碳酸酐酶在紅細胞分化發(fā)育過程中的功能研究

吳靜， 張英楠， 徐長祿， 劉金花， 石莉紅

中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學科學院血液學研究所），北京協(xié)和醫(yī)學院，實驗血液學國家重點實驗室；國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學研究中心；細胞生態(tài)海河實驗室，天津 300020

截至目前，輸血仍是臨床實踐中不可或缺的一種治療方法。根據(jù)前期的研究數(shù)據(jù)，在62個國家中，血液供應(yīng)幾乎全部（99.9%以上）來源于無償獻血［1］，但是由于人口老齡化，未來50年內(nèi)老年人（大于65歲）的數(shù)量會迅速增加，需要輸血的人數(shù)會隨之增加，同時由于全球生育率的下降，符合獻血資格的捐獻者會進一步減少［2］，需要輸血者和血液捐獻者之間的數(shù)量不平衡會造成血液制品的供應(yīng)不足，促使人們探究在體外進行紅細胞的誘導(dǎo)分化和擴增。但是，在體外誘導(dǎo)各種干細胞或紅系前體細胞分化為成熟紅細胞的過程中，脫核效率低是一個非常普遍的問題［3］，這為體外紅細胞的生產(chǎn)增加了難度。所以，為了解決這些難題，體外紅細胞擴增和分化相關(guān)的機制研究顯得至關(guān)重要。

碳酸酐酶 1（carbonic anhydrase 1，CA1）和碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 1，CA2）屬于碳酸酐酶CA（carbonic anhydrase）家族成員。在人類細胞中一共有16種CA同工酶表達，它們具有不同的細胞/組織定位和酶學特征［4］。CA是一種催化二氧化碳可逆性水合的含鋅酶［5］，這一反應(yīng)對于許多生理過程都至關(guān)重要，其中包括pH和碳酸氫鹽穩(wěn)態(tài)的維持、呼吸、骨代謝和腫瘤發(fā)生［6］。在人類紅細胞中主要存在碳酸酐酶1和碳酸酐酶2這兩種同工酶，而且其表達量僅次于血紅蛋白［7］，但目前在紅細胞中有關(guān)CA1和CA2的研究主要集中在其二氧化碳水合功能，關(guān)于其在紅系分化中的功能研究還相對不足。

紅細胞是在哺乳動物的胚胎發(fā)育過程中最早產(chǎn)生的一種血細胞類型，對胚胎的整個發(fā)育具有重要的支持作用。成年期的紅細胞生成主要可分為3個階段：第一階段（早期紅系分化）是指造血干細胞向紅系祖細胞［BFU-E（burst forming uniterythroid）和CFU-E（colony forming unit-erythroid）］分化的階段；第二階段（終末期紅系分化）指紅系終末分化和晚期紅細胞的去核過程，包括原始紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞；第三階段（成熟階段）主要指網(wǎng)織紅細胞向成熟紅細胞的發(fā)育階段［8］。另外，紅系分化整個過程會伴隨著一系列的變化，包括細胞體積的縮小、血紅蛋白類型的轉(zhuǎn)化、染色質(zhì)固縮等，由此可見，紅系分化的過程是十分復(fù)雜的，所以研究紅系分化的調(diào)控對體外紅細胞的生成具有非常重要的意義。

為了深入研究CA1和CA2在紅系分化中的功能，本研究在臍帶血來源的CD34+向紅系分化的過程中敲降CA1和CA2的表達，然后通過流式檢測CD71+CD235a+細胞的比例，研究在CA1和CA2被敲降后，CD34+細胞向紅系的分化過程，以期探討CA1和CA2在紅系分化中發(fā)揮的功能。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

