白細胞介素4 誘導(dǎo)蛋白1 促進腎癌進展的實驗研究

魏詩瑤，來佳丹，李常穎

（天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，天津市泌尿外科研究所，天津 300211）

迄今為止癌癥仍然是發(fā)病率和致死率最高的疾病之一，尋求有效的、新的治療途徑也一直是研究熱點。近些年發(fā)現(xiàn)，腫瘤與機體代謝之間存在密切聯(lián)系，氨基酸代謝酶可能在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，諸如吲哚胺-2，3-雙加氧酶（IDO）、精氨酸酶1（Arg1）及誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS），而白細胞介素4 誘導(dǎo)蛋白1（IL4I1）可能是一個新的、有潛力的免疫檢查點。

IL4I1 編碼一種分泌性的氨基酸代謝酶，參與苯丙氨酸、精氨酸和色氨酸的代謝[1-2]。因最初在B細胞上被白細胞介素4（IL-4）誘導(dǎo)表達而得名，其編碼基因位于人染色體19q13.33 位置。研究發(fā)現(xiàn)，IL4I1 在抗原呈遞細胞及腫瘤相關(guān)性巨噬細胞中高表達，能夠以分泌的形式作用于免疫突觸位置，抑制T 細胞的活化增殖和功能，促進調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）和M2 巨噬細胞的分化，以及免疫抑制細胞的募集[3]。目前對IL4I1 的研究多集中于黑色素瘤及膠質(zhì)瘤，而IL4I1 在腎癌中的表達情況及其功能尚不明確。

腎透明細胞癌是腎癌中最常見的類型，本研究通過數(shù)據(jù)庫分析了IL4I1 在腎透明細胞癌中的表達及其與預(yù)后之間的關(guān)系，探討IL4I1 的表達對于腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響，并探究了IL4I1 影響腫瘤發(fā)生、發(fā)展的潛在信號通路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析 通過在線數(shù)據(jù)庫UALCAN（http://ualcan.path.uab.edu/index.html）和Kaplan-Meier 生存分析（https://www. kmplot. com/analysis/index.php）分析IL4I1 在正常腎組織及腎透明細胞癌組織中的表達及與預(yù)后的關(guān)系。

1.2 細胞系與主要試劑 人腎癌細胞系786-O、769-P 及人腎近曲小管細胞HK-2（American Type Culture Collection），胎牛血清（Biological Industries），RPMI-1640、DMEM-F12 細胞培養(yǎng)基（源培生物），青鏈霉素混合液（索萊寶），Trizol（ThermoFisher Sci entific），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（ThermoFisher Scientific），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（Roche），PCR 引物（生工生物），重組Anti-IL4I1/LAO 抗體（Abcam，ab222102），siRNA 合成（吉瑪基因），opti-MEM 培養(yǎng)基（Gibco），X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑（Roche），山羊抗兔IgG H&L（FITC）（Abcam，ab6717），IC Fixation Buffer（ThermoFisher Scientific），Permeabilzation Buffer 10X（ThermoFisher Scientific），CFSE 熒光染料（ThermoFisher Scientific）。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 正常腎小管細胞系HK-2 細胞采用DMEM-F12 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，腎癌細胞系786-O和769-P 細胞系采用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，3 種培養(yǎng)基的配置均采用在培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清及2%青鏈霉素混合液配置。細胞置于5% CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，根據(jù)ATCC推薦比例進行傳代。

1.3.2 siRNA 干擾和細胞分組 于吉瑪基因訂購沉默IL4I1 的小干擾RNA（siRNA），siRNA 序列為：上游5′-GCAACUAUGUGGUGGAGAAGG-3′，下游5′-CCUUCUCCACCACAUAGUUGC-3′，對照siRNA 由吉瑪基因提供。

