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    蟹類水產(chǎn)品過敏原及其致敏性消減技術(shù)研究進展

    2022-08-01 04:35:32劉光明劉慶梅李夢思曹敏杰
    關(guān)鍵詞:蟹類致敏性青蟹

    劉光明, 劉慶梅, 楊 陽, 劉 萌, 李夢思, 桓 霏, 郜 帥, 曹敏杰

    (集美大學(xué) 海洋食品與生物工程學(xué)院/水產(chǎn)品深加工技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心/廈門市海洋功能食品重點實驗室, 福建 廈門 361021)

    引起機體過敏反應(yīng)的原因眾多,其中由食物引發(fā)的過敏反應(yīng)發(fā)病率不容忽視[1],食物過敏也已被世界衛(wèi)生組織列為21世紀(jì)重要的健康問題之一[2]。西方國家過敏人群的過敏食物以花生及堅果類為主,而東方國家多為魚類及甲殼類水產(chǎn)品[3]。2020年,我國甲殼類水產(chǎn)品總產(chǎn)量為603.3萬t;相較于2019年,其增長率為6.32%[4];隨著年產(chǎn)量及消費量的增加,食用甲殼類水產(chǎn)品引起的過敏問題也呈增加的趨勢。蟹類是重要的甲殼類水產(chǎn)品,其誘發(fā)的過敏反應(yīng)是由免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)E介導(dǎo)的速發(fā)型超敏反應(yīng),通常會持續(xù)終生[5]。我國香港地區(qū)的調(diào)查結(jié)果顯示,在459名過敏患者中,對蟹類、蝦類和貝類的過敏患病率分別為15.3%、13.9%和11.1%[6]。因此,蟹類引起的過敏反應(yīng)不容忽視。

    食物過敏原是指能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性IgE抗體并與之結(jié)合,進一步激活機體免疫系統(tǒng),從而引發(fā)過敏癥狀的食物特定成分。目前經(jīng)由世界衛(wèi)生組織/國際免疫學(xué)會聯(lián)合會(World Health Organization/International Union of Immunological Societies,WHO/IUIS)過敏原命名小組鑒定的超過125個物種的370種食物過敏原,90%以上為蛋白質(zhì)[7],其中已被命名的蟹類過敏原共9個。在過敏原分子中決定特異性的特殊化學(xué)基團稱為抗原表位,可被抗體或免疫受體識別[8]。目前,蟹類過敏原(如原肌球蛋白、精氨酸激酶等)的抗原表位已逐漸被定位分析。此外,多項研究表明:不同處理技術(shù)主要通過改變過敏原的結(jié)構(gòu),修飾、破壞或掩蓋過敏原的表位,從而達(dá)到消減過敏原致敏性的目的[9-10]。我國蟹類過敏的發(fā)生率較高,如何消減蟹類致敏性、促進蟹類產(chǎn)業(yè)持續(xù)健康發(fā)展已成為一個亟需解決的重要問題。本文介紹了蟹類水產(chǎn)品過敏原及過敏原表位,詳細(xì)對比了用于消減蟹類水產(chǎn)品致敏性的不同處理技術(shù),以期為蟹類低致敏食品及低致敏性生物制品的開發(fā)提供參考。

    1 蟹類水產(chǎn)品過敏原及過敏原表位

    過敏原對熱、pH值和胃腸道消化酶具有高度耐受能力,從而保留完整的表位序列和結(jié)構(gòu),可被過敏原特異性免疫細(xì)胞識別,引發(fā)特異性免疫反應(yīng),導(dǎo)致過敏癥狀[11]。隨著蛋白質(zhì)鑒定技術(shù)的進步,目前已有多種蟹類過敏原被報道,其中原肌球蛋白(tropomyosin,TM)與精氨酸激酶(arginine kinase,AK)是主要過敏原,其他次要過敏原,如肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白(sarcoplasmic calcium-binding protein,SCP)等也備受關(guān)注[12]。

