miRNA-499預(yù)測(cè)心臟術(shù)后新發(fā)心房顫動(dòng)的研究

徐志偉，錢(qián) 龍，黃 蘇

淮安市第一人民醫(yī)院，南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院心臟外科（淮安 223300）

心臟手術(shù)后新發(fā)心房顫動(dòng)(postoperative atrial fibrillation，POAF)的比例較高，尤其是心臟瓣膜手術(shù)[1-2]。據(jù)報(bào)道，POAF 的發(fā)生率為20%～50%。POAF 與多種因素有關(guān)，包括體重指數(shù)[3]、性別、慢性阻塞性肺疾病、瓣膜心臟病[4]、心外膜脂肪組織[5]，以及阻塞性睡眠呼吸暫停[6]等，但確切機(jī)制目前仍不清楚。

MicroRNAs(miRNAs)是一類(lèi)短小非編碼RNA，在細(xì)胞增殖、分化、信息和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[7-8]。人類(lèi)基因組編碼1 000 多個(gè)miRNAs，其中30%在心血管系統(tǒng)中可以檢測(cè)到[9-10]。多種miRNAs參與調(diào)節(jié)心房收縮力、離子通道性能和自律性[11-12]。

部分miRNAs 的異常表達(dá)可能與POAF 有關(guān)，并在其發(fā)病過(guò)程中起關(guān)鍵作用[13-14]。既往研究證實(shí)心臟術(shù)后POAF病人和正常對(duì)照組病人(非POAF)外周血miRNAs表達(dá)量的差異[15]。本研究通過(guò)外周血miRNA-499的表達(dá)差異證實(shí)其對(duì)POAF 的預(yù)測(cè)作用，此外，還評(píng)價(jià)了miRNA-499作為生物標(biāo)志物監(jiān)測(cè)POAF病人使用胺碘酮進(jìn)行治療的有效性。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象

本研究由江蘇省淮安市第一人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有納入本研究的病人均征得知情同意。納入2020年1月至9月接受心臟瓣膜手術(shù)的POAF病人109例。通過(guò)匹配相關(guān)的臨床變量(如年齡、性別)以及臨床特征(如高血壓、體重指數(shù)、心肌梗死、吸煙、左心室射血分?jǐn)?shù)和體外循環(huán))，選擇既往96 名非POAF 心臟瓣膜手術(shù)病人為正常對(duì)照組。POAF 定義為從心臟手術(shù)后即刻開(kāi)始至出院心電監(jiān)護(hù)記錄到房顫持續(xù)時(shí)間＞30 min。所有病人均通過(guò)術(shù)前12導(dǎo)聯(lián)心電圖或者動(dòng)態(tài)心電圖及病史排除既往房顫病史。其他排除標(biāo)準(zhǔn)包括有嚴(yán)重呼吸系統(tǒng)疾病史、神經(jīng)系統(tǒng)疾病史、凝血障礙史、腎或肝功能不全史、目前除β-受體阻滯劑外的抗心律失常藥物治療、左心室射血分?jǐn)?shù)＜35%或急診手術(shù)。

POAF 組用胺碘酮按常規(guī)方案治療術(shù)后新發(fā)POAF。出院前恢復(fù)竇性心律納入胺碘酮治療陽(yáng)性組[胺碘酮（+）]，仍為房顫心律納入胺碘酮治療陰性組[胺碘酮（-）]。胺碘酮按推薦劑量給藥(靜脈負(fù)荷量150 mg，然后0.5～2 mg/min靜脈維持，口服后靜脈用藥逐漸減量，口服200 mg，3 次/d，共5 d，然后改為1 次/d至術(shù)后1月。

1.2 臨床樣本收集

非POAF 病人于術(shù)后24 h 及出院前留取2 次外周靜脈血標(biāo)本，POAF病人于發(fā)生心房顫動(dòng)30 min后及出院前留取2 次外周靜脈血標(biāo)本，其中出院前恢復(fù)竇性心律納入胺碘酮治療陽(yáng)性組[胺碘酮（+）]，仍為房顫心律納入胺碘酮治療陰性組[胺碘酮（-）]。上述標(biāo)本均留取外周靜脈血5 mL，枸櫞酸鈉抗凝，使用miRNeasy Serum/Plasma kit (Qiagen，Redwood City，CA，USA)提取包括miRNA 在內(nèi)的總RNA。所有步驟均在生物安全柜中進(jìn)行，并在冰上進(jìn)行操作，以預(yù)防RNA 降解導(dǎo)致提取的RNA 總量降低。參照既往文獻(xiàn)報(bào)道方法[8]，通過(guò)在每個(gè)血清樣本中添加25 fmol 的cel-miRNA-39(Applied Biosystems，CA，USA)試劑進(jìn)行均一化，以降低RNA 提取過(guò)程中樣品變異問(wèn)題對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響。上述具體操作參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)

RT-PCR進(jìn)一步檢測(cè)miRNA-499的表達(dá)水平。參照試劑盒(Bioteke，Beijing，China)說(shuō)明進(jìn)行。加入SYBR Green PCR Master Mix (Applied BiStudioystems，USA)，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。RT-PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃，10 min 預(yù)變性；95 ℃，15 s 變性；60 ℃，1 min 退火延伸，45個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料采用表示，多個(gè)樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析（one way-ANOVA），兩兩比較采用LSD法，兩個(gè)樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)；為探討miRNA-499 作為預(yù)測(cè)標(biāo)志物的潛力，繪制了受試者工作特征(the receiver operating characteristic，ROC)曲線(xiàn)，并通過(guò)靈敏度和特異度計(jì)算曲線(xiàn)下面積(AUC)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料對(duì)比