根據(jù)表達情況選擇786-O 細胞系進行干擾，提前24 h 于6 孔板中每孔接種1×105個細胞，使用opti-MEM 培養(yǎng)基稀釋X-tremeGENE siRNA 轉(zhuǎn)染試劑及siRNA 后以10∶2 比例混合并添加于細胞中，培養(yǎng)24～48 h 至合適密度后收集細胞提取RNA 檢測沉默水平。

siRNA 干擾后的細胞分組為：實驗組786-O-si，對照組786-O-ctrl。

1.3.3 RNA 提取和實時熒光定量PCR（qPCR） 去除上清并用預(yù)冷的PBS 洗滌后，在25 cm2培養(yǎng)瓶/6孔板中添加1 mL/500 μL Trizol 提取細胞RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Thermo Scientific RevertAid First StrandcDNASynthesisKit進行逆轉(zhuǎn)錄得到細胞cDNA。

以cDNA 為模板，添加FastStart Universal SYBR Green Master 及相應(yīng)引物，采用95℃激活10 min 后進行95℃變形15 s，60℃退火并延長60 s 進行40個循環(huán)進行檢測，以GAPDH 作為對照基因，利用△△Ct 法計算差異倍數(shù)。所用到的引物序列及產(chǎn)物大小見表1。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小Tab 1 The sequence of primers and length of products

1.3.4 流式細胞技術(shù)（FCM） 收集細胞并用預(yù)冷的PBS 洗滌后，加入IC Fixation Buffer 于4℃固定30 min。洗滌后，用蒸餾水稀釋為1×的 Permeabilzation Buffer 10X 重懸后以1∶1 000 比例加入IL4I1 抗體4℃孵育30 min。洗滌后用冷PBS 重懸后以1∶1 000比例添加山羊抗兔IgG H&L（FITC）后4℃孵育30 min。洗滌后PBS 重懸上機檢測。

1.3.5 細胞劃痕實驗 6 孔板中每孔接種5×105個細胞，待細胞生長至90%密度后使用200 μL 槍頭進行細胞劃痕，PBS 洗滌至無明顯漂浮細胞后更換培養(yǎng)基為無血清RPMI-1640 培養(yǎng)基，于0、24、48 h分別進行定點拍照。使用Image J 軟件進行劃痕面積計算。

1.3.6 CFSE 增殖實驗 消化細胞并洗滌后，用PBS重懸為1×106/mL 比例后加入CFSE 染料至10 μmol/L濃度后避光孵育10 min，添加5 倍體積冷RPMI-1640 完全培養(yǎng)基停止標記并在4℃孵育5 min，洗滌3 次后于6 孔板中每孔接種1×105個標記后的細胞，于第0 天和第4 天分別在流式細胞分析儀中檢測CFSE 熒光強度。

1.4 生物信息學(xué)分析 在TCGA（The Cancer Genome Atlas）數(shù)據(jù)庫中下載并整理腎透明細胞癌樣本數(shù)據(jù)（n=598），根據(jù)樣本中IL4I1 基因表達水平，通過中位值將樣本分為IL4I1 高表達組和IL4I1 低表達組，整理后的數(shù)據(jù)通過GSEA v4.1.0 軟件進行KEGG 通路富集分析。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 統(tǒng)計學(xué)分析使用GraphPad Prism 8.3.0 進行。正態(tài)分布的計量資料以±s 來表示，采用t 檢驗或方差分析進行組間比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL4I1 的表達及與預(yù)后的關(guān)系 相較于正常腎組織，IL4I1 在腎透明細胞癌中的mRNA 和蛋白水平均升高（均P＜0.001）（圖1A、B）。根據(jù)IL4I1 表達水平將腎透明細胞癌患者分為高、低表達組，生存分析結(jié)果顯示IL4I1 高表達組具有更短的生存期（OS）（n=530，P＜0.001）（圖1C）。

圖1 IL4I1 在腎透明細胞癌中的表達及與預(yù)后的關(guān)系Fig 1 The expression of IL4I1 in kidney clear cell carcinoma and its relationship with prognosis