    1.1 原肌球蛋白

    TM由多種肌動蛋白結(jié)合蛋白組成,主要功能是調(diào)節(jié)肌動蛋白細(xì)胞骨架[13]。1998年,在銹斑蟳(Charybdisferiatus)中TM被鑒定為過敏原,并獲批WHO/IUIS系統(tǒng)命名為Cha f 1[14]。此后TM也相繼在帝王蟹(Paralithodescamtschaticus)、中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)、青蟹(Scyllaparamamosain)、梭子蟹(Portunuspelagicus)和雪蟹(Chionoecetesopilio)等蟹類中被發(fā)現(xiàn),序列同源性均高達(dá)95%以上[15-16]。TM致敏率在23%~83%,分子質(zhì)量為34~38 kDa,氨基酸長度由284個氨基酸殘基組成,是等電點約為4.5的糖蛋白,耐熱耐酸堿,且具有良好的消化穩(wěn)定性(耐胃蛋白酶和胰蛋白酶消化)[6]。其空間結(jié)構(gòu)由兩條α-螺旋相互纏繞而成,增加了蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,使其經(jīng)高溫高壓處理后仍能保持較強的致敏性[17]。在蟹類TM的過敏原表位分析中,有研究采用消化酶水解結(jié)合質(zhì)譜分析獲得青蟹TM的7條耐熱耐消化的線性表位[18]。此外,Liu等[19]以兔抗青蟹TM多克隆抗體為靶蛋白,通過噬菌體展示技術(shù)淘選獲得青蟹TM的8條IgG線性表位與7個IgG構(gòu)象表位。

    1.2 精氨酸激酶

    AK的生理功能主要是參與細(xì)胞ATP水平的調(diào)節(jié),它可催化甲殼類動物中L-精氨酸殘基的磷酸化,這是細(xì)胞能量穩(wěn)態(tài)機制的關(guān)鍵反應(yīng)[20]。過敏原AK已在雪蟹[21]、梭子蟹[22]、青蟹[23]、褐蟹(Callinectesbellicosus)[24]等蟹類中被鑒定,分子質(zhì)量為40~42 kDa,一般由359個氨基酸殘基組成,等電點約6.0,胰酶消化240 min后仍維持原有蛋白條帶,但不耐胃蛋白酶消化。目前,青蟹AK的晶體結(jié)構(gòu)已被解析,其是由α螺旋的N端區(qū)域與α螺旋-β折疊的C端區(qū)域纏繞成的不對稱結(jié)構(gòu)[23]。與TM相比,AK不穩(wěn)定、不耐熱,且易揮發(fā),因此也被認(rèn)為是吸入蒸汽引起呼吸道過敏癥狀的過敏原之一[25]。Yang等[26]以蟹類過敏患者血清中特異性IgE為靶蛋白,通過噬菌體展示技術(shù)獲得青蟹AK的5條線性表位與8個構(gòu)象表位。利用BediPred和Discotope進行褐蟹AK的表位預(yù)測分析,得到8條潛在的線性表位和7個潛在的構(gòu)象表位,其中2條線性表位(K40-S45、S130-F136)及2個構(gòu)象表位(D106N108、E317E319G320)與青蟹AK的表位重疊[24]。

    1.3 肌質(zhì)鈣結(jié)合蛋白

    屬于鈣離子結(jié)合蛋白家族的SCP在肌肉松弛方面發(fā)揮重要作用,空間結(jié)構(gòu)包含螺旋- 環(huán)- 螺旋基序以結(jié)合鈣離子,已在雪蟹[24]、青蟹[27]中被鑒定為過敏原。其分子質(zhì)量約為20 kDa,包含194個氨基酸,等電點為4.7,在高溫(60~100 ℃)、弱酸(pH值2.0~5.0)、強堿(pH值10.0~11.0)條件下均易發(fā)生聚合,且不耐胃蛋白酶消化。Chen等[28]通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測結(jié)合血清學(xué)實驗確定了青蟹SCP的3條線性表位,Yang等[26]采用噬菌體展示技術(shù)獲得青蟹SCP的6個構(gòu)象表位。

