混菌發(fā)酵對賀蘭山東麓‘赤霞珠’干紅葡萄酒香氣的影響

夏鴻川，張 眾，孫麗君，李 偉，張軍翔*

（1.寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；3.寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院，寧夏 銀川 750021；4.中國葡萄酒產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，寧夏 銀川 750021）

葡萄酒的乙醇發(fā)酵是由釀酒酵母主導(dǎo)、非釀酒酵母參與，將葡萄中的糖轉(zhuǎn)化為二氧化碳和乙醇的生物化學(xué)過程，并伴隨著甘油、高級醇、醛類、酯類等物質(zhì)的合成代謝。由于商業(yè)釀酒酵母具有較好的發(fā)酵性能和脅迫耐受性，在實(shí)際生產(chǎn)過程中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，商業(yè)釀酒酵母的廣泛使用也是導(dǎo)致發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)單一化的主要原因，因?yàn)榻臃N商業(yè)釀酒酵母后會(huì)限制其他微生物的生長。雖然這種方法可促進(jìn)葡萄酒品質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化，但從另一角度也導(dǎo)致了許多地區(qū)葡萄酒的同質(zhì)化、香氣及口味不夠復(fù)雜、品質(zhì)缺乏特色和典型性的問題。

近年研究發(fā)現(xiàn)，許多非釀酒酵母能夠產(chǎn)生大量的甘油、酯類等代謝產(chǎn)物，也能夠產(chǎn)生一些利于香氣前體水解并釋放出游離態(tài)香氣成分的糖苷酶，對葡萄酒的風(fēng)味形成具有重要作用。但也存在一些缺陷，例如大多數(shù)非釀酒酵母耐乙醇能力弱、發(fā)酵性能低以及高產(chǎn)乙酸等。因此，為了保證發(fā)酵完全且避免產(chǎn)生不良副產(chǎn)物，通常將這些非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行混菌發(fā)酵，包括同時(shí)接種和順序接種兩種形式。前者是將非釀酒酵母與釀酒酵母按比例同時(shí)接種于葡萄醪中，后者是先接種高細(xì)胞濃度的非釀酒酵母，隨后（如1～3 d后）再接種釀酒酵母進(jìn)行后期的發(fā)酵。這兩種方式都可以提高葡萄酒香氣的復(fù)雜度，但具體的選擇則需要根據(jù)酵母種類及酵母之間的互作模式確定。不同非釀酒酵母在混菌發(fā)酵中的作用大不相同，會(huì)給葡萄酒香氣帶來不同的特點(diǎn)。例如，葡萄汁有孢漢遜酵母（）可以分泌多種胞外酶（葡萄糖苷酶、木糖苷酶、蛋白酶），能在發(fā)酵初始階段代謝出更復(fù)雜的揮發(fā)性香氣物質(zhì)。畢赤酵母能夠高產(chǎn)乙酸乙酯、乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)，因此具有提升葡萄酒花香及果香的潛力，同時(shí)還可以提高揮發(fā)性硫醇含量，給葡萄酒帶來黑醋栗、甘草、黑胡椒、薄荷的香氣。Clemente-Jimenez等研究表明，使用發(fā)酵畢赤酵母（）與釀酒酵母順序接種發(fā)酵‘馬卡貝奧’白色葡萄品種，結(jié)果顯示間隔2 d的順序接種，不僅可以減少醋酸的產(chǎn)生，還可以增加葡萄酒中乙酸乙酯、1-丙醇、正丁醇、1-己醇、癸酸乙酯和甘油的含量。近年來，消費(fèi)市場對不同類型和風(fēng)格葡萄酒的需求不斷增長，而混菌發(fā)酵作為一種調(diào)控葡萄酒香氣特性的新工藝，成為了研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)之一。

