小鼠肺炎病毒RT-PCR方法的建立及在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染和國際比對(duì)樣本檢測(cè)中的應(yīng)用*

王 吉 王莎莎 王淑菁 李 威 秦 驍 李曉波 付 瑞 岳秉飛 賀爭(zhēng)鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物微生物遺傳檢測(cè)中心，北京 102629)

小鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice，PVM)屬副粘病毒科(Paramyxoviridae)、肺炎病毒屬(pneumovirus)，核酸型為單股RNA，是嚙齒類動(dòng)物中最常見的病毒之一[1]。PVM 呈世界范圍性分布，廣泛存在于小鼠和大鼠群中。PVM呈嚴(yán)格的嗜肺性，主要經(jīng)呼吸道傳播。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中自然宿主為小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等嚙齒類動(dòng)物。兔、猴、黑猩猩和人也能感染。動(dòng)物感染后表現(xiàn)食欲下降、被毛粗亂、消瘦、呼吸急促等癥狀, 不僅會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本身造成危害，還會(huì)對(duì)吸入毒理學(xué)、肺細(xì)胞動(dòng)力學(xué)、代謝學(xué)以及免疫學(xué)等實(shí)驗(yàn)研究產(chǎn)生干擾[1-2]。Madarame等[3]從疑似為刺猬搖擺綜合征(WHS)的患病非洲刺猬(Atelerixarbiventris)體內(nèi)檢到PVM病原體，說明PVM宿主范圍在擴(kuò)大。

本研究旨在建立簡(jiǎn)便、快速RT-PCR檢測(cè)方法，用于小鼠、大鼠、沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及其相關(guān)樣本的快速檢測(cè)。為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疾病的快速診斷提供必要、可靠的檢測(cè)技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1病毒及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本：小鼠肺炎病毒(PVM)：美國ATCC(編號(hào)：VR-25)；漢坦病毒(hantavirus，HV)、淋巴細(xì)胞脈絡(luò)叢腦膜炎病毒(lymphocytic choriomeningitis virus，LCMV)、仙臺(tái)病毒(sendai virus，SV)、呼腸孤病毒3型(reovirus type 3，Reo3)及不同代次PVM細(xì)胞毒：本室保存。5只長(zhǎng)爪沙鼠、7只清潔級(jí)小鼠肺組織樣本：國內(nèi)某送檢單位；9只SPF大鼠、20只SPF小鼠和19只PVM感染SPF小鼠肺組織樣本：中國食品藥品檢定研究院動(dòng)物生產(chǎn)供應(yīng)室提供【SCXK(京)2017-0005】【SYXK(京)2017-0013】。本實(shí)驗(yàn)按照中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理審查委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，倫理委員會(huì)審批號(hào)：中檢動(dòng)(福)第2019(A)001。

1.1.2主要試劑及儀器：RNA快速提取試劑盒：德國QIAGEN公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒：Thermo公司；TaqHS酶、脫氧核糖核苷三磷酸(deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP)、10×PCR buffer、100 bp DNA Marker：寶生物工程(大連)有限公司；pGEM T Easy質(zhì)粒(Promega公司)：寶生物工程(大連)有限公司。PCR儀：美國Bio-RAD公司MYCYCLER；核酸瓊脂糖凝膠電泳儀：美國Bio-RAD公司PwerPac Basic；凝膠成像分析儀：美國Kodak公司 GL212Pro。

1.2 方法

1.2.1引物的設(shè)計(jì)及合成：比較分析已報(bào)道的不同株P(guān)VM G基因序列，根據(jù)GenBank中登錄的PVM毒株(序列號(hào)：AY729016)G基因序列選擇保守區(qū)域作為靶基因，用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)兩組引物，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行引物合成(表1)。

