乙酰甲喹注射液含量測定方法的建立及方法對比

高 婷，李應(yīng)超，劉 鈞，杜繼紅，張小飛，周艷飛，周保騰，鞏 浩，秦俊杰，王亞芳★

（1.北京市獸藥飼料監(jiān)測中心 102629；2.北京生泰爾科技股份有限公司 102629）

乙酰甲喹屬于喹噁啉類合成抗菌藥，具有廣譜抗菌活性，對革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)于陽性菌，對仔豬黃痢、白痢、犢牛副傷寒、雞大腸桿菌均有效，主要用于密螺旋體所致豬痢疾及細(xì)菌性腸炎[1-3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)喹噁林類藥物在動物體內(nèi)代謝后會產(chǎn)生毒性較大的代謝物，會對組織造成一定的毒性損害，進(jìn)而有致畸、致癌、致突變的風(fēng)險，因此建立一種穩(wěn)定的乙酰甲喹注射液含量測定方法具有重要的意義[4-6]。

目前乙酰甲喹注射液含量測定標(biāo)準(zhǔn)為：精密量取本品適量（約相當(dāng)于乙酰甲喹0.2 g）置分液漏斗中，用三氯甲烷振搖提取四次（40、30、30、30mL），合并三氯甲烷，低溫蒸干，殘?jiān)哟佐?0mL，振搖使溶解，加結(jié)晶紫指示液1滴，用高氯酸（0.1 mol/L）滴定至溶液顯黃綠色，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正[7]。上述方法為非水滴定法，處理步驟繁瑣，對人員操作水平及經(jīng)驗(yàn)要求較高，提取過程中容易增大誤差，方法專屬性不強(qiáng)[8-10]。為統(tǒng)一相同組分獸藥檢驗(yàn)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，使檢驗(yàn)流程更加標(biāo)準(zhǔn)化、科學(xué)化，參照乙酰甲喹原料藥及乙酰甲喹片含量測定項(xiàng)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，修訂乙酰甲喹注射液含量測定項(xiàng)。本實(shí)驗(yàn)采用紫外-可見分光光度法測定乙酰甲喹注射液的含量，并對該方法精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收等結(jié)果進(jìn)行考察，考察結(jié)果符合要求。方法簡便、快速、環(huán)境友好，可為獸藥產(chǎn)品質(zhì)量檢測部門提供科學(xué)的技術(shù)方法與依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)，型號SHIMADZU UV-2450

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及樣品

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑：①乙酰甲喹對照品，來源/批號/規(guī)格：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所/K0111704/100.0%；②甲醇，來源/批號/規(guī)格：Fisher Chemical/203196/99.9%；③鹽酸，來源/批號/規(guī)格：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司/10011018/36.0%～38.0%；④二甲基甲酰胺，來源/批號/規(guī)格：北京化工廠/20130814/99.5。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品： 《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》（2017年版）中乙酰甲喹注射液共有3個含量規(guī)格：0.5%，2%和5%。本實(shí)驗(yàn)樣品來源為企業(yè)提供及抽檢樣品，共計(jì)9批，其中0.5%規(guī)格有2批，為以下編號①和②，2%規(guī)格有3批，為以下編號③、④和⑤，5%規(guī)格有4批，為以下編號⑥、⑦、⑧和⑨。9批樣品覆蓋標(biāo)準(zhǔn)中3個含量規(guī)格。

2 方法

2.1 紫外-可見分光光度法條件

檢測波長：400～200 nm；狹縫寬度：2.0 nm；采樣間隔：0.5 s。

2.2 溶液配制

2.2.1 乙酰甲喹對照品溶液配制 取乙酰甲喹對照品50 mg，精密稱定，置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5mL，置100mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 乙酰甲喹注射液溶液配制 精密量取本品適量（約相當(dāng)于乙酰甲喹50 mg），置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續(xù)濾液5mL，置100mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 精密度考察溶液配制同2.2.1.