    1.4 其他過敏原

    除了上述3種過敏原,其他一些蟹類過敏原也受到研究關(guān)注:Li等[29]鑒定了青蟹中分子質(zhì)量為18 kDa的肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC),獲批WHO/IUIS系統(tǒng)命名為Scy p 3,其對熱穩(wěn)定,包含153個氨基酸殘基,三級結(jié)構(gòu)由8個α-螺旋緊密纏繞而成,并利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合血清學(xué)實驗確定MLC的7條線性表位;Yang等[26]純化獲得了青蟹過敏原磷酸丙糖異構(gòu)酶(triosephosphate isomerase,TIM)和細(xì)絲蛋白c(filamin c,F(xiàn)LN c),分子質(zhì)量分別為28 kDa和90 kDa,均不耐熱。TIM的晶體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)二聚體且單體為(β/α)8筒狀[30],F(xiàn)LN c中過敏優(yōu)勢區(qū)(336~531個氨基酸位置)的晶體結(jié)構(gòu)是由16條β-折疊和2條α-螺旋組成的筒狀[31]。通過噬菌體展示技術(shù)獲得TIM的4條線性表位與4個構(gòu)象表位、FLN c的6條線性表位與6個構(gòu)象表位,且TIM和FLN c由于相同表位基序PLRG、P(T/K)VH(I/T)L、MQP和L- TT- GA的存在,使得二者能夠被相同的抗體識別結(jié)合[26]。血藍(lán)蛋白(hemocyanin,Hc)已在中華絨螯蟹中被鑒定,其存在3條與血清IgE結(jié)合頻率大于40%的重要線性表位[32]。

    由研究報道可知,已鑒定的蟹類水產(chǎn)品過敏原及其詳細(xì)的表位信息見表1。

    表1 蟹類水產(chǎn)品過敏原及過敏原表位

    2 蟹類水產(chǎn)品致敏性的消減技術(shù)

    基于鑒定的過敏原及其表位,選擇有效的處理方式定向消減蟹類致敏性以生產(chǎn)低致敏產(chǎn)品,已逐漸成為該領(lǐng)域發(fā)展的一個新趨勢。迄今為止,致敏性消減主要可分為物理法、化學(xué)法、生物法3大類,物理法包括熱處理、輻照、超聲技術(shù)等,化學(xué)法包括美拉德反應(yīng)等,生物法包括酶法交聯(lián)、酶解技術(shù)、微生物發(fā)酵和分子改造等[2, 10]。

    2.1 物理消減技術(shù)

    2.1.1熱處理消減

    熱處理是最常用的加工方法,包括煮制、蒸制、高壓蒸汽等,主要借助高溫影響過敏原的空間結(jié)構(gòu)、消化性和抗原表位等,以改變過敏原的致敏性。Yu等[33]發(fā)現(xiàn)煮制對TM的消化穩(wěn)定性影響不大,高壓蒸汽通過降低青蟹TM的消化穩(wěn)定性而達(dá)到消減青蟹致敏性的效果。Liu等[34]比較了蒸制、煮制和高壓對擬穴青蟹肌肉組織的影響,結(jié)果顯示高壓處理通過減少青蟹肌肉組織中的過敏原含量和種類、破壞蛋白空間結(jié)構(gòu),從而有效降低了青蟹肌肉粗蛋白的致敏性。但由于熱處理方式和蟹肉中各個過敏原耐熱性的不同,使得熱處理在降低蟹肉致敏性的研究結(jié)果中存在差異[35],因此,利用該方法有效消減蟹肉的致敏性還有待進一步深入。

    2.1.2輻照消減

    利用射線對食物進行輻照,通過產(chǎn)生電離和激發(fā)而釋放出軌道電子并形成自由基,使之與食物中的蛋白質(zhì)發(fā)生一系列物理、化學(xué)、生物化學(xué)反應(yīng),降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的降解、聚合、交聯(lián)、改性等[36]。筆者研究團隊利用輻照技術(shù)處理了中華絨鰲蟹和三疣梭子蟹的TM,結(jié)果顯示低輻照劑量(3~7 kGy)對TM致敏性無影響,當(dāng)輻照劑量提高至10 kGy時明顯破壞了TM結(jié)構(gòu)完整性,有助于其消化性的升高和致敏性的降低[37]。同樣地,張明琦等[38]發(fā)現(xiàn)隨著輻射劑量的增加,蟹粗提液的蛋白濃度下降、疏水性升高、與抗體的結(jié)合能力減弱,結(jié)果表明輻照能夠改變蟹過敏原的溶解度、空間結(jié)構(gòu)、掩蓋或破壞過敏原的抗原表位,從而有效消減其致敏性。