表1 引物序列及位置Table 1 The primer sequence and position

1.2.2毒種的處理：取ATCC PVM毒種用DMEM進(jìn)行10倍稀釋，一部分用于病毒RNA提取，一部分凍存于-70 ℃冰箱保存。

1.2.3病毒RNA提?。喝≌HK21細(xì)胞凍存液、10倍稀釋ATCC PVM毒種、HV、LCMV、SV、Reo3細(xì)胞毒各0.2 mL作為模板，按照RNA提取試劑盒操作方法進(jìn)行RNA提取。提取的RNA樣本立即進(jìn)行cDNA合成。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄：通過對(duì)隨機(jī)引物及AMV逆轉(zhuǎn)錄酶濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定反轉(zhuǎn)錄體系為：5×RNA PCR Buffer 5 μL、dNTPs Mixture 4 μL、RNase Free dH2O 5.5 μL、隨機(jī)引物1 μL、RNase Inhibitor 1 μL、 AMV反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL、病毒RNA 8 μL，反應(yīng)條件為：37 ℃ 90 min、42 ℃孵育15 min、95 ℃ 5 min,獲得cDNA,保存?zhèn)溆肹4-5]。

1.2.5PCR方法反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的確定：以10倍稀釋ATCC PVM毒種 cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)2組引物PCR反應(yīng)體系的10×Buffer濃度、dNTPs濃度、TaqHS酶濃度、引物、模板量，及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進(jìn)行優(yōu)化，通過對(duì)正常BHK細(xì)胞、PVM毒種進(jìn)行PCR擴(kuò)增來確定RT-PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)模式[4-5]。

1.2.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)：取5 mL 擴(kuò)增產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/mL EB)進(jìn)行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE (0.04 mol/L Tris乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH 8.0)，110 V電泳40 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結(jié)果。RT-PCR陽性擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，通過與GenBank 中PVM序列進(jìn)行比對(duì)以確定PCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性[4-5]。

1.2.7特異性試驗(yàn)：用建立的RT-PCR方法同時(shí)檢測(cè)PVM、HV、LCMV、SV、Reo3及BHK21細(xì)胞，以驗(yàn)證建立方法的特異性。

1.2.8敏感性試驗(yàn)：(1) PVM病毒濃度梯度檢測(cè)。取感染滴度為104.75/mL PVM病毒液，用PBS做系列倍比稀釋，分設(shè)10-1～10-99個(gè)不同濃度梯度。取每個(gè)稀釋度病毒液各0.2 mL制備模板，用所設(shè)計(jì)的2組引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測(cè)病毒最小滴度。

(2)PVM DNA質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)。將起始濃度為 8.77×107copies/μL PVM質(zhì)粒做倍比稀釋，分設(shè)8.77×107～8.77×100copies/μL 8個(gè)不同濃度梯度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能擴(kuò)增的最小DNA質(zhì)粒模板濃度。

1.2.9重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)：將8.77×106～8.77×104copies/μL 3個(gè)濃度梯度PVM質(zhì)粒和同一批PCR檢測(cè)試劑于-30 ℃冰箱放置12個(gè)月后，進(jìn)行PCR檢測(cè)。每個(gè)濃度梯度質(zhì)粒各做3個(gè)重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定[5]。

1.2.10方法的應(yīng)用：(1)對(duì)日常送檢部分小鼠、大鼠和沙鼠的檢測(cè)。取日常送檢的清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠5只、2個(gè)品系SPF大鼠9只、4個(gè)品系SPF小鼠20只和1個(gè)品系清潔級(jí)小鼠7只肺組織樣本進(jìn)行研磨，用無菌PBS震蕩懸浮，5 000 r/min離心30 min，取上清用引物2建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)的陽性樣本，需要進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中PVM核酸序列進(jìn)行比對(duì)，以驗(yàn)證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。送檢動(dòng)物具體信息見表2。

表2 肺組織樣本來源動(dòng)物信息Table 2 The information of testing lung tissue samples

(2)對(duì)感染小鼠的檢測(cè)。用引物2 建立的方法檢測(cè)人工感染小鼠：為驗(yàn)證方法的可應(yīng)用性及初步探索PVM對(duì)小鼠的感染性，實(shí)驗(yàn)通過滴鼻方式人工感染4周齡SPF NIH小鼠19只，劑量為0.06 mL/只。分別于感染后第3、5、7、9、14、18天取小鼠肺組織樣本，除第9天取樣4只外，其他時(shí)間均取樣3只。取樣結(jié)束，對(duì)19只人工感染的小鼠肺組織樣本進(jìn)行研磨處理后，用引物2建立的方法檢測(cè)。取樣時(shí)間和對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)信息見表3。

表3 取樣時(shí)間和對(duì)應(yīng)的樣本編號(hào)信息Table 3 The information of sampling time and corresponding sample number