本研究以寧夏賀蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄為原料，利用3 種優(yōu)選非釀酒酵母（葡萄汁有孢漢遜酵母、發(fā)酵畢赤酵母和畢赤克魯維酵母（））與釀酒酵母分別進(jìn)行不同方式的混菌發(fā)酵，探究混合發(fā)酵過程中酵母的生長狀況，以及葡萄酒理化指標(biāo)、香氣成分、感官特征的差異性，旨在確定有利于‘赤霞珠’葡萄酒釀造的混菌發(fā)酵工藝，充分發(fā)掘?qū)幭馁R蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄酒的風(fēng)格與潛力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘赤霞珠’（L.cv.Cabernet Sauvignon）于2020年10月6日取自寧夏回族自治區(qū)青銅峽甘城子產(chǎn)區(qū)，還原糖254 g/L，可滴定酸（以酒石酸計(jì)）5.1 g/L，pH 3.78，衛(wèi)生狀況良好。

葡萄汁有孢漢遜酵母Yun268菌株保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，編號為M2013658；發(fā)酵畢赤酵母Z9Y-3和畢赤克魯維酵母C735保藏于西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院。以上3 種非釀酒酵母酵母均由西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院提供，在使用前重新進(jìn)行26S rRNA D1/D2區(qū)域序列鑒定，確認(rèn)菌種后備用。釀酒酵母（Excellence XR）購于法國Lamothe Abiet公司。

酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基、沃勒斯坦實(shí)驗(yàn)室營養(yǎng)（Wallerstein laboratory nutrient，WLN）瓊脂培養(yǎng)基青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；二甲基二碳酸鹽 重慶長風(fēng)生物科技有限公司；無水乙醇（色譜純） 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；C～C正構(gòu)烷烴（≥99.7%，色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；4-甲基-2-戊醇（≥98.0%，色譜純） 日本TCI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-7000D氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱（30 mh250 μm，0.25 μm） 美國Agilent公司；PAL3自動(dòng)進(jìn)樣器 瑞士CTC公司；TU-1901型分光光度計(jì)北京普析通用儀器有限公司；Enology Y15葡萄酒全自動(dòng)分析儀 西班牙Biosystems公司；雷磁PHS-3C pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；ME104E電子天平瑞士Mettle公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母活化培養(yǎng)與計(jì)數(shù)

將保藏的非釀酒酵母菌株解凍后，劃線培養(yǎng)于YPD固體培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)24 h后重復(fù)活化1 次。在YPD固體培養(yǎng)基上挑取菌落特征明顯的非釀酒酵母菌株接種于200 mL的YPD液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，低溫（4 ℃）離心后收集菌體，并經(jīng)無菌水洗滌后對酵母進(jìn)行計(jì)數(shù)，最后按比例接入葡萄醪中。釀酒酵母按照產(chǎn)品說明進(jìn)行活化。發(fā)酵過程中每隔48 h取樣并涂布于WLN固體培養(yǎng)基中，根據(jù)釀酒酵母和非釀酒酵母在WLN 平板上菌落形態(tài)進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，并計(jì)數(shù)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)處理

對照組：只接種單一的釀酒酵母（CK）；不接入任何酵母（自然）。

混菌發(fā)酵組：葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母1∶1同時(shí)接種發(fā)酵（CH1）；葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母10∶1同時(shí)接種發(fā)酵（CH10）；葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母1∶1順序接種發(fā)酵（SH1）；葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母10∶1順序接種發(fā)酵（SH10）；發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母1∶1同時(shí)接種發(fā)酵（CP1）；發(fā)酵畢赤酵母酵母與釀酒酵母10∶1同時(shí)接種發(fā)酵（CP10）；發(fā)酵畢赤酵母酵母與釀酒酵母1∶1順序接種發(fā)酵（SP1）；發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母10∶1順序接種發(fā)酵（SP10）；畢赤克魯維酵母與釀酒酵母1∶1同時(shí)接種發(fā)酵（C7351）；畢赤克魯維酵母與釀酒酵母10∶1同時(shí)接種發(fā)酵（C73510）；畢赤克魯維酵母與釀酒酵母1∶1順序接種發(fā)酵（S7351）；畢赤克魯維酵母與釀酒酵母10∶1順序接種發(fā)酵（S73510）。

其中釀酒酵母的接種量為1h10CFU/mL；非釀酒酵母的接種量為1∶1（1h10CFU/mL）、10∶1（1h10CFU/mL）；同時(shí)接種指同時(shí)加入非釀酒酵母與釀酒酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵；順序接種指先加入非釀酒酵母，48 h后加入釀酒酵母進(jìn)行乙醇發(fā)酵。

