五味子藤莖木脂素對小鼠鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用研究

陳紅旭，苑麗葳，張竣雄，王文欣，劉佳樂，王春梅，孫靖輝，張成義，李 賀，陳建光,

（1.北華大學(xué)藥學(xué)院，吉林吉林 132000；2.吉林市中心醫(yī)院，吉林吉林 132000）

長期失眠對人體身心健康十分不利[1]。中藥治療失眠在古籍中多有記載[2-3]。以中藥提取物及其活性成分為對象，研究其鎮(zhèn)靜催眠作用及相關(guān)機(jī)制，已成為研究熱點[4]。五味子（Schisandra chinensis），始收錄于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品中藥，具有極高的藥用價值[5]。木脂素作為其主要活性成分之一，其抗疲勞、抗衰老、抗炎、保肝、鎮(zhèn)咳等功效已被廣泛研究[6-12]。本課題組前期研究表明，五味子木脂素具有顯著的鎮(zhèn)靜、催眠及抗焦慮作用[13-15]?！吨袊幍洹分幸?guī)定五味子果實部位為入藥部位[16]，并且可用作保健食品的原料。目前，在我國最為廣泛使用的保健食品原料中，有9 種為傳統(tǒng)中藥，分別為五味子、酸棗仁、茯苓、靈芝、天麻、刺五加、珍珠、遠(yuǎn)志和百合[17]。其中，五味子在種植時，為了提高果實的產(chǎn)量和品質(zhì)，藤莖作為非藥用部位需要減掉30%～40%，其中一部分用作調(diào)料粉在餐桌上被使用，絕大多數(shù)則直接被丟棄[18]。研究表明，五味子藤莖的木脂素含量較果實偏低，但其化學(xué)成分與果實相似，提示五味子藤莖木脂素有可能具有與五味子果木脂素相似的功效[19]。目前，關(guān)于五味子藤莖木脂素鎮(zhèn)靜催眠作用的研究尚無任何報道。因此，本研究以課題組前期工作中五味子果木脂素的功效研究為基礎(chǔ)，按照《中國藥典》中規(guī)定五味子木脂素測定標(biāo)志物醇甲含量為基準(zhǔn)，設(shè)定五味子藤莖木脂素的給藥劑量，觀察其鎮(zhèn)靜、催眠及抗焦慮作用，以期為非藥用部位資源的利用提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)安全有效的鎮(zhèn)靜催眠藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

五味子藤莖總木脂素（Schisandra chinensisvine stem lignans，SSL） 經(jīng)高效液相色譜法檢測其五味子醇甲含量為0.14 mg/mL，北華大學(xué)五味子開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化工程研究中心提供；羧甲基纖維素鈉、戊巴比妥鈉 北京化學(xué)試劑公司；地西泮（Diazepam，DAP）山東信誼制藥有限公司；小鼠γ-氨基丁酸（γaminobutyric acid，GABA）ELISA 試劑盒、谷氨酸（glutamate，Glu）ELISA 試劑盒 上海酶聯(lián)生物科技有限公司。清潔級ICR 小鼠 體重（20±2）g 雄性，動物許可證編號：SCXK（吉）-2020-0001，長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司提供。

ZZ-6 小鼠自主活動測試儀、PMT-100 高架十字迷宮、ZMT-100 高架零迷宮 成都泰盟科技有限公司；手持組織勻漿機(jī) 上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；全自動酶標(biāo)儀 瑞士Tecan 集團(tuán)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組 實驗流程嚴(yán)格遵守《實驗動物的護(hù)理和使用指南》,并獲得北華大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會（IACUC）的批準(zhǔn)。ICR 小鼠150 只，平均隨機(jī)分組，每組30 只。因木脂素為脂溶性物質(zhì)，故以5%的羧甲基纖維素鈉水溶液作為溶媒將木脂素制成不同濃度的混懸液，將小鼠分為空白對照組（CON，5%羧甲基纖維素鈉溶液灌胃）、藤莖木脂素低劑量組（SSL（L），37.5 mg/kg）、中劑量組（SSL（M），75 mg/kg）、高劑量組（SSL（H），150 mg/kg）、地西泮陽性對照組（地西泮，4 mg/kg）。分籠飼養(yǎng)，自由飲水、飲食，室溫20～25 ℃。每天灌胃1次，每次0.1 mL/10 g，連續(xù)7 d。1～10 號小鼠于實驗第5 d 進(jìn)行小鼠自主活動檢測，第6 d 進(jìn)行高架十字迷宮及零迷宮檢測，第7 d 進(jìn)行戊巴比妥鈉閾下劑量協(xié)同睡眠試驗；11～20 號小鼠于實驗第7 d 進(jìn)行閾劑量協(xié)同睡眠試驗；21～30 號小鼠于實驗第7 d 麻醉處死小鼠后迅速取出腦組織，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.2.2 SSL 對小鼠自主活動的影響 小鼠于實驗第5 d 灌胃40 min 后進(jìn)行試驗，記錄小鼠5 min 內(nèi)站立以及活動次數(shù)，每組實驗結(jié)束后噴灑酒精除去氣味后方可進(jìn)行下一組實驗。

