miR-152通過(guò)HLA-G/KIR2DL4通路對(duì)人正常滋養(yǎng)細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶2、9表達(dá)的影響

楊洋，馬媛，宋姍姍，陳宥藝，張建華

子癇前期(preeclampsia，PE)為妊娠期特有疾病，可導(dǎo)致嚴(yán)重母兒并發(fā)癥[1]，多發(fā)生于妊娠20周后，目前發(fā)病機(jī)制尚未明確。微小RNA[2]、微環(huán)境介質(zhì)[3]、免疫[4]等領(lǐng)域的大量研究，逐步驗(yàn)證了滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲障礙-引發(fā)胎盤(pán)灌注不良-最終導(dǎo)致母體微環(huán)境紊亂這一病因?qū)W說(shuō)的可能性[5]。而妊娠早期發(fā)生于結(jié)構(gòu)復(fù)雜且功能調(diào)節(jié)方式精密的母胎界面中的異常改變，在PE的發(fā)病過(guò)程中成為關(guān)鍵因素[6]。蛻膜NK細(xì)胞(decidual natural killer，dNK)則在母胎界面中，通過(guò)分泌多種細(xì)胞因子，參與滋養(yǎng)細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)過(guò)程[7]，在PE發(fā)病中發(fā)揮作用。

我們前期發(fā)現(xiàn)，在PE胎盤(pán)組織中病理性高表達(dá)的miR-152能夠影響dNK分泌功能，影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)[8]，但具體機(jī)制尚未明確。因此，本研究擬在前期基礎(chǔ)上進(jìn)一步探討miR-152是以何種方式，通過(guò)其靶基因人類(lèi)白細(xì)胞抗原G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)的介導(dǎo)，協(xié)同dNK參與對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。

1 材料和方法

1.1 臨床樣本

收集2020年9月至2020年10月在西安市第四醫(yī)院婦產(chǎn)科門(mén)診行人工流產(chǎn)患者的早孕蛻膜組織5例。納入排除標(biāo)準(zhǔn)：患者年齡<35歲，體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)≤25 kg/m2，均為1胎正常順產(chǎn)、第2次妊娠因主觀無(wú)生育要求而終止妊娠的患者；所有患者既往無(wú)遺傳性、傳染性疾病及代謝性疾病病史；無(wú)妊娠期疾病史；無(wú)孕早期藥物、放射線及毒物接觸史。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要試劑和材料

人滋養(yǎng)細(xì)胞株(HTR-8)(空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院婦產(chǎn)科實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng))。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、青霉素-鏈霉素、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)(美國(guó)Gibco公司)；miR-152前體及對(duì)照分子(中國(guó)吉瑪生物公司)；TRIzol、lipofectamine2000、CD56、CD16單抗(美國(guó)Invitrogen公司)；基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)2、MMP9、β-actin單抗、HRP標(biāo)記的二抗(武漢博士德生物工程有限公司)；外周血淋巴細(xì)胞分離液試劑盒(天津?yàn)笊锟萍脊?；RT-qPCR試劑(美國(guó)VAZYME公司)；matrigel膠、Transwell inserts(美國(guó)Costar公司)；殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer Ig-like receptors，KIR)2DL4單克隆抗體(anti-KIR2DL4)、IgG1同種型對(duì)照(美國(guó)Abnova公司)；重組人IL-15(美國(guó)PeproTech公司)。

1.3 方法

1.3.1 干預(yù)HLA-G/KIR2DL4通路共培養(yǎng)體系的建立 將HTR-8接種于含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)；待細(xì)胞生長(zhǎng)密度至80%左右時(shí)按照Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)要求在HTR-8細(xì)胞中過(guò)表達(dá)與抑制miR-152，獲得miR-152mimics組、miR-152inhibitor組、未轉(zhuǎn)染組HTR-8細(xì)胞；轉(zhuǎn)染后6 h觀察轉(zhuǎn)染效率，48 h后qRT-PCR檢測(cè)miR-152過(guò)表達(dá)與抑制水平。

37℃ 5% CO2飽和濕度條件下，消化剪碎的蛻膜組織；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行淋巴細(xì)胞分離并計(jì)數(shù)；PBS液重懸分離后細(xì)胞，并添加CD16和CD56，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析；最終得到分離純化后的dNK細(xì)胞。