1.3.3 葡萄酒釀造工藝

‘赤霞珠’釀酒葡萄除梗破碎后分裝于10 L玻璃發(fā)酵罐，除自然發(fā)酵外，其余酒樣加入偏重亞硫酸鉀50 mg/L和二甲基二碳酸鹽600 mg/L進(jìn)行過夜滅菌處理，第2天按組接種相應(yīng)的酵母啟動(dòng)乙醇發(fā)酵，乙醇發(fā)酵結(jié)束（殘?zhí)切∮? g/L）1 d后浸漬，分離后取自流汁轉(zhuǎn)入5 L玻璃瓶并進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵（10 mg/L的乳酸菌），蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束加入50 mg/L SO終止發(fā)酵并滿罐密封貯存，靜置1 個(gè)月后分離沉淀并裝瓶于恒溫地下酒窖瓶儲，陳釀3 個(gè)月后對各發(fā)酵組取樣進(jìn)行理化指標(biāo)分析、揮發(fā)性香氣成分測定、香氣感官評價(jià)。每個(gè)處理重復(fù)2 次。

1.3.4 理化指標(biāo)檢測

參考GB/T 15038ü2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》，測定總糖、殘?zhí)恰⒖偹?、揮發(fā)酸、干浸出物含量和乙醇體積分?jǐn)?shù)等理化指標(biāo)；甘油、蘋果酸含量用葡萄酒全自動(dòng)分析儀測定。

1.3.5 揮發(fā)性成分測定

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對葡萄酒香氣成分進(jìn)行檢測，檢測方法參考白雪菲等的研究略作改動(dòng)。

揮發(fā)性物質(zhì)定性定量分析：提取揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖，通過NIST 17譜庫進(jìn)行檢索，并根據(jù)C～C烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間，用保留指數(shù)（retention index，RI）法計(jì)算各香氣成分的RI從而進(jìn)行定性分析。香氣成分質(zhì)量濃度以香氣成分峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，再乘內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度進(jìn)行定量計(jì)算。

1.3.6 葡萄酒感官評價(jià)

葡萄酒感官品評小組由寧夏大學(xué)葡萄酒專業(yè)老師和學(xué)生組成，共15 名（8 名男性，7 名女性），每名品嘗員均經(jīng)過專業(yè)品評培訓(xùn)。以盲品的形式，在標(biāo)準(zhǔn)品酒室（ISO 8589ü1998）使用標(biāo)準(zhǔn)品酒杯（ISO 3591ü1997）品鑒，品嘗員需從Davis香氣輪盤中選取合適的詞匯進(jìn)行葡萄酒香氣特征描述，并按照強(qiáng)度等級（1～8 級）對特征香氣進(jìn)行強(qiáng)度打分。其中Davis香氣輪盤包括果香味、花香味、堅(jiān)果味等12 種香氣大類，29 種香氣小類，共包括120 種香氣類型，可供品嘗員進(jìn)行選擇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Office 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)；SPSS 26軟件對不同發(fā)酵處理酒樣的理化指標(biāo)及揮發(fā)性香氣成分進(jìn)行單因素方差分析（one-way analysis of variance，one-way ANOVA），Duncan法進(jìn)行事后多重比較，＜0.05，差異顯著；對氣味活性值（odor activity value，OAV）大于0.1的37 種香氣成分進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA），其中每組揮發(fā)性組分的OAV是由該物質(zhì)的含量除以其閾值得到；用Origin 2017軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的生長變化分析