(3)可信度驗(yàn)證。用本實(shí)驗(yàn)室建立的PVM熒光定量PCR方法,檢測(cè)19只人工感染小鼠肺組織樣本，驗(yàn)證用引物2建立PCR方法的可信度。Q-PCR方法用引物和探針見表4。

表4 熒光定量PCR方法所用引物和探針Table 4 The primers and probes for fluorescence quantitative PCR method

(4)用于ICLAS國際比對(duì)樣本的檢測(cè)。利用引物2建立的方法對(duì)2016—2019年連續(xù)4年ICLAS組織的國際比對(duì)大小鼠易感待檢RNA病毒樣本和未知RNA或DNA病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)。樣本具體信息見表5。

表5 ICLAS診斷實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)估程序樣本分布Table 5 ICLAS diagnostic laboratory performance evaluation program specimen distribution

2 結(jié)果

2.1 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件的確定

以10倍稀釋ATCC PVM毒種 cDNA為模板用2組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：10×ExTaqBuffer(Mg2+Free) 2 μL, dNTPs Mixture(10 mmol/L)2 μL,TaqHS酶(5 U/μL)0.5 μL,上、下游引物(10 pmol/μL)各1 μL，cDNA 2 μL，補(bǔ)水至20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。均有明顯的目的條帶產(chǎn)生(圖1和圖2)。2組引物擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與GenBank 中PVM標(biāo)準(zhǔn)株序列進(jìn)行比對(duì)，核苷酸序列同源性均為99%。

圖1 引物1擴(kuò)增PVM電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM;2:BHK21細(xì)胞Fig.1 The electrophoresis results of primer 1 amplified PVMM:100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells

圖2 引物2擴(kuò)增PVM電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM;2:BHK21細(xì)胞Fig.2 The electrophoresis results of primer 2 amplified PVMM:100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells

2.2 特異性試驗(yàn)

用2組引物同時(shí)檢測(cè)PVM、HV、LCMV、SV、Reo3及BHK21細(xì)胞，電泳結(jié)果顯示除PVM產(chǎn)生目的條帶外，其他4種病毒和BHK21細(xì)胞均無目的條帶產(chǎn)生(圖3和圖4)。說明2組引物特異性均良好。

圖3 引物1特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2～6：BHK21細(xì)胞、HV、LCMV、SV、Reo3Fig.3 The electrophoresis results of primer 1 specific testM:100 bp DNA marker;1:PVM;2～6:BHK21 cells,HV, LCMV, SV, Reo3

圖4 引物2特異性試驗(yàn)電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2～6：BHK21細(xì)胞、HV、LCMV、SV、Reo3Fig.4 The electrophoresis results of primer 2 specific testM:100 bp DNA marker;1:PVM;2～6:BHK21 cells,HV,LCMV,SV,Reo3

2.3 敏感性試驗(yàn)

2.3.1PVM病毒濃度梯度檢測(cè)：用2組引物檢測(cè)感染滴度為104.75/mL不同濃度梯度的病毒，結(jié)果顯示引物1和引物2所能檢測(cè)的最小濃度梯度病毒分別為10-3和10-4(圖5和圖6)。

圖5 引物1病毒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～9：10-1～10-9濃度梯度病毒Fig.5 The detection results of primer 1 for virus concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～9:10-1～10-9 dilution concentration gradient virus

圖6 引物2病毒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～9：10-1～10-9 濃度梯度病毒Fig.6 The detection results of primer 2 for Virus concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～9:10-1 ～10-9 dilution concentration gradient virus

2.3.2PVM DNA質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)：用2組引物檢測(cè)8.77×107L～8.77×100copies/μL 8個(gè)不同濃度梯度的質(zhì)粒，結(jié)果顯示引物1和引物2所能檢測(cè)到的病毒質(zhì)粒最小濃度分別為8.77×103copies/μL和8.77×102copies/μL(圖7和圖8)。

圖7 引物1質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～8：8.77×107 ～8.77×100 copies/μL質(zhì)粒；Fig.7 The detection results of primer 1 for plasmids concentration gradientM:100 bp DNA marker；1～8:8.77×107 ～8.77×100 copies/μLconcentration gradient plasmids