向完成miR-152轉(zhuǎn)染的各組HTR-8(選擇6孔板進(jìn)行)細(xì)胞中分別加入1×106個(gè)dNK共培養(yǎng)，同時(shí)每組加入20 ng/mL的IL-15(僅刺激dNK細(xì)胞活性，不影響細(xì)胞功能)；部分實(shí)驗(yàn)組加入20 μL anti-KIR2DL4或1μg IgG1(為anti-KIR2DL4的對(duì)照物質(zhì)，應(yīng)用目的為排除anti-KIR2DL4本身是否對(duì)細(xì)胞功能產(chǎn)生影響及評(píng)判其特異性封閉效果)，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)共分6組：NC(對(duì)照)組：HTR-8+dNK+IL-15；A組：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+IL-15；B組：HTR-8(miR-152inhibitor)+dNK+IL-15；C組：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+anti-KIR2DL4+IL-15；D組：HTR-8(miR-152mimics)+dNK+IgG1+IL-15；E組：HTR-8+(miR-152 mimics NC)+dNK+anti-KIR2DL4+IL-15。

因PE病理性胎盤(pán)組織中miR-152為病理性高表達(dá)，故上述分組中僅設(shè)置了miR-152mimics NC。

1.3.2 qRT-PCR檢測(cè)HTR-8中miR-152轉(zhuǎn)染效率 轉(zhuǎn)染后48 h使用TRIzol法提取miR-152轉(zhuǎn)染后的各組HTR-8細(xì)胞總RNA，并檢測(cè)質(zhì)量。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-152(上游5‘-TGCGCTCAGTGCATGACAGAA-3’；下游5‘- CCAGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3’)；U6(上游5‘-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’；下游5‘-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’)；反應(yīng)條件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 sec,60°C 30 sec，40 個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，使用2-△△Ct法計(jì)算各組中目的基因miR-152水平的表達(dá)情況。

1.3.3 qRT-PCR及Western blot檢測(cè)各組HTR-8中MMP2、MMP9表達(dá)情況 按照1.3.2中方法提取共培養(yǎng)后各組HTR-8細(xì)胞中總RNA，并行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)。引物序列：MMP2(上游5‘-ACCACAGCCAACTACGATGA-3’；下游5‘-GCTCCTGAATGCCCTTGATG-3’)、MMP9(上游5‘-CAGTCCACCCTTGTGCTCTTCCCTG-3’；下游5‘-ATCTCTGCCACCCGAGTGTAACCA-3’)；β-actin(上游5‘-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT-3’；下游：5‘-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’)；反應(yīng)條件：50°C 2 min，95°C 10 min；95°C 30 sec,60°C 30 sec，40 個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR反應(yīng)。每次檢測(cè)設(shè)定3個(gè)復(fù)孔，每個(gè)樣本重復(fù)3次。根據(jù)PCR擴(kuò)增曲線，使用2-△△Ct法計(jì)算各組中目的基因MMP2、MMP9 mRNA水平的表達(dá)情況。

轉(zhuǎn)染后48 h提取各組HTR-8細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，以40 μg蛋白上樣量進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)上，封閉1 h；加抗MMP2(1∶1 000)、抗MMP9(1∶1 000)、抗β-actin(1∶500)抗體，4℃ 孵育過(guò)夜，TBST洗膜后加二抗(1∶50 000)，室溫孵育2 h。洗膜后，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，X光膠片壓片后顯影、定影，沖洗膠片；隨后掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

1.3.4 Transwell實(shí)驗(yàn) 將1.3.1中共培養(yǎng)48 h后的6組共培養(yǎng)上層培養(yǎng)液棄去，PBS漂洗HTR-8細(xì)胞，0.25%胰酶消化收集，離心后PBS再次潤(rùn)洗兩次；無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，稀釋細(xì)胞濃度至3×105個(gè)細(xì)胞/mL；Transwell上室分別接種200 μL各組細(xì)胞懸液，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h；70%冰乙醇溶液固定細(xì)胞1 h； 0.5%結(jié)晶紫染液染色，顯微鏡下觀察拍照；每個(gè)濾膜隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)下層細(xì)胞并行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 miR-152的轉(zhuǎn)染效率