如圖1A所示，CK中釀酒酵母的數(shù)量呈先上升后下降的趨勢，在第6天達(dá)到最大數(shù)量，為2.23h10CFU/mL。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，最終穩(wěn)定在較高數(shù)量級（10～10CFU/mL）直到發(fā)酵結(jié)束。在自然發(fā)酵中，非釀酒酵母與釀酒酵母始終共存，并且在發(fā)酵初始階段非釀酒酵母的數(shù)量比釀酒酵母多100 倍左右，其數(shù)量在前6 d不斷上升并處于主導(dǎo)地位，這與前人研究結(jié)果一致。圖1B為接種葡萄汁有孢漢遜酵母的處理，可以發(fā)現(xiàn)，在順序接種（SH1、SH10）中葡萄汁有孢漢遜酵母始終存在于發(fā)酵體系中，而在同時(shí)接種（CH1、CH10）中則于14～16 d完全消失。如圖1C所示，只有SP10中的發(fā)酵畢赤酵母才能存在至發(fā)酵結(jié)束，而SP1、CP1和CP10中發(fā)酵畢赤酵母在12～14 d完全消失。如圖1D所示，無論是哪種接種方式，畢赤克魯維酵母都在發(fā)酵中后期完全消失。可見，不同非釀酒酵母與釀酒酵母之間的競爭能力存在差別，其中葡萄汁有孢漢遜酵母明顯強(qiáng)于發(fā)酵畢赤酵母，而畢赤克魯維酵母的活性最差。

圖1 不同發(fā)酵體系中釀酒酵母與非釀酒酵母細(xì)胞的生長變化情況Fig.1 Growth status of S.cerevisiae and non-Saccharomyces yeasts in different fermentation systems

同時(shí)接種最能反映酵母之間的競爭能力強(qiáng)弱，CH1和CH10中葡萄汁有孢漢遜酵母的數(shù)量最大值（1.9h10、7.23h10CFU/mL）明顯大于CP1和CP10中發(fā)酵畢赤酵母（1.37h10、1.27h 10CFU/mL），大于C7351和C73510中畢赤克魯維酵母的數(shù)量（1.43h10、1.25h10CFU/mL）。導(dǎo)致非釀酒酵母生長受限的原因有很多，如釀酒酵母能夠產(chǎn)生抑制物如乙醇、中鏈脂肪酸、殺傷毒素和多肽等。此外，對氮源的競爭也會(huì)影響各酵母之間的相互作用，有研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母能更快、更有效地利用基質(zhì)中的氮源。實(shí)驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)所有順序接種發(fā)酵中釀酒酵母的最大數(shù)量均低于CK，這可能是由于釀酒酵母遲于非釀酒酵母48 h接種，而在發(fā)酵前兩天的氮源被非釀酒酵母消耗，導(dǎo)致釀酒酵母的生長受到抑制，并且越高比例接種抑制作用越明顯，尤雅等也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。

綜上所述，在賀蘭山東麓‘赤霞珠’干紅葡萄酒的釀造過程中，釀酒酵母是主導(dǎo)整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程的菌屬，并與非釀酒酵母存在相互競爭關(guān)系，當(dāng)這些非釀酒酵母在前期存在的數(shù)量較多時(shí)會(huì)限制釀酒酵母的生長，相反的當(dāng)釀酒酵母在前期數(shù)量較多時(shí)也會(huì)限制非釀酒酵母的生長。不同的接種方式會(huì)影響非釀酒酵母的作用時(shí)間，順序接種發(fā)酵中非釀酒酵母幾乎可以存在貫穿整個(gè)發(fā)酵進(jìn)程，而同時(shí)接種時(shí)非釀酒酵母會(huì)較快消失。

2.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

發(fā)酵結(jié)束后的理化指標(biāo)如表1所示，所有酒樣均完成乙醇發(fā)酵，殘?zhí)琴|(zhì)量濃度都低于4 g/L，乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為12.28%～14.18%。前人研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)非釀酒酵母產(chǎn)乙醇的水平較低，如葡萄汁有孢漢遜酵母每消耗19 g/L以上的糖才能夠產(chǎn)生1%乙醇，并且在混菌發(fā)酵中能使葡萄酒中乙醇產(chǎn)量降低1.21%。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)有非釀酒酵母參與發(fā)酵的酒樣（自然發(fā)酵和混菌發(fā)酵），最終乙醇含量均低于CK，降醇幅度可達(dá)0.33%～1.9%。此外還發(fā)現(xiàn)接種比例對乙醇含量影響不大，影響較大的是接種時(shí)間，順序接種（非釀酒酵母存活時(shí)間較長）降醇效果明顯高于同時(shí)接種，這一結(jié)果與尤雅等的研究一致。乙醇產(chǎn)量的減少可能是由于非釀酒酵母的氧化代謝消耗葡萄糖不形成乙醇，而通過其他代謝途徑轉(zhuǎn)化為甘油等化合物。