POAF組病人109例（男40例，女69例），平均年齡(62.6 ± 7.7)歲；非POAF 組病人96 例（男39 例，女57例），平均年齡（60.3±5.1)歲。對(duì)兩組病人的性別、年齡、體重指數(shù)、吸煙、高血壓、心肌梗死、左心室射血分?jǐn)?shù)等參數(shù)進(jìn)行比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，見(jiàn)表1)。POAF 組根據(jù)出院時(shí)心電圖分為胺碘酮（+）組（n=76）和胺碘酮(-)組（n=33）。在推薦劑量下未觀察到胺碘酮的不良反應(yīng)。

表1 POAF組與非POAF組兩組基本臨床資料分析Table 1 Analysis of basic clinical data of POAF group and non-POAF group

2.2 miRNA-499在兩組病人中的比較

在非POAF 組病人中，術(shù)后24 h及出院前miRNA-499 表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；在POAF 組病人中，無(wú)論AF發(fā)生后30 min還是出院前miRNA-499表達(dá)量均較非POAF組病人術(shù)后24 h有明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而胺碘酮(+)組在出院前較AF發(fā)生后30 min的miRNA-499表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；胺碘酮(-)組在AF 發(fā)生后30min及出院前miRNA-499 表達(dá)量的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。和胺碘酮(-)組相比，出院前胺碘酮(+)組miRNA-499 表達(dá)量明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，見(jiàn)表2）。

表2 各組病人外周血miRNA-499表達(dá)的比較（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

表2 各組病人外周血miRNA-499表達(dá)的比較（）Table 2 Comparison of the expression of miRNA-499 in peripheral blood of patients in each group（）

注：a表示出院前非POAE組與胺碘酮（-）組比較

2.3 POAF對(duì)胺碘酮治療的反應(yīng)

POAF組病人中，胺碘酮(+)組miRNA-499表達(dá)水平出院前明顯低于胺碘酮(-)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.636，P=0.009)。此外，ROC 曲線(xiàn)分析顯示，以miRNA-499 的相對(duì)表達(dá)量作為區(qū)分胺碘酮(+)組和胺碘酮(-)組的最佳界值為0.3，其特異度為62%，敏感度為79%(AUC=0.72，P=0.006，見(jiàn)圖1)。

圖1 ROC曲線(xiàn)顯示miRNA-499表達(dá)水平預(yù)測(cè)POAF病人對(duì)胺碘酮的治療效果Figure 1 ROC curve showed that the expression level of miRNA-499 predicted the treatment effect of amiodarone in POAF patients

3 討論

microRNA 是一類(lèi)長(zhǎng)度為18～25 個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，廣泛存在于真核生物中，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等各個(gè)環(huán)節(jié)[16-17]，在生物血漿中高度穩(wěn)定，是一種簡(jiǎn)單、有效的新興生物學(xué)標(biāo)志物[18]。既往研究也證實(shí)陣發(fā)性房顫和持續(xù)性房顫病人表現(xiàn)出不同的miRNA表達(dá)譜[19-20]，能夠?qū)π姆侩娭貥?gòu)產(chǎn)生影響，如miRNA-133、miRNA-1 通過(guò)對(duì)鉀通道基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié)，可能對(duì)心臟電活動(dòng)傳導(dǎo)及節(jié)律產(chǎn)生影響，miRNA-21等參與鈣通道的調(diào)節(jié)[21-23]。

在本研究中，我們比較了POAF病人與非POAF病人外周血中miRNA-499 的表達(dá)，結(jié)果表明POAF 組病人中，無(wú)論胺碘酮(+)組和胺碘酮(-)組miRNA-499的表達(dá)均顯著高于非POAF 組病人。說(shuō)明外周血miRNA-499表達(dá)的上調(diào)與心臟瓣膜術(shù)后POAF 的發(fā)生顯著相關(guān)，可能與鉀通道功能喪失有關(guān)，進(jìn)一步研究或許可以通過(guò)miRNA-499 的表達(dá)預(yù)測(cè)術(shù)后POAF 的發(fā)生。

心臟電生理功能惡化，通過(guò)喪失部分離子通道功能來(lái)促進(jìn)心房重構(gòu)，是維持心房顫動(dòng)的基礎(chǔ)[24-25]，也導(dǎo)致部分持續(xù)性心房顫動(dòng)用胺碘酮治療效果不佳。本研究，評(píng)估了胺碘酮治療的反應(yīng)性，胺碘酮(-)組病人無(wú)論AF 發(fā)生后30 min 還是出院前miRNA-499 表達(dá)量無(wú)明顯變化，與胺碘酮(+)組病人相比，胺碘酮(-)組出院前miRNA-499 表達(dá)量仍明顯升高。ROC 曲線(xiàn)分析表明，miRNA-499預(yù)測(cè)胺碘酮治療反應(yīng)的特異性為62%，敏感性為79% (AUC=0.72)，驗(yàn)證了miRNA-499 可以預(yù)測(cè)胺碘酮對(duì)心臟瓣膜術(shù)后POAF病人的治療效果。

4 結(jié)論

miRNA-499表達(dá)量增加可能有助于臨床判斷心臟術(shù)后POAF的發(fā)生，同時(shí)還可以預(yù)測(cè)胺碘酮對(duì)心臟瓣膜術(shù)后POAF病人的治療效果。

（利益沖突：無(wú)）