    2.1.3超聲消減

    超聲波是一種機械波,在傳播過程中與媒介相互作用,可以形成高速率、高剪切力的微小漩渦,誘導(dǎo)基質(zhì)的空化效應(yīng),產(chǎn)生自由基,從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變[39]。超聲處理可以引起食物組織的微觀結(jié)構(gòu)破壞、總蛋白的溶解度顯著降低,導(dǎo)致過敏原的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化、體外消化率顯著提高,從而影響食物的致敏性[40]。程華峰等[41]發(fā)現(xiàn)普通蒸煮對中華絨螯蟹肌肉粗蛋白的致敏性無影響,超聲結(jié)合蒸煮處理能促進粗蛋白中TM的降解,并降低其致敏性。此外,有研究表明:微波處理后青蟹肌肉粗提物中TM的消化穩(wěn)定性及致敏性沒有明顯變化,而超聲處理(200 W、30 ℃)、超聲結(jié)合蒸煮處理均能使青蟹TM快速消化從而降低蟹肉的致敏性,其中超聲結(jié)合蒸煮處理的效果更顯著[42]。

    2.2 化學(xué)消減技術(shù)

    蟹類水產(chǎn)品致敏性的化學(xué)消減技術(shù)是通過美拉德反應(yīng)完成。美拉德反應(yīng)是利用食物中的游離氨基或者氨基酸殘基與還原糖(果糖、木糖、阿拉伯糖、麥芽糖等)的羰基在一定溫度下發(fā)生非酶褐變的反應(yīng)[43]。迄今為止,美拉德反應(yīng)消減食物過敏原致敏性的研究越來越多,其主要機理在于還原糖通過修飾過敏原的關(guān)鍵位點來降低其與特異性抗體的結(jié)合,以達(dá)到食物減敏或脫敏的效果[44]。Han等[45]將擬穴青蟹TM、AK與L-阿拉伯糖反應(yīng)后,由于過敏原的表位發(fā)生糖化修飾而被掩蓋、破壞,使得TM美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的脫顆粒能力降低了12.5%,AK美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的脫顆粒能力降低了30.0%。擬穴青蟹SCP與木糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后,二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,且糖化修飾產(chǎn)生的糖鏈對過敏原表位形成封閉作用,使其能夠顯著下調(diào)過敏患者嗜堿性粒細(xì)胞表面CD63分子的表達(dá),陽性細(xì)胞下降比例為20.44%~90.83%,最終有效消減了SCP的致敏性[27]。

    2.3 生物消減技術(shù)

    2.3.1酶法交聯(lián)消減

    在溫和的反應(yīng)條件下,交聯(lián)酶(漆酶、谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶、酪氨酸酶、過氧化物酶等)可以通過分子內(nèi)或分子間共價鍵誘導(dǎo)蛋白質(zhì)交聯(lián),進而影響蛋白質(zhì)的空間構(gòu)象[46]。目前,酶與過敏原的交聯(lián)在降低食物過敏原致敏性方面顯示出廣闊的前景。酪氨酸酶和辣根過氧化物酶均能與擬穴青蟹TM發(fā)生交聯(lián),產(chǎn)生的大分子物質(zhì)的疏水性明顯變化、致敏性顯著降低,并在一定程度上誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)耐受[47]。Fei等[48]發(fā)現(xiàn)在咖啡酸和酪氨酸酶催化下與擬穴青蟹AK有效交聯(lián),交聯(lián)產(chǎn)物耐胃蛋白酶消化、二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,且由于抗原表位被覆蓋而降低肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺的能力,并在小鼠體內(nèi)顯示致敏性降低。

    2.3.2酶解消減

    酶解技術(shù)作為一種高效、安全、環(huán)保的傳統(tǒng)食品加工方法應(yīng)用于食品工業(yè),蛋白酶可水解斷裂過敏原的肽鍵來破壞其空間結(jié)構(gòu)和線性表位,以達(dá)到降低過敏原致敏性的目的[49]。有研究發(fā)現(xiàn)在3種蛋白酶(胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及蛋白酶P)的消化作用下,北海道毛蟹和雪蟹提取物的致敏性幾乎完全喪失[50]。同樣地,Yu等[51]利用胃蛋白酶處理擬穴青蟹AK,酶解產(chǎn)物的IgE結(jié)合能力明顯降低,提示AK消化產(chǎn)物的IgE結(jié)合位點可能在消化過程中被部分或全部破壞,從而減弱了與血清IgE抗體的反應(yīng)能力。酶解技術(shù)能夠有效消減過敏原的致敏性,但仍受到酶的種類、酶解模式、酶解程度等因素的影響。