表1 發(fā)酵結(jié)束后酒樣的基本理化指標(biāo)Table 1 Basic physicochemical parameters of wines measured at the end of fermentation

甘油可以使葡萄酒的口感更加圓潤，與CK相比，其余所有酒樣的甘油質(zhì)量濃度增加了0.38～1.11 g/L，其中S73510甘油質(zhì)量濃度增加了1.11 g/L，CP10增加甘油含量4.6%。研究表明，許多非釀酒酵母能夠產(chǎn)生大量的甘油，如畢赤克魯維酵母在提前48 h和96 h順序接種的混菌發(fā)酵中，甘油質(zhì)量濃度分別增加了0.33 g/L和1.3 g/L。所有酒樣的干浸出物質(zhì)量濃度在25.4～34.15 g/L之間，其中發(fā)酵畢赤酵母參與發(fā)酵的酒樣干浸出物含量顯著高于CK，CP10顯著增加干浸出物含量23.6%。

揮發(fā)酸是由微生物產(chǎn)生的腐敗代謝產(chǎn)物之一，對葡萄酒風(fēng)味產(chǎn)生負(fù)面影響。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)自然發(fā)酵與順序接種發(fā)酵可以顯著增加葡萄酒中揮發(fā)酸含量。其中SH10與自然發(fā)酵酒樣的揮發(fā)酸含量與對照相比增加了87%和70%。只有較低比例同時(shí)接種的混菌發(fā)酵模式（CH1、CP1和C7351）才能夠降低揮發(fā)酸含量。申靜云等同樣發(fā)現(xiàn)葡萄汁有孢漢遜酵母與釀酒酵母同時(shí)接種于威代爾葡萄醪中時(shí)，可以明顯降低乙酸含量26.90%。國標(biāo)對干紅葡萄酒揮發(fā)酸質(zhì)量濃度 要求是小于1 g/L，揮發(fā)酸含量過高可能會(huì)給葡萄酒帶來一定的溶劑味和酸敗感，本實(shí)驗(yàn)酒樣均在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

2.3 香氣成分分析

葡萄酒香氣是由來源于葡萄本身的揮發(fā)性化合物（品種香氣）、微生物代謝形成的化合物（發(fā)酵香氣）以及在葡萄酒陳釀過程形成的化合物（陳釀香氣）共同組成的。數(shù)百種化合物共同組成了葡萄酒的香氣，質(zhì)量濃度0.1 μg/L～100 mg/L不等。一般來說，葡萄酒可以由這些不同濃度的揮發(fā)性物質(zhì)區(qū)分，這些揮發(fā)性化合物受所使用酵母的類型和發(fā)酵條件的影響，最終對葡萄酒的香氣品質(zhì)產(chǎn)生正面或負(fù)面的影響。

發(fā)酵結(jié)束后對各個(gè)酒樣進(jìn)行揮發(fā)性香氣成分的測定及分析，結(jié)果如表2所示，列出了香氣成分的含量、閾值以及香氣特征。共測得48 種香氣物質(zhì)，其中酯類物質(zhì)最多，共25 種，包括乙酸酯4 種、乙醇酯15 種和其他酯類6 種。高級醇類物質(zhì)10 種，脂肪酸類物質(zhì)5 種，品種香氣物質(zhì)5 種以及其他化合物3 種。這些揮發(fā)性香氣物質(zhì)在葡萄酒中的總量為366.06～598.86 mg/L。只有3 種順序接種發(fā)酵酒樣（SH1、SH10、S7351）的香氣物質(zhì)含量低于對照（412.92 mg/L），其中SH1酒樣中香氣成分含量最低（366.06 mg/L）。其余酒樣的香氣物質(zhì)含量均高于對照，尤其是CP10的含量最高（598.86 mg/L）。此外，各非釀酒酵母發(fā)酵酒樣的香氣成分總量都表現(xiàn)出相似的兩點(diǎn)規(guī)律：同時(shí)接種的含量高于順序接種發(fā)酵；非釀酒酵母的接種比例越高，揮發(fā)性香氣物質(zhì)總含量越高。