1.2.3 SSL 對小鼠抗焦慮作用的影響 小鼠于實驗第6 d 灌胃40 min 后進(jìn)行試驗。

1.2.3.1 SSL 對小鼠高架十字迷宮行為學(xué)的影響將小鼠從高架十字迷宮中心處面向開臂放入。計算小鼠5 min 內(nèi)開臂與在臂滯留時間的比值（OT%）和開臂與在臂進(jìn)入次數(shù)比值（OE%）。實驗完成后噴灑適量酒精除去氣味后再放入下一只小鼠。

1.2.3.2 SSL 對小鼠高架零迷宮行為學(xué)的影響 將小鼠從高架零迷宮面向閉合臂放入。計算小鼠在5 min內(nèi)平臺邊緣探頭次數(shù)百分率（OP%）、進(jìn)入開臂的次數(shù)百分率（OE%）。實驗結(jié)束后噴灑適量酒精除去氣味后再放入下一只小鼠。

1.2.4 SSL 對戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠的影響

1.2.4.1 閾下劑量戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗 于實驗第7 d 灌胃給藥40 min 后將1～10 號小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉37.5 mg/kg。記錄30 min 內(nèi)小鼠翻正反射消失60 s 的只數(shù)，即為30 min 內(nèi)各組小鼠入睡的只數(shù)。

1.2.4.2 閾劑量戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗 于實驗第7 天另取11～20 號小鼠，于灌胃給藥40 min 后腹腔注射戊巴比妥鈉49.5 mg/kg。計算小鼠的睡眠潛伏期（入睡時間-注射時間）和睡眠時長（睡醒時間-入睡時間）。

1.2.5 小鼠腦組織中GABA、Glu 含量測定 在末次給藥40 min 后，將21～30 號小鼠斷頸處死，于裝滿冰塊的燒杯中快速取出大腦，用4 ℃生理鹽水洗凈并擦干后高速勻漿并分離上清液。（1:4 加入生理鹽水，4 ℃，離心10 min），檢測按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.6 小鼠腦組織中GABAAα1受體表達(dá)水平檢測使用Western Bolt 法檢測，取小鼠腦組織約50 mg于1.5 mL EP 管中，加入（RIPA 裂解液:PMSF=9:1）的混合溶液450 μL，置于-20 ℃裂解1 h，4 ℃，12000 r/min 離心10 min 后取上清，蛋白含量使用BCA試劑盒測定。10% SDS-PAGE 電泳分離GABAAα1后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，取出膜在Tris 緩沖液中在搖床上漂洗5 min，然后用5%脫脂奶粉的TBS-T 緩沖液中搖床上封閉1 h。室溫孵育后舍棄奶粉溶液。加入一抗（GABAAα1, 1:1000），內(nèi)參為GAPDH（兔抗GAPDH, 1:5000），4 ℃過夜孵育，第二日用TBST 緩沖溶液清洗3次（每次10 min），加入二抗（1:2000）室溫在搖床上孵育2 h, TBS-T 緩沖溶液清洗3次（每次10 min），最后加入ECL 發(fā)光液顯色。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以Mean±SD 表示，使用SPSS 軟件（SPSS 20.0）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用最小顯著差異法t檢驗，P＜0.05即有統(tǒng)計學(xué)意義。Weastern Bolt 條帶分析使用Image J 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSL 對小鼠自主活動的影響

小鼠自主活動實驗是一種常用的藥物鎮(zhèn)靜作用檢測方法，其中的活動次數(shù)和站立次數(shù)是常用的評價指標(biāo)，與小鼠中樞神經(jīng)的興奮程度成正相關(guān)[20-22]。結(jié)果如圖1所示，與CON 組相比，SSL（M）、SSL（H）以及DAP 組小鼠活動次數(shù)顯著減少（P＜0.05 或P＜0.01），SSL 各組及DAP 組小鼠站立次數(shù)極顯著減少（P＜0.01），其中SSL 組間比較結(jié)果顯示SSL（H）較SSL（L）組小鼠站立次數(shù)顯著減少（P＜0.05）。以上結(jié)果提示SSL 具有鎮(zhèn)靜作用。

