超聲彈性成像參數(shù)在浸潤性乳腺癌診斷中的應用及其與組織NKD1、HER-2表達量的關系

連俊，李苗，伍玉容，梁汝娜

安康市中心醫(yī)院超聲科，陜西 安康 725000

浸潤性乳腺癌是發(fā)生于乳腺導管上皮及末端導管上皮組織的惡性腫瘤，以乳房腫塊、乳頭疼痛、內(nèi)陷為常見癥狀。目前多采用超聲等影像學手段進行檢查，但對于微小病變易出現(xiàn)漏診現(xiàn)象。有研究指出，采用超聲彈性成像檢測組織硬度來反映其結構變化，可用于判斷正常組織及病變組織的差別，以達到診斷的目的，或可提高診斷準確度[1]。超聲彈性成像技術的基本原理是對不同硬度組織加以刺激后，會產(chǎn)生不同程度的形變，故可通過觀察組織硬度變化來對腫瘤性質進行鑒別。研究顯示，浸潤性乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程受多種因素影響，且Wnt 信號通路被認為與多種惡性腫瘤的發(fā)生有關[2]。相關報道指出，多種惡性腫瘤均存在Wnt信號通路的異常激活，而裸角質膜同源蛋白(naked cuticle drosophila1，NKD1)是該通路重要的負向調控因子[3]。人表皮生長因子受體-2 (human epidermal growth factor receptor 2，HER-2)是一種與乳腺癌發(fā)生緊密相關的原癌基因，也是該疾病重要的預后和預測性分子標志物。但目前尚無報道明確指出超聲彈性成像參數(shù)與浸潤性乳腺癌患者癌組織NKD1、HER-2 表達的關系。本研究旨在探究超聲彈性成像參數(shù)在浸潤性乳腺癌診斷中的應用價值及其與癌組織NKD1、HER-2表達量的關系，為該疾病的臨床診治提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019 年2 月至2021 年6 月安康市中心醫(yī)院收治的90 例浸潤性乳腺癌患者作為乳腺癌組，以同期收治的68例乳腺良性腫瘤患者作為對照組。(1)納入標準：①乳腺癌組患者符合《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范(2015版)》[4]關于浸潤性乳腺癌的診斷標準，且經(jīng)病理學檢查確診；②對照組患者符合《乳腺增生與良性腫瘤現(xiàn)代診斷治療學》[5]關于乳腺良性腫瘤的診斷標準；③于術前行超聲檢查；④為單側原發(fā)性乳腺腫瘤；⑤患者均知情本研究的研究內(nèi)容，且已簽署同意書。(2)排除標準：①合并嚴重器質性疾病患者；②術前已接受放化療及生物治療等抗腫瘤治療者；③合并其他惡性腫瘤疾病患者；④既往有胸部手術史者；⑤存在超聲檢查禁忌證者；⑥妊娠期或哺乳期婦女。乳腺癌組患者年齡31~65 歲，平均(49.68±5.33)歲；產(chǎn)次0~3 次，平均(1.28±0.20)次；腫塊最大徑0.9~5.1 cm，平均(1.86±0.35)cm；已出現(xiàn)淋巴結轉移35例。對照組患者年齡29~64歲，平均(49.31±5.46)歲；病理學檢查結果(術中采樣)：乳房纖維腺瘤27例、乳腺內(nèi)乳頭狀瘤18 例、乳腺囊性增生病12 例、脂肪瘤11 例；產(chǎn)次0~3 次，平均(1.31±0.22)次；腫塊最大徑0.4~3.6 cm，平均(1.39±0.26)cm。兩組患者的年齡、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)我院倫理委員會審核通過。

1.2 方法

1.2.1 超聲彈性成像 患者均于術前應用西門子Acuson S2000 型彩色多普勒超聲診斷儀進行檢查，探頭型號為14L5，頻率為7~14 MH，患者取平臥位，雙上肢自然放置于頭兩側，先行常規(guī)超聲檢查，明確病灶形態(tài)、大小、邊界等，然后將探頭調整至輕微接觸病灶表面皮膚，啟動彈性成像模式，應用實時雙幅模式顯示病灶的彈性圖及灰階圖，將取樣框調整至病灶的兩倍，采用Color2 彩色顯示法，藍色為硬，紅色為軟，控制質控量化參數(shù)≥60，能夠清晰顯示腫塊邊界后按凍結鍵，啟動Area Rati自動測量AR。硬度評分：1分，病灶與周圍組織均呈均勻粉色；2分，病灶呈紫色混雜少量綠色；3分，病灶呈綠色混雜少量黃色；4分，病灶呈紅色混雜少量黃色；5分，病灶呈紅色混雜少量黃色。