2.2 腎癌細胞系中IL4I1 的表達和干擾 qPCR 結(jié)果顯示，與HK-2 細胞相比，腎癌細胞系786-O 細胞中IL4I1 過表達（t=16.83，P＜0.001）（圖2A）。FCM結(jié)果顯示，與HK-2 細胞相比，786-O 及769-P 細胞系IL4I1 蛋白陽性表達細胞比例均增加（t=280.40，t=37.11，均P＜0.001）（圖2B、D）。siRNA 干擾后，與對照組相比，實驗組IL4I1 mRNA 表達水平顯著降低（t=56.51，P＜0.001）（圖2C）。

圖2 IL4I1 在腎透明細胞癌細胞系中的表達和沉默F(xiàn)ig 2 The expression and silence of IL4I1 in tumor cells of KIRC

2.3 沉默IL4I1 基因表達對于腎透明細胞癌細胞生物學(xué)功能的影響 干擾IL4I1 表達后，細胞劃痕實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組細胞遷移能力明顯減弱（F=97.45，P＜0.001）（圖3A、3B）；CFSE增殖實驗結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組細胞增殖速度減慢（圖3C）。

圖3 IL4I1 的表達影響腎透明細胞癌細胞的增殖和遷移Fig 3 The proliferation and migration of KIRC cells influenced by expression of IL4I1

2.4 與IL4I1 表達及功能相關(guān)的機制探究 KEGG通路富集結(jié)果顯示，與細胞增殖相關(guān)的細胞周期信號通路、P53 信號通路以及與細胞遷移能力相關(guān)的VEGF 通路和CAM 通路在腎透明細胞癌IL4I1 高表達組顯著富集（FDR＜0.25，P＜0.05）（圖4A）。

進一步相關(guān)富集通路重點基因的mRNA 水平檢測的qPCR 結(jié)果顯示，在沉默IL4I1 后，與對照組相比，實驗組細胞間黏附分子-1（ICAM1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）以及血管內(nèi)皮生長因子A（VEGFa）表達水平都顯著降低（t=9.031、8.613、9.066，均P＜0.05）。此外，實驗組細胞程序性死亡-配體1（PD-L1）表達水平也顯著降低（t=12.66，P＜0.05）（圖4B）。

圖4 腎透明細胞癌與IL4I1 表達及功能相關(guān)的潛在通路Fig 4 The related potential pathway of IL4I1 in expression and function in KIRC

3 討論

腎細胞癌是常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤之一，其中腎透明細胞癌約占總體的65%～85%[4]。腎癌相對較易診斷，但由于早期無明顯癥狀，很多患者在確診時已發(fā)展為晚期腎癌及轉(zhuǎn)移癌，存在無法根治性切除的情況[5]，迫切需求探究腎癌治療的新手段。

近年腫瘤與代謝的關(guān)系備受關(guān)注。有研究觀點認為腫瘤是一種代謝性疾病，腫瘤中存在的代謝重編程影響著腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6]。2017 年批準上市的第一個針對腫瘤代謝的抗癌藥物——主要異檸檬酸脫氫酶2（IDH2）抑制劑恩西地平（Enasidenib），使靶向代謝的腫瘤治療成為可能[7]。

腎透明細胞癌與代謝異常密切相關(guān)，其胞質(zhì)中存在的脂質(zhì)異常積累導(dǎo)致的代謝重編程是其不同于其他腎癌的一大特征[8]。本研究發(fā)現(xiàn)IL4I1 這種特殊的氨基酸代謝酶在腎透明細胞癌中存在顯著過表達，并且指示不良預(yù)后。

作為一種免疫調(diào)節(jié)酶，IL4I1 被發(fā)現(xiàn)在以樹突狀細胞為主的抗原呈遞細胞中和腫瘤相關(guān)性巨噬細胞中高表達[9]。IL4I1 可以被抗原呈遞細胞合成并釋放，抑制免疫突觸的穩(wěn)定形成，下調(diào)T 細胞CD3ζ鏈的膜暴露影響CD8+T 細胞活化[10-11]。IL4I1 介導(dǎo)的局部必需氨基酸的消耗以及有毒產(chǎn)物的產(chǎn)生形成不利于抗腫瘤免疫的環(huán)境，從而進一步限制腫瘤殺傷性T 細胞的增殖和功能[1，12]。最新一項研究發(fā)現(xiàn)IL4I1 的高表達可以抑制CD8+T 細胞向記憶表型的分化從而限制對于腫瘤的長效免疫[10]。此外，IL4I1可以促進Treg 細胞及M2 型巨噬細胞的分化，可以參與調(diào)節(jié)MDSC 的分化，以及對于這些免疫抑制性細胞的募集[1，13-14]。