表2 不同發(fā)酵處理葡萄酒的香氣成分Table 2 Volatile compounds of wine obtained by different fermentation treatments

酒樣中測得的品種香氣共5 種，包括萜烯類化合物2 種（芳樟醇和香茅醇）、降13碳異戊二烯類化合物1 種（-大馬士酮）、揮發(fā)性酚類1 種（2,4-二叔丁基苯酚）和C化合物1 種（正己醇）。其中芳樟醇、香茅醇和-大馬士酮的OAV大于1，可給葡萄酒帶來花果香氣。芳樟醇與花香、檸檬香呈正相關(guān)，實(shí)驗(yàn)中所有酒樣的芳樟醇含量均大于CK（39.85 μg/L），尤其是C7351增加了78%。檢出的43 種發(fā)酵香氣總量范圍為362.8～595.6 mg/L，占相應(yīng)酒樣香氣總量的99%以上。其中酯類物質(zhì)和高級醇類物質(zhì)占絕大部分，其次是脂肪酸、醛類物質(zhì)等。

高級醇類物質(zhì)在葡萄酒香氣中占據(jù)著不可或缺的位置，是酵母氨基酸代謝的副產(chǎn)物，通常指的是含有2 個(gè)以上碳原子的揮發(fā)性醇類。高級醇質(zhì)量濃度低于300 mg/L時(shí)能夠使葡萄酒的香氣更加復(fù)雜，但當(dāng)其總質(zhì)量濃度超過400 mg/L時(shí)，就會(huì)給人帶來強(qiáng)烈的刺鼻味和不悅感。酒樣中高級醇質(zhì)量濃度在165.2～290.7 mg/L之間，均低于300 mg/L。不同非釀酒酵母對高級醇產(chǎn)量的影響不同，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)同時(shí)接種發(fā)酵畢赤酵母（CP1、CP10），可以顯著提高高級醇物質(zhì)含量24.5%和28.1%，這與王倩倩等的研究結(jié)果相符。順序接種畢赤克魯維酵母則會(huì)使高級醇含量降低8.4%～15.1%，同樣的結(jié)果也被Whitener和Benito等證實(shí)。多個(gè)研究還報(bào)道了非

釀酒酵母與釀酒酵母結(jié)合的混菌發(fā)酵可以提高苯乙醇的含量，進(jìn)而給葡萄酒帶來蜂蜜、玫瑰、丁香花等宜人香味，如畢赤克魯維酵母、耐熱克魯維酵母和扁平云假絲酵母等。本研究也發(fā)現(xiàn)，無論是哪種接種方式，發(fā)酵畢赤酵母都可以提高苯乙醇含量14.3%～40.1%。

續(xù)表2

酯類化合物是乙醇發(fā)酵產(chǎn)生的典型副產(chǎn)物之一，主要為葡萄酒貢獻(xiàn)花香和果香，葡萄酒中的酯類物質(zhì)絕大多數(shù)形成于發(fā)酵和陳釀過程，主要包括乙酸酯和乙醇酯等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)赤霞珠酒樣中酯類物質(zhì)的總質(zhì)量濃度在163.2～299.5 mg/L之間。順序接種可以增加酯類物質(zhì)產(chǎn)量，這與張文靜等研究結(jié)果一致。乙酸苯乙酯是一種特殊的芳香化合物，當(dāng)其質(zhì)量濃度超過0.25 mg/L時(shí)，能夠給葡萄酒增添玫瑰和花的芳香。有發(fā)現(xiàn)葡萄汁有孢漢遜酵母能夠增加葡萄酒中的乙酸異戊酯與乙酸苯乙酯的含量，本研究也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果。此外利用10∶1接種的畢赤克魯維酵母（S73510和C73510）能夠分別增加乙酸苯乙酯12.4%和31.5%。其他研究也發(fā)現(xiàn)畢赤克魯維酵母能夠增加乙酸苯乙酯的含量 25%和60%。