圖8 引物2質(zhì)粒濃度梯度檢測(cè)結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～8：8.77×107 ～8.77×100 copies/μL質(zhì)粒；Fig.8 The detection results of primer 2 for plasmids concentration gradientM:100 bp DNA marker;1～8:8.77×107 L～8.77×100 copies/μL concentration gradient plasmids

通過2組引物病毒濃度梯度和質(zhì)粒濃度梯度的敏感性檢測(cè)結(jié)果，說明引物2檢測(cè)靈敏度更高。因此實(shí)驗(yàn)選擇引物2作為方法建立檢測(cè)用引物。

2.4 重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

用引物2進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)，結(jié)果顯示引物2上下游引物、檢測(cè)試劑及8.77×104～8.77×106copies/μL 3個(gè)濃度梯度PVM質(zhì)粒放置于-30 ℃冰箱12個(gè)月后，依然能擴(kuò)增到明顯的目的條帶(圖9)。說明建立的方法重復(fù)性良好，穩(wěn)定性至少可達(dá)12個(gè)月。

圖9 引物2重復(fù)性及穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～3：8.77×106 copies/μL質(zhì)粒；4～6：8.77×105 copies/μL質(zhì)粒；7～9：8.77×104 copies/μL質(zhì)粒Fig.9 The repeatability and stability test results of primer 2M:100 bpDNAmarker;1～3:8.77×106 copies/μL plasmids;4～6:8.77×105 copies/μL plasmids;7～9:8.77×104 copies/μL plasmids

2.5 方法的應(yīng)用

2.5.1對(duì)小鼠、大鼠和沙鼠的檢測(cè)：用引物2建立的方法檢測(cè)5只清潔級(jí)長(zhǎng)爪沙鼠、9只SPF大鼠、20只SPF小鼠和7只清潔級(jí)小鼠，電泳結(jié)果顯示，均無約249 bp目的條帶產(chǎn)生。檢測(cè)結(jié)果均為陰性(圖10和圖11)。

圖10 引物2檢測(cè)5只沙鼠(G1～G5)、7只清潔級(jí)小鼠(M1～M7)和5只SPF小鼠(M8～M12)肺組織樣本電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1和15：PVM；2和16：BHK21cells；3～7：G1～G5；8～14：M1～M7；17～21：M8～M12；Fig.10 The electrophoresis results of primer 2 for detection lung tissue samples of 5 gerbils(G1～G5),7 clean mice(M1 ～ M7) and 5 SPF mice(M8-M12)M:100 bp DNA marker;1 and 15:PVM;1and 16:BHK21cells;3～7:G1～G5;8～14:M1～M7;17～21:M8～M12

圖11 引物2檢測(cè)15只SPF小鼠(M13～M27)和9只SPF大鼠(R1～R9)肺組織樣本電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1～15：M13～M27；16～24：R1～R9Fig.11 The electrophoresis results of primer 2 for detection lung tissue samples of 15 SPF mice(M13-M27)and 9 SPF rats(R1～R9)M:100 bp DNA marker;1～15:M13～M27;16～24:R1～R9

2.5.2對(duì)感染小鼠的檢測(cè)：(1)用引物2建立的PCR方法檢測(cè)人工感染小鼠結(jié)果。對(duì)表3中人工感染19只SPF 小鼠進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13號(hào)小鼠肺組織有約249 bp明顯目的條帶產(chǎn)生,電泳結(jié)果見圖12。7個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果與PVM標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序進(jìn)行比對(duì)同源性均為99%。19只小鼠感染率為36.8%(7/19)。

圖12 引物2檢測(cè)19只人工感染小鼠肺組織樣本電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2：BHK21 cells；3～21：IM1～I(xiàn)M19；Fig.12 The electrophoresis results of primer 2 for detection 19 lungtissue samples of artificially infected mice(IM1～I(xiàn)M19)M：100 bp DNA marker;1:PVM;2:BHK21 cells;3～21:IM1～I(xiàn)M19

(2)可信度驗(yàn)證。用本研究建立的PVM熒光定量PCR(q-PCR)方法檢測(cè)表3中人工感染的19只小鼠肺組織樣本。在陰陽對(duì)照成立的條件下，結(jié)果顯示有7只小鼠肺組織樣本有明顯的擴(kuò)增曲線，PVM核酸陽性，陽性小鼠編號(hào)分別為IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13號(hào)。其他編號(hào)小鼠肺組織樣本均無擴(kuò)增曲線產(chǎn)生，結(jié)果均為陰性。19只小鼠q-PCR擴(kuò)增曲線見圖13，結(jié)果陽性的7只小鼠肺組織樣本檢測(cè)結(jié)果見表6。