流式細胞儀LSR-Ⅱ（美國BD公司）；shRNA質(zhì)粒由擎科生物構(gòu)建（載體為pSIH1-H1-copGFP，shRNA序列見表1）：CD71、CD235a抗體購自BD公司；293T細胞、HEL細胞購自ATCC細胞庫（https：//www.atcc.org/）；CD34+細胞來源于中國醫(yī)學科學院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學科學院血液學研究所）生物樣本庫；FuGENE?HD轉(zhuǎn)染試劑購自Promega公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Opti-MEM減血清培養(yǎng)基、培養(yǎng)基DMEM（Dulbecco′s modified eagle medium）、L-谷氨酰胺、青霉素-鏈霉素抗生素、丙酮酸鈉試劑購自Gibco公司；細胞培養(yǎng)基IMDM（Iscove′s modified dulbecco′s medium）、肌醇、葉酸、硫代甘油、硝酸亞鐵、硫酸亞鐵、氫化可的松（hydrocortisone，HC）、白細胞介素-3（interleukin-3，IL-3）購自Sigma公司；BIT營養(yǎng)液購自StemCell Technologies公司；干細胞因子（stem cell factor，SCF）購自Prospec公司；重組人促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）購自Pro-Tech公司；TRIZol購自Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒購自Applied Biosystems公司；CD34磁珠購自Miltenyi Biotech公司，psPAX2及pMD2.G質(zhì)粒由周家喜研究員課題組惠贈。

表1 本研究shRNA序列Table 1 shRNA sequences in this study

1.2 細胞培養(yǎng)與條件

1.2.1 人臍帶血來源CD34+細胞體外分化培養(yǎng)在第0～8天（Day 0～8），在紅系分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基［9］中加入 SCF（100 ng·mL-1）、EPO（3 UI·mL-1）、IL-3（5 ng·mL-1）、HC（10-6mol·L-1），1% 青霉素-鏈霉素；在第8～14天（Day 8～14），在紅系分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入SCF（100 ng·mL-1）、EPO（3 UI·mL-1）、1%青霉素-鏈霉素［9］。

1.2.2 293T及HEL細胞的培養(yǎng) 293T細胞培養(yǎng)基：DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%FBS、1%青霉素-鏈霉素、1%L-谷氨酰胺、1%丙酮酸鈉；HEL細胞培養(yǎng)基：IMDM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入10%FBS、1%青霉素-鏈霉素。

1.3 慢病毒包裝

1.3.1 用脂質(zhì)體包裝慢病毒 包病毒體系：A液：Opti-MEM 516μL，F(xiàn)uGENE?HD 34.5μL；B液：Opti-MEM 150μL，psPAX23.75μg，pMD2.G 1.25μg，目的質(zhì)粒5μg。A液配制完成后室溫靜置5 min，再與B液混合，二者混勻后室溫靜置15 min，然后加于293T細胞中［10］。

1.3.2 慢病毒濃縮及感染細胞 病毒包裝48 h后收集病毒上清于15 mL離心管中，3 000 r·min-1，4℃離心15 min以去除細胞碎片，收集離心后的病毒上清于無菌病毒管中，置于預(yù)冷的超高速離心機中，20 000 r·min-1，4 ℃離心2 h。離心后獲得的病毒沉淀用DMEM培養(yǎng)基重懸（與病毒上清體積比為1∶100）。并按照細胞數(shù)量加入到HEL及CD34+（分化培養(yǎng)至第4天）細胞懸液中，37℃，1 420 g離心1 h，感染后細胞置于恒溫37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞密度為2×105個·mL-1。

1.4 流式檢測

將細胞從培養(yǎng)皿中取出，離心后棄上清，標記抗人CD71-APC及CD235a-PE抗體，在4℃孵育30 min后，用1×PBS緩沖液洗滌，使用流式細胞儀LSR-Ⅱ進行檢測，檢測結(jié)果通過FlowJo V10（https：//www.flowjo.com/）軟件進行分析。

1.5 RNA提取及RT-qPCR

利用 TRIZol法［11］進行 RNA 提取，然后利用Qiagen公司生產(chǎn)的反轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，并利用Applied Biosystems公司生產(chǎn)的SYBR Green PCR試劑盒進行RT-qPCR。

1.6 統(tǒng)計分析

實驗所得數(shù)據(jù)利用Graphpad Prism 8（https：//www.graphpad-prism.cn/）軟件制作圖表，采用單因素方差分析（One-way analysis of variance，ANOVA）進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準誤（±SEM）表示，以P＜0.05認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 CA1和CA2基因在紅細胞中的表達情況及在紅系分化過程中的變化