2.2.4 穩(wěn)定性及重復(fù)性考察溶液配制同2.2.2

2.2.3 加標(biāo)回收樣品溶液制備 精密量取規(guī)格為0.5%的樣品①5mL，分別精密加入乙酰甲喹對照品20 mg、25mg、30mg；精密量取規(guī)格為2%的樣品④1mL，分別精密加入乙酰甲喹對照品16mg、20mg、24mg，稀釋步驟同2.2.2。

3 結(jié)果與分析

3.1 確定是否有非法添加

根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部169號公告對9批樣品進(jìn)行非法添加篩查，結(jié)論為9批樣品未添加水楊酸。

3.2 確定最大吸收波長

取2.2.1溶液，按照條件2.1，進(jìn)行200～500nm全波段掃描，根據(jù)吸收光度值及波峰位置，確定乙酰甲喹的最大吸收波長為381 nm，圖1為乙酰甲喹對照品溶液的紫外吸收圖譜。

圖1 乙酰甲喹對照品溶液的紫外吸收圖譜

3.3 精密度

取樣品①，按照條件2.1，照紫外-可見分光光度法測定，連續(xù)測定6次，吸光度分別為0.540、0.544、0.545、0.546、0.548、0.547，計(jì)算吸光度RSD值，經(jīng)計(jì)算，RSD值為0.16%。

3.4 穩(wěn)定性

取樣品①，分別于0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h照紫外-可見分光光度法測定，吸光度分別為：0.566、0.566、0.565、0.565、0.567、0.567，計(jì)算含量RSD值，經(jīng)計(jì)算，RSD值為0.16%。

3.5 重復(fù)性

取樣品①共6份，照紫外分光光度法測定，吸光度分別為0.565、0.567、0.564、0.566、0.566、0.564，計(jì)算含量的RSD值，經(jīng)計(jì)算，RSD值為0.20%。

3.6 線性關(guān)系

取乙酰甲喹對照品50 mg，精密稱定，置250mL棕色量瓶中，加二甲基甲酰胺10mL，0.1mol/L鹽酸溶液30mL，振搖使溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取1mL、2mL、3mL、5mL、10mL續(xù)濾液，置100mL棕色量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，照紫外-可見分光光度法測定，以乙酰甲喹對照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，如圖2，線性范圍為2～20μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999。

圖2 乙酰甲喹注射液線性相關(guān)曲線

3.7 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取樣品① 5mL、樣品④ 1mL、樣品⑦ 0.5mL，分別按照樣品含量的80%、100%、120%進(jìn)行加標(biāo)回收，加標(biāo)回收率在97.91%～102.99%范圍內(nèi)，RSD小于2.0%，具體結(jié)果如表1：

表1 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3.8 對9批樣品分別采用非水滴定法和紫外-可見分光光度法計(jì)算含量，具體結(jié)果對比如表2：

表2 兩種方法測定9批樣品結(jié)果及對比

4 討論與結(jié)論

新建立的紫外-可見分光光度法的精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性的RSD值分別為0.165，0.16%，0.2%，線性范圍為2～20μg/mL，線性相關(guān)系數(shù)為0.9999，加標(biāo)回收率為97.91%～102.99%。經(jīng)方法對比發(fā)現(xiàn)，紫外-可見分光光度法測量結(jié)果相對偏差為0%～0.1%，低于該方法相對偏差規(guī)定值1.0%，非水滴定測定結(jié)果相對偏差為0.1%～1.1%，高于該方法相對偏差規(guī)定值0.5%，由此可見，紫外-可見分光光度法穩(wěn)定性高于非水滴定測定法；另外兩種方法平均偏差為0.5%～2.0%，偏差較大，而且非水滴定法含量測定結(jié)果偏低，可能是由于萃取過程及蒸干過程中造成乙酰甲喹物質(zhì)流失。與原標(biāo)準(zhǔn)中非水滴定法相比，該方法簡便、快速、穩(wěn)定，具有環(huán)境友好性。