-Curtis距離矩陣間的相關(guān)系數(shù)為各項(xiàng)水環(huán)境因子中最高(MantelR=0.723),且偏相關(guān)分析結(jié)果仍顯著。距源頭距離影響浮游細(xì)菌在河流中的滯留時(shí)間,細(xì)菌群落組成存在其獨(dú)特的影響[23]。在灤河干流上段,其主要的土地利用類(lèi)型為自然程度較高的草原,向水體提供的細(xì)菌的多樣性也較高[24],而其中的核心群落一般來(lái)自于源頭附近的巖表生物膜或深層土壤[25]。隨著滯留時(shí)間的增加,從河岸帶周邊環(huán)境被徑流帶入水體的細(xì)菌之生態(tài)位,逐漸被能更好地適應(yīng)淡水環(huán)境的核心群落細(xì)菌所取代。

此外,距源頭距離由于其數(shù)值上遞增的特點(diǎn),與某些在河水流向下游過(guò)程中不斷積累的環(huán)境變量間存在某種相關(guān)性,例如各類(lèi)非點(diǎn)源污染(氮、磷等),因此在一定程度上可以代表人類(lèi)活動(dòng)對(duì)河流水環(huán)境的擾動(dòng)[8]。考慮到灤河中上游的中段的主要土地利用類(lèi)型為林地,其生產(chǎn)力和能提供的外源性輸入量與草原相比較高；下段為承德市主城區(qū),其城市規(guī)模較大,提供的外源性輸出更多。各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的累積,使得能高效利用養(yǎng)分的類(lèi)群被選擇出來(lái)[22]。在這個(gè)過(guò)程中,浮游細(xì)菌群落由多樣性較高的近自然群落轉(zhuǎn)變?yōu)橛伸o水細(xì)菌占優(yōu)勢(shì)地位的類(lèi)湖泊群落[21,26]。在本研究中,這體現(xiàn)在沿河流方向,α-多樣性指數(shù)的降低和非典型淡水分類(lèi)群占比降低,以及核心群落占比的升高[8,26—29]。

3.2 水環(huán)境因子對(duì)浮游細(xì)菌群落多樣性的影響

群落α-多樣性指數(shù)與氨氮、硝酸鹽氮、總氮、總磷、電導(dǎo)率、懸浮性固體、溶解氧間存在顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。多樣性指數(shù)與營(yíng)養(yǎng)鹽因子間呈顯著負(fù)相關(guān),表明營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的增加可能導(dǎo)致了生態(tài)位分化,使得能夠高效利用營(yíng)養(yǎng)鹽的類(lèi)群比例逐漸上升而成為優(yōu)勢(shì)類(lèi)群；總懸浮固體可為水體中的一部分細(xì)菌提供定殖空間,灤河干流中上游的中段位于河谷地區(qū),兩岸較為陡峭,水土流失情況比較嚴(yán)重,因此中段樣點(diǎn)的總懸浮固體量較上段和下段的多,這使得顆粒附著型細(xì)菌(particle-associated bacteria)的許多種類(lèi)得以穩(wěn)定存在并增殖,例如β-變形菌綱和擬桿菌門(mén)的細(xì)菌[27—28],而這些細(xì)菌也正是能高效利用營(yíng)養(yǎng)鹽和藻類(lèi)有機(jī)物的類(lèi)群。

氮營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)于河流浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的顯著影響已為多項(xiàng)研究所報(bào)道[30—32]。在以距源頭距離為控制變量后,各水質(zhì)因子中只有以硝酸鹽氮、氨氮和總氮為代表的水體營(yíng)養(yǎng)鹽因子依然與群落Bray-Curtis距離矩陣間存在顯著相關(guān)性(P<0.05)。這表明在灤河中上游,氮的排放變化與距源頭距離的增加并非完全一致,即并非自然狀態(tài)下的簡(jiǎn)單累積過(guò)程,這很有可能是人類(lèi)活動(dòng)的空間異質(zhì)性造成的。

3.3 河岸帶土地利用對(duì)浮游細(xì)菌群落多樣性的影響

Chao1豐富度指數(shù)是一種對(duì)偶見(jiàn)種較為敏感的多樣性指數(shù)[33],而Chao1豐富度指數(shù)在中端的波動(dòng),表明在河流的中段可能存在大量外源性的偶見(jiàn)種細(xì)菌輸入,而這些細(xì)菌在進(jìn)入河流下段后又無(wú)法在種間競(jìng)爭(zhēng)中勝出,因此在強(qiáng)烈的選擇作用下迅速消亡。外源細(xì)菌大量涌入的現(xiàn)象,可能與中段的各樣點(diǎn)處于地形和土地利用的過(guò)渡地帶有關(guān)。研究區(qū)的中段位于華北平原的丘陵地帶,與上游鹽堿化的壩上高原相比,在土壤類(lèi)型、理化條件、植被類(lèi)型等方面均存在較大差異,這些自然條件的差異會(huì)增加河流的其他外源性細(xì)菌輸入的可能性[34]。