基于本團隊前期發(fā)表的人骨髓各譜系血細胞單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［12］發(fā)現(xiàn)，在造血譜系表達的CA家族基因中，大部分基因均表達極低甚至不表達，僅個別基因存在特異性表達現(xiàn)象。其中，CA1和CA2僅在紅細胞中呈現(xiàn)顯著高表達（圖1A），提示CA1和CA2在紅系分化發(fā)育的過程中可能發(fā)揮至關(guān)重要的作用。為了進一步深入探究CA1和CA2在紅系分化發(fā)育過程中的表達情況，借助紅細胞分化發(fā)育各階段的轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)［13］，發(fā)現(xiàn)在整個紅系分化的過程中，CA1和CA2的表達呈現(xiàn)出動態(tài)變化，主要體現(xiàn)為在原始紅細胞向網(wǎng)織紅細胞發(fā)育的過程中，二者都表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，但是在原始紅細胞和早幼紅細胞階段，CA2表達高于CA1，隨著分化的持續(xù)進行，CA1表達逐漸高于CA2（圖1B）。

圖1 CA家族基因在人類各造血細胞中的表達情況及CA1、CA2在紅系分化過程中的動態(tài)變化過程Fig.1 The expression of CA family genes in each human hematopoietic lineage and the dynamic changes of CA1 and CA2 during erythroid differentiation

2.2 CA1和CA2的敲降

為了研究CA1與CA2在紅細胞分化過程中的功能，本研究首先構(gòu)建了二者的敲降載體，針對CA1構(gòu)建了CA1-sh1、CA1-sh2、CA1-sh3 3種shRNA，針對CA2構(gòu)建了CA2-sh1、CA2-sh2兩種shRNA。為了驗證所構(gòu)建的shRNA的敲降效率，在HEL細胞系中進行了CA1和CA2敲降效率的驗證實驗。向處于對數(shù)生長期的HEL細胞中加入慢病毒顆粒，收集感染48 h后的細胞提取RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行RT-qPCR檢測CA1與CA2的敲降效率。實驗結(jié)果表明，與對照Scrambled相比，CA1、CA2在轉(zhuǎn)錄組水平得到了明顯的敲降（圖2）。以上結(jié)果表明，在本實驗體系中，CA1-sh1、CA1-sh2、CA1-sh3以及CA2-sh1、CA2-sh2均具有較好的敲降效果。

圖2 HEL細胞中檢測CA1和CA2的敲降Fig.2 Detection of the CA1 and CA2 knockdown in HEL cells

2.3 CA1在CD34+細胞向紅系分化過程中的作用

CD71和CD235a是常用的紅細胞標記物［14］，CD71主要表達于BFU-E、CFU-E、原始紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞和晚幼紅細胞，CD235a主要表達于原始紅細胞、早幼紅細胞、中幼紅細胞、晚幼紅細胞、網(wǎng)織紅細胞和成熟紅細胞，所以在紅細胞分化成熟的過程中，CD235a的表達量逐漸升高，CD71的表達量逐漸下降［15］。

為了研究體外CA1對CD34+細胞向紅系分化的影響，本研究利用慢病毒系統(tǒng)對CD34+細胞中的CA1進行敲降。從臍帶血中分離CD34+細胞后，用紅細胞體外分化體系進行細胞培養(yǎng)，在分化第4天（Day 4）時進行慢病毒感染，其中Scrambled作為對照組。在分化第8天（Day 8）、第11天（Day 11）和第14天（Day14）時分別利用流式細胞儀檢測CD71與CD235a的表達情況（圖3A～B），并使用FlowJo V10和Graphpad Prism 8對結(jié)果進行分析（圖3C～D）。流式結(jié)果顯示，在敲降CA1的Day11開始，CD71+CD235a+細胞的比例明顯下降（圖3B）。該結(jié)果提示CA1表達的缺陷抑制了CD34+細胞向紅系分化，而且主要在紅系分化的后期發(fā)揮作用，這與CA1在紅系分化中的動態(tài)表達數(shù)據(jù)是一致的（圖1B）。此外，CD71-CD235a-細胞的比例從Day8開始出現(xiàn)升高（圖3D），提示在CD34+細胞分化的早期階段也可能存在阻滯。

圖3 CA1的敲降對CD34+細胞分化的影響Fig.3 The effect of CA1 knockdown on differentiation of CD34+cells