1.2.2 NKD1表達量檢測 術中取少量癌組織及癌旁組織(距癌組織5 cm，且經(jīng)快速病理學檢查證實為非癌組織)，用干凈的剪刀將組織于冰上剪碎，在液氮中研磨，然后放入離心管中，在加入裂解混合液后于冰中放置3 h(每20 mg組織加入150 μL裂解混合液)，應用海門LX200 型離心機將裂解后的樣本進行離心處理，速率為12 000 r/min，離心40 min，吸取上清液進行蛋白濃度測量，用裂解混合液調整樣品濃度，將樣品溶液加入緩沖液混勻后，煮5 min使蛋白變性，取出待冷卻的樣品進行點樣，以每孔中點樣量30 μL 進行上樣，避免產(chǎn)生氣泡，然后進行電泳、轉膜、封閉、孵育、DAB顯色處理，進行電泳時，壓縮膠部分用60~90 V電壓壓縮25~35 min，分離膠部分用100~140 V電壓分離30~50 min，應用Image lab 軟件對蛋白印跡的灰度值進行分析，以目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值來反映目的蛋白的相對表達。

1.2.3 HER-2 mRNA表達量檢測 應用Trizol法提取總RNA，采用分管光度法測定RNA 含量及純度。將提取的RNA 逆轉錄為cDNA，應用Primer 5.0軟件合成HER-2 引物及內(nèi)參β-action 引物，采用PCR法擴增后進行電泳分離，應用GENE TOOL 軟件進行半定量分析，以HER-2/β-action表示HER-2 mRNA表達量。

1.3 觀察指標 (1)比較兩組患者的AR 值及硬度評分，并分析其對浸潤性乳腺癌的診斷價值。(2)比較乳腺癌組患者的癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量。(3)比較不同AR值及硬度評分患者的癌組織NKD1、HER-2表達量，并分析其與彈性評分及AR值的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法 應用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差()表示，組間比較采用t檢驗；采用受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curve，ROC)曲線分析超聲彈性成像參數(shù)對浸潤性乳腺癌的診斷價值，并采用Z檢驗比較兩組間曲線下面積(area under curve，AUC)差異；采用Pearson檢驗分析癌組織NKD1、HER-2 表達量與彈性評分及AR值的相關性。均以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者的AR值及硬度評分比較 乳腺癌組患者的AR值大于對照組，硬度評分高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表1。患者超聲二維圖像及彈性成像圖像見圖1。

圖1 46歲女性右乳內(nèi)上象限包塊的超聲二維圖像及彈性成像圖像

表1 兩組患者的AR值及硬度評分比較()

表1 兩組患者的AR值及硬度評分比較()

組別 例數(shù)AR值 硬度評分(分)乳腺癌組對照組t值P值90 68 1.53±0.25 1.39±0.21 3.729 0.001 4.32±0.37 2.85±0.22 29.093 0.001

2.2 超聲彈性成像參數(shù)對浸潤性乳腺癌的診斷價值 超聲彈性成像參數(shù)聯(lián)合檢測診斷浸潤性乳腺癌的 AUC 大于 AR 值單獨檢測(Z=2.819，P<0.05)，見表2、圖2。

表2 超聲彈性成像參數(shù)對浸潤性乳腺癌的診斷價值

圖2 超聲彈性成像參數(shù)診斷浸潤性乳腺癌的ROC曲線分析

2.3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較 癌組織NKD1 表達量低于癌旁組織，HER-2 mRNA 表達量高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較()

表3 癌組織及癌旁組織的NKD1、HER-2表達量比較()

例數(shù)90 90項目癌組織癌旁組織t值P值NKD1 0.56±0.11 0.64±0.12 4.662 0.001 HER-2 mRNA 0.63±0.13 0.45±0.08 11.187 0.001

2.4 不同硬度評分及不同AR值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較 硬度評分≥3.97 分患者癌組織 NKD1 表達量低于<3.97 分患者，HER-2 mRNA 表達量高于<3.97 分患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；AR 值≥1.48 患者癌組織 NKD1 表達量低于<1.48 患者，HER-2 mRNA表達量高于<1.48患者，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 不同硬度評分及不同AR 值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較()