此外,在研究區(qū)中段各樣點(diǎn)周邊的河岸帶緩沖區(qū)中,耕地和建設(shè)用地所占的比例與林地基本相當(dāng)。已有研究表明,在農(nóng)業(yè)土壤中,不同的作物種植、農(nóng)藥和化肥的使用,以及機(jī)械化翻動(dòng)土壤等做法,會(huì)改變土壤的理化性質(zhì),從而改變了土壤細(xì)菌群落及其生態(tài)功能這一變化使得農(nóng)業(yè)土壤與近自然植被覆蓋下的土壤內(nèi)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間存在顯著差異,從而對(duì)隨地表徑流進(jìn)入水體的外源性細(xì)菌輸入產(chǎn)生影響[35—36]。因此,河流中段樣點(diǎn)Chao1豐富度指數(shù)的異常升高,可以認(rèn)為是自然條件差異以及土地利用類(lèi)別發(fā)生變化后的綜合影響結(jié)果。

在將硝酸鹽氮和電導(dǎo)率作為控制變量后,建設(shè)用地占比的歐式距離矩陣與群落Bray-Curtis距離矩陣間的相關(guān)性不再顯著,這說(shuō)明土地利用結(jié)構(gòu)的改變對(duì)外源性營(yíng)養(yǎng)輸入有著重要影響。在建設(shè)用地占比較多的地區(qū),其郊區(qū)城鄉(xiāng)交錯(cuò)帶種土地利用的變化劇烈[37],導(dǎo)致了含氮物質(zhì)排放的增加。這對(duì)總氮輸出濃度和硝酸鹽氮輸出濃度有顯著源作用[38]。在灤河干流中上游沿岸,建設(shè)用地(包括旱地、居民地)的占比與距源頭距離并不存在線(xiàn)性關(guān)系,這說(shuō)明城鎮(zhèn)的分布雖然有越向下游越多的趨勢(shì),但其分布并不是完全成線(xiàn)性的,而這可能就是導(dǎo)致如上現(xiàn)象的原因。這也解釋了氮指標(biāo)在以距源頭距離作為控制變量后,仍與浮游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)間仍存在顯著相關(guān)的原因。

在將溶解氧、總磷、高錳酸鹽指數(shù)、溫度和總懸浮顆粒作為控制變量后,建設(shè)用地占比的歐式距離矩陣與群落Bray-Curtis距離矩陣間的相關(guān)性依然顯著(P<0.05),這表明建設(shè)用地與這些變量對(duì)群落結(jié)構(gòu)的影響并不重合。在將距源頭距離、總氮、氨氮、pH、葉綠素a、流速作為控制變量后,建設(shè)用地占比的歐式距離矩陣與群落Bray-Curtis距離矩陣間在α=0.05的顯著性水平下不再呈顯著相關(guān),但仍在α=0.1的顯著性水平下呈顯著相關(guān),表明建設(shè)用地除了通過(guò)影響以上諸因子間接影響浮游細(xì)菌群落外,還可能通過(guò)其他效應(yīng)影響著浮游細(xì)菌群落。

土地利用變化,特別是城市化會(huì)改變河流棲息地的局部物理?xiàng)l件,例如,使河流河段遭受泥沙侵蝕或沉積、電導(dǎo)率升高、溫度變化或其他環(huán)境脅迫[10—11]。此外,集水區(qū)的不透水地表占比(Watershed% IC)與城市化地區(qū)河流中的細(xì)菌群落關(guān)系密切,在土地利用結(jié)構(gòu)向城市化轉(zhuǎn)變的過(guò)程中,地表不透水層的擴(kuò)大切斷或改變了水源河流與地下水的供應(yīng),從而影響到細(xì)菌通過(guò)徑流進(jìn)入河流[39]。不同類(lèi)型的土地利用,由于其物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的差異,也可能向水體輸出不同種類(lèi)的菌種。與人畜病原體、腸道細(xì)菌和塑料降解功能等有關(guān)的菌種,會(huì)隨著一部分基礎(chǔ)設(shè)施(如流域內(nèi)的滲漏管道)等被直接輸送到城市化程度高的河流中[40]。

4 結(jié)論

(1)灤河中上游的浮游細(xì)菌群落α-多樣性較高,細(xì)菌種類(lèi)較為豐富。沿河流方向,β-變形菌綱和擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度逐漸增加,放線(xiàn)菌門(mén)和γ-變形菌綱相對(duì)豐度保持穩(wěn)定,其他門(mén)類(lèi)細(xì)菌的相對(duì)豐度則隨距源頭距離的增加而逐漸降低。最終在下游形成了主要由β-變形菌綱、擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)占優(yōu)勢(shì)地位的群落結(jié)構(gòu),與傳統(tǒng)研究中的湖泊細(xì)菌群落的組成類(lèi)似。

(2)灤河中上游的浮游微生物群落組成受距源頭距離(營(yíng)養(yǎng)滯留時(shí)間)、氮磷營(yíng)養(yǎng)鹽的綜合影響。其中距源頭距離與細(xì)菌群落的是影響灤河中上游細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主要因素,很可能是伴隨著細(xì)菌滯水時(shí)間增加而隨之發(fā)生的群落演替過(guò)程?？偟?、氨氮和硝酸鹽氮是影響灤河中上游群落結(jié)構(gòu)的重要因素,且其分布存在空間異質(zhì)性,這是由于建設(shè)用地的空間異質(zhì)性分布導(dǎo)致的。

(3)建設(shè)用地占比對(duì)灤河中上游的浮游微生物群落組成存在顯著相關(guān)性。建設(shè)用地通過(guò)影響河流的水溫和理化指標(biāo),對(duì)浮游微生物群落產(chǎn)生復(fù)雜影響。該結(jié)果可為河流水生態(tài)保護(hù)和流域土地利用結(jié)構(gòu)優(yōu)化提供科學(xué)依據(jù)。