2.4 CA2在CD34+細胞向紅系分化過程中的作用

為了研究CA2對CD34+細胞向紅系分化的影響，本研究同樣采用2.3的方法對CA2的表達進行敲降，并在Day 8、Day 11和Day 14時流式檢測CD71+CD235a+細胞的比例（圖4A）。結(jié)果顯示，CA2的表達水平降低后CD71+CD235a+細胞的比例在Day 8、Day 11和Day 14均具有較明顯的下降趨勢（圖4B），由此提示CA2表達的降低將紅細胞的分化阻滯在了原始紅細胞階段，與CA1相比，CA2在紅系分化的更早階段即原始紅細胞階段便已經(jīng)開始發(fā)揮作用，這一結(jié)論也與紅系分化早期CA2的表達高于CA1的結(jié)果保持一致（圖1B）。同時與CA1相似，敲降CA2后，CD71-CD235a-細胞的比例在Day 8、Day 11和Day 14也具有較明顯的增加（圖4C），提示CA2的敲降對CD34+細胞早期階段的分化也可能具有阻滯作用。

圖4 CA2的敲降對CD34+細胞分化的影響Fig.4 The effect of CA2 knockdown on differentiation of CD34+cells

3 討論

體外人工誘導(dǎo)紅細胞生成主要有3種不同的干細胞來源：造血干細胞、胚胎干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞［16］，本研究中體外分化的紅細胞來源于臍帶血中CD34+造血干細胞，這是在紅細胞分化相關(guān)研究中比較常用的一種細胞來源［17］，與其他幾種干細胞來源相比，臍帶血來源CD34+細胞具有更加明顯的優(yōu)勢，因為它們在向紅細胞誘導(dǎo)分化的過程中更容易實現(xiàn)脫核。

本研究主要探究了碳酸酐酶家族成員CA1和CA2對紅系分化的調(diào)控作用。碳酸酐酶于20世紀30年代被發(fā)現(xiàn)，它在各種疾病的病理生理學中都發(fā)揮了重要作用，如溶血性貧血、青光眼、腎小管酸中毒、骨質(zhì)疏松癥、神經(jīng)性疼痛、結(jié)直腸癌等［18-19］，但其在紅系分化中調(diào)控功能的研究仍不夠深入。已有研究表明，在小鼠紅白血病細胞系和人紅白血病細胞系中，CA1和CA2僅在分化起始時有較高的表達水平，而在正常人的紅系祖細胞中，CA1和CA2的表達水平隨著細胞分化的進行有上升趨勢［20］。另有研究表明，在小鼠紅白血病細胞系中，CA1的過表達可以抑制小鼠紅白血病細胞系細胞分化并使它們保持在增殖狀態(tài)，其中CA1可能作為c-Myb下游分子發(fā)揮作用［21］。所以CA1和CA2可能在正常紅系分化和紅白血病細胞系的分化過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。現(xiàn)有研究表明，GATA1是紅細胞生成過程中非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，它可在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)紅細胞的成熟和功能［22］，因此，CA1和CA2是否也在GATA1的調(diào)控下在紅系發(fā)育中發(fā)揮功能，還有待進一步研究。本研究利用shRNA技術(shù)［23-25］在人臍帶血來源CD34+細胞體外向紅系誘導(dǎo)分化過程中對CA1和CA2進行敲降，通過流式細胞儀檢測紅系特異性標志物評估細胞的分化效率，結(jié)果顯示，CA1和CA2的敲降明顯抑制了紅系的分化，而且二者發(fā)揮作用的時間有所不同，CA1敲降后CD71+CD235a+細胞的比例在Day 11和Day 14具有明顯的下降，CA2敲降后CD71+CD235a+細胞的比例在Day 8、Day 11和Day 14均具有明顯的下降。

綜上，本研究證明了CA1和CA2對紅系分化均具有重要調(diào)控作用，其中CA1主要在紅系分化的后期發(fā)揮較強的調(diào)控作用，CA2則在原始紅細胞階段便已開始發(fā)揮作用，這一發(fā)現(xiàn)將為紅系分化調(diào)控的后續(xù)研究提供重要的理論依據(jù)，但是，CA1和CA2調(diào)控紅系分化的具體機制以及碳酸酐酶家族的其他成員是否也參與了紅系分化的調(diào)控還需要更進一步探索。