表6 q-PCR檢測(cè)7只陽性小鼠肺組織樣本結(jié)果Table 6 The results of q-PCR detection for 7 positive mice lung tissue samples

圖13 q-PCR檢測(cè)19只人工感染小鼠肺組織樣本擴(kuò)增曲線圖 1：P/C；2-21：N/C 和IM1～I(xiàn)M19Fig.13 The amplified graph of lung tissue samples from 19 artificially infected mice were detected by q-PCR1：P/C; 2-21：N/C 和IM1～I(xiàn)M19

從檢測(cè)結(jié)果看，用引物2建立的PCR方法和本室q-PCR方法同時(shí)檢測(cè)19只人工感染小鼠肺組織樣本，IM1、IM2、IM7、IM8、IM10、IM12、IM13結(jié)果均為陽性，其他12個(gè)樣本均為陰性，2種方法檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。

2.5.3用于ICLAS國際比對(duì)樣本的檢測(cè)：利用建立的方法對(duì)2016—2019年連續(xù)4年ICLAS組織的國際比對(duì)待檢RNA病毒樣本和待檢未知RNA或DNA病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示2016—2019年的5個(gè)待檢RNA病毒樣本和2018年的1個(gè)待檢未知RNA或DNA病毒樣本，PVM檢測(cè)結(jié)果均為陰性。電泳結(jié)果圖均略。

2019年2個(gè)RNA病毒樣本52-6、52-8經(jīng)引物2建立的方法檢測(cè)，電泳結(jié)果顯示2個(gè)樣本均有約249 bp目的條帶產(chǎn)生，電泳結(jié)果見圖14。2個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI BLAST與GenBank 中PVM序列進(jìn)行比對(duì)(圖15)，結(jié)果顯示52-8為非特異擴(kuò)增到的小鼠基因組。52-6樣本為特異性擴(kuò)增，且與GenBank中PVM標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列同源性為100%。經(jīng)驗(yàn)證確定52-6樣本為小鼠肺炎病毒，與ICLAS預(yù)期結(jié)果一致。

圖14 引物2檢測(cè)ICLAS實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)估樣本52-6、52-8電泳結(jié)果M：100 bp DNA marker；1：PVM；2：BHK21 cells；3：52-6；4：52-8Fig.14 The electrophoresis results of primer 2 for detection laboratory performance evaluation specimens 52-6 and 52-8 provided by ICLAS

2個(gè)樣本擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果通過NCBI BLAST與GenBank 中PVM序列進(jìn)行比對(duì)(圖15)，結(jié)果顯示52-8為非特異擴(kuò)增到的小鼠基因組。52-6樣本為特異性擴(kuò)增，且與GenBank 中PVM標(biāo)準(zhǔn)株核苷酸序列同源性為100%。經(jīng)驗(yàn)證確定52-6樣本為小鼠肺炎病毒，與ICLAS預(yù)期結(jié)果一致。

圖15 ICLAS能力評(píng)估樣本52-6擴(kuò)增產(chǎn)物與PVM標(biāo)準(zhǔn)株比對(duì)結(jié)果Fig.15 The comparison results of amplification products of ICLAS performanceevaluation specimen 52-6 with PVM standard strains

3 討論

PVM于1940年由Hor-sfall和Hahn首次分離[7]，吳惠英等[8]在我國首次分離得到1株鼠肺炎病毒。PVM在實(shí)驗(yàn)小鼠中感染該病毒比較普遍, 美國的實(shí)驗(yàn)鼠群中有50%被感染，吳惠英等[8]調(diào)查了實(shí)驗(yàn)鼠群中PVM抗體, 證實(shí)與國外報(bào)道一致。趙雅靜等[2]對(duì)開放飼養(yǎng)鼠群中50份小鼠血清樣本行檢測(cè)，PVM感染率30%；王吉等[9]對(duì)2003～2007年我國實(shí)驗(yàn)小鼠病毒抗體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)PVM抗體陽性率為0.51%。葛文平等[10]檢測(cè)不同廠家SPF小鼠，結(jié)果顯示PVM抗體陽性率為3.125%。吳瑞可等[11]對(duì)廣東省2014—2016年普通級(jí)豚鼠進(jìn)行病毒抗體監(jiān)測(cè),發(fā)現(xiàn)普通級(jí)豚鼠PVM抗體陽性率為20%。以上結(jié)果均說明PVM在我國嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物群中依然廣泛存在。