圖1 SSL 對小鼠自主活動的影響（n=10，mean±SD）Fig.1 Effects of cane lignans from Schisandra chinensis on autonomous activities of mouse (n=10，mean±SD)

2.2 SSL 對小鼠抗焦慮作用的影響

2.2.1 SSL 對小鼠高架十字迷宮行為學(xué)的影響 高架十字迷宮實驗是檢測小鼠焦慮水平常用的實驗方法[23]，開臂與在臂進(jìn)入次數(shù)比值（OE%）及開臂與在臂滯留時間的比值（OT%）常作為評價焦慮程度的直接指標(biāo)[24]。由圖2可知，與CON 組比較，SSL（M）、SSL（H）及DAP 組小鼠OE%及OT%均極顯著增加（P＜0.01），SSL 各給藥組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.01）。以上結(jié)果提示SSL 具有抗焦慮作用。

圖2 SSL 對小鼠高架十字迷宮行為學(xué)的的影響（n=10，mean±SD）Fig.2 Effects of cane lignans from Schisandra chinensis on the behavior of anxious mouse with elevated plus maze（n=10，mean±SD）

2.2.2 SSL 對小鼠高架零迷宮行為學(xué)的影響 高架零迷宮實驗也是檢測動物焦慮水平常用的實驗方法之一，與十字迷宮原理相同，常把OE%和開臂探頭次數(shù)比例（OP%）作為評價指標(biāo)[25]。本實驗研究結(jié)果由圖3可知，與CON 比較，SSL（M）、SSL（H）以及DAP 組小鼠OE%及OP%均顯著增加（P＜0.05 或P＜0.01）。SSL 各給藥組間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.01）。該結(jié)果進(jìn)一步驗證了高架十字迷宮的實驗結(jié)果，提示SSL 具有抗焦慮作用。

圖3 SSL 對小鼠高架零迷宮行為學(xué)的的影響（n=10，mean±SD）Fig.3 Effect of SSL on the behavior of elevated zero maze in mice (n=10, mean±SD)

2.3 SSL 對戊巴比妥鈉對小鼠協(xié)同睡眠實驗的影響

戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠試驗是觀察藥物催眠作用的經(jīng)典試驗[26]。戊巴比妥鈉閾下劑量協(xié)同睡眠實驗結(jié)果如表1所示，空白對照組的睡眠只數(shù)為1 只，SSL（L）組睡眠只數(shù)為3 只，SSL（M）組睡眠只數(shù)為6 只，SSL（H）組的睡眠只數(shù)為7 只，DAP 組的睡眠只數(shù)為10 只。

表1 SSL 對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠只數(shù)的影響Table 1 Effects of cane lignans from fructus Schisandra chinensis on the sleep number of mouse induced by subthreshold dose of pentobarbital sodium

戊巴比妥鈉閾劑量協(xié)同睡眠實驗結(jié)果如圖4所示，與CON 組相比，各SSL 組及DAP 組小鼠睡眠潛伏期均極顯著縮短（P＜0.01），SSL 各給藥組間比較結(jié)果顯示，SSL（H）組較SSL（M）及SSL（L）組小鼠睡眠潛伏期顯著縮短（P＜0.05 或P＜0.01）；與CON 組相比，各SSL 組及DAP 組小鼠睡眠時間均極顯著縮短（P＜0.01），其中SSL（H）組較SSL（L）組小鼠睡眠睡眠時間極顯著延長（P＜0.01）；各給藥組間比較顯示睡眠時間顯著延長（P＜0.05）。以上結(jié)果提示SSL 具有催眠作用，且隨著劑量的增加，催眠效應(yīng)明顯增強(qiáng)。

圖4 SSL 對閾劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時間的影響（n=10，mean±SD）Fig.4 Effects of Schisandra chinensis lignans on sleep time in mouse induced by threshold dose of pentobarbital sodium(n=10，mean±SD)