轉(zhuǎn)染后6 h于熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率(羧基熒光素酶標(biāo)記對(duì)照)，可見(jiàn)轉(zhuǎn)染效率超過(guò)90%，見(jiàn)圖1(彩插1)。qRT-PCR結(jié)果顯示：與未轉(zhuǎn)染組相比，miR-152 mimics組細(xì)胞中miR-152表達(dá)水平顯著升高(P<0.001)，miR-152 inhibitor組細(xì)胞中miR-152表達(dá)降低(P<0.005)，以上差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，miR-152在HTR-8細(xì)胞中轉(zhuǎn)染效果較好，詳見(jiàn)表1。

表1 miR-152在HTR-8細(xì)胞中表達(dá)水平

2.2 分離、純化后的dNK細(xì)胞情況

dNK細(xì)胞表型為CD56+CD16-，流式細(xì)胞分選結(jié)果顯示，分離純化的dNK細(xì)胞純度較高，約97.08%，見(jiàn)圖2。

圖2 流式細(xì)胞分選dNK純度

2.3 干預(yù)HLA-G/KIR2DL4通路共培養(yǎng)后HTR-8細(xì)胞中MMP2、MMP9的表達(dá)情況

qRT-PCR和Western blot 結(jié)果顯示，與NC(對(duì)照)組比較：C組(封閉KIR2DL4抗體聯(lián)合過(guò)表達(dá)miR-152)HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均降低(P<0.05)；A組、D組、E組均在過(guò)表達(dá)miR-152的前提條件下，這3組HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均分別低于NC組(P<0.05)；B組(抑制miR-152表達(dá))HTR-8中MMP2、9在mRNA和蛋白水平均高于NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖3、下頁(yè)表2。

圖3 6組HTR-8細(xì)胞中MMP2、9在蛋白水平的表達(dá)情況

表2 6組HTR-8細(xì)胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平的表達(dá)情況

2.4 干預(yù)HLA-G/KIR2DL4通路共培養(yǎng)后HTR-8浸潤(rùn)能力情況

Transwell 結(jié)果顯示，與NC(對(duì)照)組比較：C組(封閉KIR2DL4抗體聯(lián)合過(guò)表達(dá)miR-152)HTR-8細(xì)胞浸潤(rùn)能力降低(P<0.05)；A組、D組、E組均在過(guò)表達(dá)miR-152的前提條件下，這3組HTR-8細(xì)胞浸潤(rùn)能力均分別低于NC組(P<0.05)；B組(抑制miR-152表達(dá))HTR-8細(xì)胞浸潤(rùn)能力高于NC組(P<0.05)，見(jiàn)圖4、表3。

圖4 共培養(yǎng)后各組HTR-8浸潤(rùn)能力情況(200倍鏡下)

表3 6組共培養(yǎng)后對(duì)HTR-8浸潤(rùn)能力的影響

3 討論

PE為妊娠期造成母兒不良結(jié)局的常見(jiàn)原因，其發(fā)病率較高[9]。包括滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)障礙及繼發(fā)的螺旋動(dòng)脈重鑄不足在內(nèi)的母胎界面中諸多異常改變，初步解釋了后期PE特征性臨床表現(xiàn)產(chǎn)生的部分病理生理機(jī)制[10]。胎盤(pán)娩出，PE即可消失[11]，提示母胎界面綜合因素在PE發(fā)病中的重要作用。而PE的發(fā)生源自由蛻膜基質(zhì)細(xì)胞、蛻膜免疫細(xì)胞和滋養(yǎng)細(xì)胞組成的母胎界面[12]。

dNK作為母胎界面中重要的免疫細(xì)胞組分，能夠受到miRNA的間接調(diào)控，通過(guò)影響滋養(yǎng)細(xì)胞功能，與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、PE等發(fā)病相關(guān)[8,13]。我們前期發(fā)現(xiàn)，在PE胎盤(pán)組織中病理性高表達(dá)的miR-152能夠在mRNA及蛋白水平負(fù)性調(diào)控HLA-G[8]；此外，我們還發(fā)現(xiàn)：過(guò)表達(dá)miR-152的HTR-8與dNK共培養(yǎng)上清中白細(xì)胞介素8(interleukin 8，IL-8)、干擾素誘導(dǎo)蛋白10(interferon induced protein10，IP-10)表達(dá)降低，且該組共培養(yǎng)上清液可抑制滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)，但具體機(jī)制不明[8]。