脂肪酸包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸，而對葡萄酒香氣起重要貢獻(xiàn)作用的是飽和脂肪酸。在接近氣味閾值的水平，脂肪酸能增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，提高奶酪、黃油等風(fēng)味特征。然而在過高的濃度下，它們會(huì)使葡萄酒產(chǎn)生“汗味”、“腐臭”和“脂肪”等令人不愉快的氣味。較多研究報(bào)道，即使是使用相同的非釀酒酵母，但接種時(shí)間和接種量不同的情況下也會(huì)導(dǎo)致葡萄酒中的揮發(fā)性脂肪酸含量有很大差異。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在順序接種葡萄汁有孢漢遜酵母和畢赤克魯維酵母酵母時(shí)，脂肪酸含量下降，在同時(shí)接種中，脂肪酸含量反而上升。Hu Kai等研究表明，與純釀酒酵母發(fā)酵相比，利用葡萄汁有孢漢遜酵母順序接種發(fā)酵‘赤霞珠’葡萄酒，脂肪酸含量明顯下降，但相同條件下同時(shí)接種發(fā)酵的葡萄酒，脂肪酸含量上升明顯，相同的規(guī)律在其他研究中也被發(fā)現(xiàn)。

為了更好地區(qū)別各處理之間揮發(fā)性香氣成分的差異，利用Origin 2017軟件對所有OAV大于0.1的37 種揮發(fā)性香氣（包括22 種OAV大于1的物質(zhì)）成分及不同處理進(jìn)行PCA，前2 個(gè)PC上的香氣成分載荷及酒樣分布見圖2。PC1與PC2 分別占數(shù)據(jù)總體方差的39.1%和19.0%，總貢獻(xiàn)率為58.1%。由于接種菌種及接種時(shí)間的不同，各實(shí)驗(yàn)組在圖上有不同分布，例如對于葡萄汁有孢漢遜酵母而言，由于接種順序的不同，同時(shí)接種發(fā)酵組與順序接種發(fā)酵組分別位于圖的上下兩側(cè)，其中順序接種的發(fā)酵組（SH1、SH10）主要位于PC2的正方向上，而同時(shí)接種發(fā)酵（CH1、CH10）主要位于PC2的負(fù)方向上。對于發(fā)酵畢赤酵母而言，同時(shí)接種的發(fā)酵組（CP1、CP10）主要位于PC2的正方向上，而順序接種的發(fā)酵組（SP1、SP10）主要位于PC2的負(fù)方向上。對于畢赤克魯維酵母而言，順序接種的發(fā)酵組（S7351、S73510）主要位于PC1的正方向上，而同時(shí)接種發(fā)酵（C7351、C73510）主要位于PC1的負(fù)方向上。當(dāng)接種相同酵母的接種時(shí)間一致而接種比例不同時(shí)，各樣品分布較為貼近。然而，當(dāng)接種不同酵母或者接種時(shí)間不同時(shí)，各樣品分布較遠(yuǎn)，如圖2A中右上部分中的自然發(fā)酵、SH1、SH10與圖2B中特征香氣如乙酸酯類物質(zhì)及庚醇、壬醇相關(guān)聯(lián)。圖2B左上部分的特征性香氣物質(zhì)最多，包括11 種酯、4 種品種香氣、2 種高級醇、1 種脂肪酸和2 種其他化合物，與圖2A中CP1、CP10、SP10即發(fā)酵畢赤酵母相關(guān)聯(lián)。圖2A中左下部分，是由畢赤克魯維酵母同時(shí)接種發(fā)酵的發(fā)酵方案（C7351和C73510），與特征香氣物質(zhì)脂肪酸、香茅醇、苯乙醇、苯乙酸乙酯相關(guān)聯(lián)。

圖2 發(fā)酵結(jié)束后酒樣中OAV大于0.1的香氣化合物PCA得分圖（A）和載荷圖（B）Fig.2 Score (A) and loading plots (B) of PCA for aroma compounds(OAV > 0.1) in wines