    2.3.3微生物發(fā)酵消減

    發(fā)酵法是生物技術(shù)中最早發(fā)展和應(yīng)用的食品加工技術(shù)之一,利用微生物的代謝活動,通過生物催化劑(微生物細(xì)胞或酶)將有機物質(zhì)轉(zhuǎn)化成產(chǎn)品的過程[52]。有研究利用發(fā)酵技術(shù)消減小龍蝦及魚類致敏性的同時,還能保持水產(chǎn)品的營養(yǎng)[53-54]。同時,趙丹丹等[55]通過乳酸菌和酵母菌混合發(fā)酵大閘蟹,獲得了低致敏性的蟹肉,且產(chǎn)品具有良好的口感與風(fēng)味。由于微生物的參與,在發(fā)酵過程中需要優(yōu)化多種條件,以獲得期望的效果。但不同食品發(fā)酵所需的菌株及時間等條件的差異,制約了該方法在食品加工中的廣泛應(yīng)用。

    2.3.4分子改造消減

    分子改造技術(shù)已逐漸成為獲得理想蛋白質(zhì)的常用方法,對誘發(fā)免疫反應(yīng)的抗原表位進行表位刪除、突變等,能夠有效降低過敏原的IgE結(jié)合能力和致敏性。Liu等[19]利用定點突變技術(shù)突變青蟹TM抗原表位上的關(guān)鍵氨基酸,顯著降低了TM的IgE結(jié)合能力。Xia等[30]將青蟹TIM構(gòu)象表位上的關(guān)鍵氨基酸突變?yōu)楸彼?,獲得了低致敏性突變體。對青蟹SCP構(gòu)象表位關(guān)鍵氨基酸及鈣離子結(jié)合位點進行替換,有效消減了SCP的致敏性[56]。此外,Li等[57]通過敲除青蟹TM、MLC耐熱耐消化的線性表位構(gòu)建了2種突變衍生物,與野生型過敏原相比,該類衍生物表現(xiàn)出顯著降低的IgE結(jié)合能力和致敏性。

    當(dāng)前對于蟹類水產(chǎn)品致敏性消減技術(shù)的研究中,物理法、化學(xué)法及生物法中的酶法交聯(lián)、酶解法研究較多,而生物法中的微生物發(fā)酵、分子改造尚處于起步階段。蟹類水產(chǎn)品致敏性消減處理技術(shù)的對比分析見表2。

    3 總結(jié)與展望

    迄今為止,已有多種蟹類中的過敏原被鑒定、抗原表位被定位,同時,物理法、化學(xué)法、生物法均能夠改變蟹肉中過敏原的結(jié)構(gòu)、并對其抗原表位進行修飾、破壞或掩蓋等,從而有效消減了蟹肉的致敏性。雖然不同處理方式在蟹類致敏性消減方面取得了一定的進展,但仍然存在一些問題有待深入:1)蟹類水產(chǎn)食物中復(fù)雜的基質(zhì)對加工效果存在影響,因此蟹類水產(chǎn)品過敏原結(jié)構(gòu)與致敏性的構(gòu)效關(guān)系解析是該領(lǐng)域的研究難點。2)實驗室研發(fā)與工業(yè)化生產(chǎn)之間存在多種技術(shù)銜接問題,目前難以實現(xiàn)低致敏性蟹類食品的大規(guī)模量產(chǎn),對于當(dāng)前效果明顯的消減處理方式亟須進行工業(yè)化中試。3)單一的加工技術(shù)難以同時消減蟹肉中多個過敏原的致敏性,現(xiàn)有蟹類產(chǎn)品的工業(yè)化生產(chǎn)大多涉及熱處理,利用多種加工方法聯(lián)合處理進行探究,例如將熱處理與超聲技術(shù)或美拉德反應(yīng)技術(shù)或酶法處理技術(shù)等聯(lián)用有望更大程度地降低其致敏性,以促進蟹類產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

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