表4 不同硬度評分及不同AR 值患者癌組織NKD1、HER-2 表達量比較()

項目 例數(shù)分類NKD1HER-2 mRNA硬度評分73 17 AR值≥3.97<3.97 t值P值≥1.48<1.48 t值P值69 21 0.54±0.10 0.65±0.13 3.850 0.001 0.53±0.11 0.66±0.13 4.542 0.001 0.65±0.12 0.54±0.10 3.503 0.001 0.65±0.13 0.56±0.09 2.958 0.004

2.5 癌組織NKD1、HER-2表達量與硬度評分及AR 值的相關性 癌組織NKD1 表達量與硬度評分及AR 值呈負相關(P<0.05)，HER-2 mRNA 表達量與 AR值呈正相關(P<0.05)，見表5。

表5 癌組織NKD1、HER-2表達量與硬度評分及AR值的相關性

3 討論

浸潤性乳腺癌已成為全球最常見的癌癥，嚴重威脅了女性的身體健康。目前多采用超聲等方法診斷，主要依據(jù)腫塊的形態(tài)、內(nèi)部結構等來進行判斷，但在臨床工作中發(fā)現(xiàn)，較多浸潤性乳腺癌微小病灶發(fā)病早期惡性征象并不明顯，會影響到最終診斷。相關研究指出，超聲彈性成像可用于鑒別腫瘤性質，以輔助診斷疾病良惡性[6-7]。超聲彈性成像是依據(jù)不同病變組織及正常組織的組織硬度不同來進行判斷的，施加外力后，癌組織及正常組織彈性形變不同，通過組織內(nèi)部位移信號不同，計算出腫塊的變形程度，可以以此判斷病灶良惡性[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌組的AR值大于對照組，硬度評分高于對照組，說明浸潤性乳腺癌患者存在病灶硬度增高的現(xiàn)象，其原因在于，惡性腫瘤多呈浸潤性生長，與周圍組織黏連而導致活動度降低，因此相應區(qū)域的組織硬度增加。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，超聲彈性成像參數(shù)聯(lián)合檢測對浸潤性乳腺癌具有較高的診斷價值。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，AR值診斷浸潤性乳腺癌的截點值分別為3.97 分，略高于徐志花等[9]研究，這可能與良性組患者出現(xiàn)病灶部位膠原化有關。患者病灶膠原化，會出現(xiàn)纖維增生，使得彈性對比度增加，進而導致彈性分級增高。

NKD1 是一種由470 個氨基酸組成的蛋白，廣泛表達于多種重要器官的細胞質中，是Wnt信號通路的抑制性蛋白[10-11]。HER-2是人類表皮生長因子受體家族成員，在胎盤、胚胎上皮組織及多種腫瘤細胞中呈高表達，研究顯示，HER-2 可以作為乳腺癌診斷和評估的獨立危險因素[12-13]。相關報道指出，NKD1過表達可介導Wnt/PCP信號途徑，通過調控黏附蛋白活性及上皮細胞的極性來維持細胞極性，而起到腫瘤抑制作用[14-17]。表明NKD1 表達或與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關。本研究結果顯示，癌組織NKD1 表達量低于癌旁組織，HER-2 mRNA 表達量高于癌旁組織，進一步證實了浸潤性乳腺癌患者癌組織存在NKD1、HER-2 mRNA表達異常的現(xiàn)象，這主要與NKD1、HER-2均能介導腫瘤發(fā)生過程有關。本研究上述研究結果顯示，超聲硬度評分及AR 值可用于評價病灶性質，而浸潤性乳腺癌的發(fā)生與NKD1、HER-2表達存在密切關聯(lián)，提示NKD1、HER-2 表達或與超聲彈性指標存在某種聯(lián)系，為驗證上述猜想，本研究進行了相關分析，結果發(fā)現(xiàn)，癌組織NKD1表達量與硬度評分及AR值呈負相關，HER-2 mRNA表達量與AR值呈正相關。其具體機制尚不可知，筆者認為，可能與癌組織浸潤等有關。

綜上所述，超聲彈性成像參數(shù)聯(lián)合檢測對浸潤性乳腺癌具有診斷價值，且與癌組織NKD1、HER-2 mRNA表達量相關。