2.4 感官品鑒分析

供試酒樣香氣特征的感官量化分析結(jié)果見圖3，所有酒樣的乙醇味均低于CK，這與理化指標(biāo)結(jié)果相符。除此之外，CK也具有最強(qiáng)的香辛料味。如圖3A所示，葡萄汁有孢漢遜酵母的存在可以給葡萄酒帶來更多的草本植物香氣和花香，其中順序接種的SH1與SH10可以增加熱帶水果香氣、堅(jiān)果香氣和溫帶水果香氣。但是葡萄汁有孢漢遜酵母也會(huì)帶來較強(qiáng)的指甲油氣味，并且接種比例越高，產(chǎn)生的影響越明顯。Hu Kai等的研究同樣發(fā)現(xiàn)，葡萄汁有孢漢遜酵母在混菌發(fā)酵中能夠增加花香和熱帶水果香氣，但是由于乙酸酯類物質(zhì)含量過高導(dǎo)致了異味（指甲油味）的產(chǎn)生。如圖3B所示，發(fā)酵畢赤酵母的參與提高了‘赤霞珠’葡萄酒的漿果香、熱帶水果香和花香，降低了指甲油的香氣，此外CP10還能夠增加堅(jiān)果和果醬味。王倩倩等也發(fā)現(xiàn)發(fā)酵畢赤酵母能夠顯著提高葡萄酒的熱帶水果香氣與花香。如圖3C所示，畢赤克魯維酵母的接入可以增加‘赤霞珠’葡萄酒熱帶水果、花香和堅(jiān)果的香氣特征，但是降低了溫帶水果的香氣特點(diǎn)。另外，在畢赤克魯維參與的條件下，完全不能感知到葡萄酒中指甲油味的存在。

圖3 ‘赤霞珠’干紅葡萄酒感官香氣輪廓圖Fig.3 Sensory aroma profile of ‘Cabernet Sauvignon’ dry red wine

3 結(jié) 論

所有的混菌發(fā)酵方案都可以降低‘赤霞珠’葡萄酒的乙醇含量，降低葡萄酒的乙醇味和香辛料味，也能夠增加葡萄酒甘油和干浸出物的含量。葡萄汁有孢漢遜酵母能夠增加揮發(fā)酸含量進(jìn)而增加指甲油的氣味，SH1和SH10與自然發(fā)酵相似，顯著增加了葡萄酒乙酸酯類揮發(fā)性香氣物質(zhì)的含量，給葡萄酒帶來較多的花香，但香氣物質(zhì)總量與CK差異不顯著。發(fā)酵畢赤酵母增加了葡萄酒發(fā)酵香氣含量，尤其是高級醇和酯類物質(zhì)，其中同時(shí)接種的CP1和CP10香氣物質(zhì)總量不僅顯著高于其他組，還為葡萄酒增加了漿果、熱帶水果、花香和堅(jiān)果等感官香氣強(qiáng)度。畢赤克魯維酵母與釀酒酵母同時(shí)接種發(fā)酵的葡萄酒揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量顯著高于CK，能夠增加乙酸苯乙酯、苯乙酸乙酯、苯乙醇和異戊醇等物質(zhì)的含量，提高了葡萄酒熱帶水果、花香和堅(jiān)果的香氣特征。

總體上，混菌發(fā)酵可以改變賀蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄酒的香氣風(fēng)格，各非釀酒酵母給葡萄酒帶來的香氣特征也各具特點(diǎn)。其中10∶1同時(shí)接種發(fā)酵畢赤酵母的混菌發(fā)酵方案CP10，在確保乙醇發(fā)酵順利完成的同時(shí)，增加了葡萄酒中干浸出物與甘油的含量，另外也能夠最大程度地發(fā)揮其產(chǎn)香特性（與CK相比揮發(fā)性香氣物質(zhì)總量提升了45%），所釀造的‘赤霞珠’葡萄酒香氣物質(zhì)最為豐富。因此，本研究認(rèn)為CP10的接種方案對賀蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄酒具有增香釀造的應(yīng)用潛力。在后期研究中，將進(jìn)一步細(xì)化發(fā)酵畢赤酵母與釀酒酵母的相互作用關(guān)系、調(diào)控其他工藝參數(shù)以確定一套完整的混菌發(fā)酵方案，以期為賀蘭山東麓‘赤霞珠’葡萄酒釀造工藝技術(shù)的研發(fā)提供理論依據(jù)。