既往認為IL4I1 是乳腺癌和膠質(zhì)瘤重要的預(yù)后標志物[3]。在最新的兩項研究中，IL4I1 被發(fā)現(xiàn)在體外實驗中能夠影響膠質(zhì)瘤細胞和卵巢癌細胞的遷移能力，以及促進卵巢癌細胞的增殖，并且在小鼠模型中被證實IL4I1 的表達與腫瘤生長密切相關(guān)[2，15]。IL4I1的表達還與黑色素瘤的前哨淋巴結(jié)侵襲、較高腫瘤分期以及快速復(fù)發(fā)相關(guān)，往往提示較短的總生存期[1，3]。

本研究發(fā)現(xiàn)IL4I1 在腎透明細胞癌中存在過表達并且指示預(yù)后不良。干擾IL4I1 表達后發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌細胞的增殖速度及遷移能力下降，IL4I1可能是因此促進腎癌的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。KEGG 通路富集分析顯示在IL4I1 高表達的腎透明細胞癌組中存在49 個通路顯著富集，而在低表達組中無通路顯著富集。其中，與細胞增殖密切相關(guān)的細胞周期通路及P53 信號通路，以及與腫瘤細胞遷移發(fā)展轉(zhuǎn)移密切相關(guān)的CAM 通路及VEGF 信號通路顯著富集。而在干擾IL4I1 表達后，腎癌細胞表達ICAM1、VEGFa、MMP9 及PD-L1 的mRNA 水平顯著降低。

ICAM1 可以降低腫瘤細胞間的黏附能力，使腫瘤細胞脫落入血，從而完成腫瘤的轉(zhuǎn)移，ICAM1 也參與腫瘤血管生成[16]。VEGFa 能特異性促進細胞的分裂增殖和遷移，對于腫瘤的新生血管生成十分重要[17]。研究顯示，MMP9 能夠通過降解細胞外基質(zhì)（ECM）從而在腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲中發(fā)揮重要作用[18]。這可能有利于IL4I1 影響腫瘤轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制的研究，從而為靶向IL4I1 提供指導(dǎo)。

此外，Sadik 等[2]研究發(fā)現(xiàn)了IL4I1 可以通過代謝色氨酸產(chǎn)生中間代謝產(chǎn)物犬尿喹啉酸（KynA），活化AHR 調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，促進腫瘤轉(zhuǎn)移以及抑制CD8+T 細胞的增殖和增強免疫抑制性細胞的募集。他們同時發(fā)現(xiàn)在部分應(yīng)用抗PD-1/PD-L1 效果不佳的惡性黑色素瘤患者中出現(xiàn)IL4I1 和IDO1表達水平的增高，并且在聯(lián)用IDO1 抑制劑后沒有改善。這提示IL4I1 可能是改善現(xiàn)有免疫療法的一個可能方向，而筆者的研究也發(fā)現(xiàn)IL4I1 的表達會影響PD-L1 的表達，這可能是腫瘤免疫逃逸的機制之一。

近期也有對小鼠腫瘤局部注射IL4I1 抑制劑后觀察到腫瘤明顯體積減小的報道[19]，也是IL4I1 能夠作為一個腫瘤治療靶點的有利證據(jù)之一。目前針對IL4I1 的有效安全的抑制劑也在研究中[20]。總之，IL4I1 可以通過影響腫瘤細胞的增殖和遷移能力從而影響腎透明細胞癌的發(fā)展，是一個有潛力的針對腎透明細胞癌靶向治療的檢查點。