同時(shí)PVM不僅是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國家標(biāo)準(zhǔn)SPF小鼠、大鼠、豚鼠、地鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及沙鼠地方標(biāo)準(zhǔn)要求的必檢項(xiàng)目之一[12-14]，也是《中國藥典》2020年版 三部“生物制品生產(chǎn)及檢定用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制”要求生物制品生產(chǎn)用和檢定用SPF小鼠、生物制品生產(chǎn)用SPF地鼠、生物制品生產(chǎn)用長(zhǎng)爪沙鼠、生物制品檢定用SPF豚鼠要求必須排除的項(xiàng)目[15]，而且還是ICLAS國際實(shí)驗(yàn)室能力評(píng)價(jià)大小鼠檢測(cè)項(xiàng)目范圍之內(nèi)的病毒項(xiàng)目。因此PVM的監(jiān)測(cè)在嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量控制中依然重要。

本研究建立的PVM RT-PCR方法特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示與同科的SV和嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物易感的與HV、LCMV、Reo3均無交叉反應(yīng)；敏感性結(jié)果顯示檢測(cè)最小DNA模板濃度可達(dá)8.77×102拷貝/μL；穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示方法穩(wěn)定性至少可達(dá)12個(gè)月；說明建立的方法特異、敏感、穩(wěn)定、可靠。在可應(yīng)用性方面，(1)用建立的方法檢測(cè)日常送檢測(cè)的27只小鼠(7只清潔級(jí)小鼠和20只SPF級(jí)小鼠)、9只大鼠(SPF級(jí))、5只沙鼠(清潔級(jí))肺組織樣本結(jié)果均為陰性，實(shí)驗(yàn)室同時(shí)采用ELISA方法對(duì)同41只動(dòng)物進(jìn)行PVM抗體檢測(cè)，結(jié)果均為陰性。說明上述動(dòng)物確實(shí)無PVM感染。(2)用建立的方法檢測(cè)19只滴鼻感染的小鼠，擴(kuò)增的陽性產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證證明1、2、7、8、10、12、13號(hào)小鼠PVM檢測(cè)結(jié)果為陽性；為驗(yàn)證方法的可信度，以避免假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)同時(shí)用q-PCR 方法檢測(cè)了19只人工感染的小鼠肺組織樣本，結(jié)果顯示2種方法檢測(cè)結(jié)果符合率為100%，說明建立的方法檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。從檢測(cè)結(jié)果看，動(dòng)物在感染后第3、7、9天時(shí)能從肺組織內(nèi)檢測(cè)到病毒，在感染后第5、14、18天未檢測(cè)到病毒。至于PVM在動(dòng)物體內(nèi)感染和存在的規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。(3)用建立的方法對(duì)2016—2019年ICLAS組織的國際比對(duì)大鼠、小鼠易感待檢RNA病毒樣本和未知RNA或DNA病毒樣本進(jìn)行檢測(cè)，通過電泳結(jié)果及對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，證明只有2019年52-6樣本為PVM，與ICLAS提供的預(yù)期結(jié)果相符。說明建立的方法特異、敏感、檢測(cè)結(jié)果可靠，可用于動(dòng)物、動(dòng)物感染樣本和國際比對(duì)樣本的檢測(cè)。

PCR技術(shù)以其簡(jiǎn)便、快速、特異、敏感及可通過對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證防止假陽性結(jié)果出現(xiàn)的特點(diǎn)，依然是臨床檢驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的一種可靠手段。雖然國內(nèi)已有PVM核酸檢測(cè)方法建立的相關(guān)報(bào)道[16]，但均沒有推廣應(yīng)用。本研究建立的PVM PCR方法不僅可以作為實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)資源儲(chǔ)備用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)及相關(guān)樣本的檢測(cè)，也為試劑盒的研制及技術(shù)的推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。