2.4 SSL 對小鼠腦組織中GABA、Glu 含量的影響

睡眠與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的眾多神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)及神經(jīng)遞質(zhì)密切相關(guān)[27]。Glu 和GABA 是中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的主要調(diào)節(jié)遞質(zhì)，GABA 是抑制性遞質(zhì)，由Glu 脫羧生成，主要通過與 GABAA受體結(jié)合，從而發(fā)揮作用，其在缺乏時會導(dǎo)致焦慮情緒的產(chǎn)生。Glu 是興奮性遞質(zhì)，在CNS 含量較高。但是由于機(jī)體代謝水平以及環(huán)境的不停變化，少部分的Glu 才具有神經(jīng)遞質(zhì)的功能，所以Glu 含量不能完全判斷神經(jīng)功能的興奮或抑制狀態(tài)[28]。能客觀評價中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能興奮和抑制程度的指標(biāo)通常為GABA/Glu 的比值[29-30]。本研究應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗對各組小鼠腦組織GABA 和Glu 含量進(jìn)行檢測。結(jié)果如圖5所示：與CON 組相比，SSL 各劑量給藥組小鼠GABA 含量極顯著升高（P＜0.01），SSL（M）及SSL（H）組小鼠Glu 含量極顯著降低（P＜0.01)，SSL 各組GABA/Glu比值均極顯著升高（P＜0.01）。對上述各指標(biāo)SSL 不同給藥劑量組組間比較結(jié)果顯示，SSL（M）組較SSL（L），SSL（H）組較SSL（M）及SSL（L）均具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01，P＜0.05）。以上結(jié)果提示SSL 能夠增高小鼠腦組織GABA 含量，降低Glu 含量，升高GABA/Glu 的比值，且隨著SSL 劑量的增加，該效應(yīng)逐漸增強(qiáng)。該結(jié)果提示SSL 的催眠作用可能與其調(diào)節(jié)小鼠腦組織GABA/Glu 的比值有關(guān)，且該作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系。

圖5 SSL 對小鼠腦組織中GABA、Glu 含量的影響（n=10，mean±SD）Fig.5 Effects of cane lignans from fructus Schisandra chinensis on the contents of GABA, Glu in brain tissues of mouse (n=10, mean±SD)

2.5 高劑量SSL 對小鼠腦組織中GABAAα1 蛋白表達(dá)的影響

作為GABAA受體重要亞型之一的GABAAα1，被激活時可抑制神經(jīng)遞質(zhì)的興奮作用，從而達(dá)到鎮(zhèn)靜、催眠作用[31-32]。為了進(jìn)一步探討SSL 對中樞神經(jīng)鎮(zhèn)靜催眠等抑制作用的機(jī)制，本研究選擇效應(yīng)最明顯的SSL（H）組小鼠，應(yīng)用Western Blot 方法對GABAAα1表達(dá)水平進(jìn)行觀察。對本研究結(jié)果如圖6 和表2所示，與CON 組比較，SSL 組小鼠腦組織GABAAα1蛋白表達(dá)水平極顯著增加（P＜0.01）。本結(jié)果提示SSL的鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用可能與其上調(diào)小鼠腦組織GABAAα1水平有關(guān)。

圖6 小鼠腦組織中GABAAα1 蛋白表達(dá)電泳Fig.6 GABAAα1 protein expression electrophoresis in mouse brain tissue

表2 小鼠腦組織GABAAα1 蛋白表達(dá)（n=3，mean±SD）Table 2 Expression of GABAAα1 protein in mouse brain tissue(n=3, mean±SD)

3 結(jié)論

本實驗選用低、中、高三個劑量對SSL 的鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用進(jìn)觀察，研究結(jié)果顯示，給予SSL 后，自主活動檢測中小鼠的站立次數(shù)、活動次數(shù)均有所減少；高架十字迷宮及零迷宮的檢測中小鼠OE%、OT%及OP%明顯增加；戊巴比妥鈉協(xié)同睡眠實驗中小鼠睡眠只數(shù)增加，睡眠潛伏期明顯減少并且睡眠時長明顯增加，提示SSL 具有鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用。對小鼠腦組織中GABA 及Glu 含量及GABAAα1受體表達(dá)水平檢測結(jié)果顯示，SSL 能夠明顯提高GABA/Glu 的比值，增加GABAAα1表達(dá)水平，這可能是SSL 發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠抗焦慮作用的主要機(jī)制之一。本研究明確了SSL 對小鼠的鎮(zhèn)靜催眠及抗焦慮作用，為五味子非藥用部位資源的利用提供理論基礎(chǔ)，為開發(fā)安全有效的鎮(zhèn)靜催眠藥物提供實驗依據(jù)。