主要分布于母胎界面的絨毛膜外滋養(yǎng)細(xì)胞表面HLA-G，可作為KIR2DL4的唯一配體，通過(guò)與其特異性結(jié)合傳遞免疫信號(hào)；KIR2DL4為KIR家族成員，同時(shí)發(fā)揮活化NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子和趨化因子，及抑制激活NK細(xì)胞的細(xì)胞殺傷作用；HLA-G與KIR2DL4的結(jié)合則會(huì)促進(jìn)NK細(xì)胞分泌功能，抑制其殺傷活性，從而有利于維系正常妊娠[14-15]。結(jié)合既往研究推測(cè)：PE情況下病理性高表達(dá)的miR-152能否因?qū)ζ浒谢虻呢?fù)向調(diào)控作用，導(dǎo)致HLA-G低表達(dá)，降低了其與dNK細(xì)胞表面KIR2DL4受體的正常結(jié)合率；通過(guò)HLA-G/KIR2DL4通路進(jìn)一步影響dNK分泌細(xì)胞因子(如IL-8、IP-10等)，調(diào)節(jié)了滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力改變過(guò)程。

因此，本研究中我們進(jìn)一步構(gòu)建了6組過(guò)表達(dá)與抑制miR-152的HTR-8和dNK的共培養(yǎng)體系，且在共培養(yǎng)過(guò)程中特異性封閉KIR2DL4受體；后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：在與dNK共培養(yǎng)條件下，封閉KIR2DL4抗體后，過(guò)表達(dá)miR-152的HTR-8浸潤(rùn)能力降低，且該組細(xì)胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均降低；另外3組在過(guò)表達(dá)miR-152的前提條件下，HTR-8浸潤(rùn)能力均分別低于對(duì)照組，且3組HTR-8中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平也均分別低于對(duì)照組；抑制miR-152表達(dá)的HTR-8浸潤(rùn)能力高于對(duì)照組，該組細(xì)胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平均增高；提示共培養(yǎng)條件下，滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP2、MMP9在mRNA和蛋白水平表達(dá)均有改變，細(xì)胞浸潤(rùn)能力降低與滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP2、MMP9表達(dá)下降相關(guān)。

MMPs表達(dá)水平與滋養(yǎng)細(xì)胞的浸潤(rùn)及遷移直接相關(guān)，其中MMP2、MMP9還可通過(guò)細(xì)胞膜鈣、鉀離子通道影響血管內(nèi)皮舒縮功能[16]。IL-8、IP-10則能夠通過(guò)與滋養(yǎng)細(xì)胞表面趨化因子受體1和3(CXCR3、CXCR1)相互作用，促進(jìn)MMP2、MMP9合成釋放，增強(qiáng)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲力[17]。PE時(shí)，miR-152介導(dǎo)下的一系列病理改變，可能抑制了IL-8、IP-10水平，進(jìn)而降低MMP2、MMP9合成，影響滋養(yǎng)細(xì)胞正常浸潤(rùn)。以上研究結(jié)果能夠進(jìn)一步解釋本研究中發(fā)現(xiàn)的共培養(yǎng)條件下滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)功能改變的部分機(jī)制。母胎界面中，IL-8、IP-10分別影響MMP2、MMP9合成的程度及具體方式，以及dNK分泌的其他細(xì)胞因子是否也參與了上述過(guò)程，是我們后續(xù)繼續(xù)探究的方向。

綜上提示：miR-152可能通過(guò)HLA-G/KIR2DL4通路，影響dNK分泌功能，使母胎界面微環(huán)境中相關(guān)細(xì)胞因子發(fā)生改變，影響滋養(yǎng)細(xì)胞中MMP2、MMP9合成，進(jìn)而降低滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤(rùn)能力，誘發(fā)后續(xù)胎盤(pán)血管重塑形成障礙，最終導(dǎo)致PE發(fā)生。通過(guò)本研究，為PE的病因?qū)W研究和臨床防治提供了部分實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。