猴痘病毒感染動物模型研究及應(yīng)用進(jìn)展

劉江寧

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實驗動物研究所,北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心,北京 100021)

2022 年5 月,世界上多個國家發(fā)生人感染猴痘病毒(Monkeypox)病例,確診和疑似病例在1 個月內(nèi)超過百例,患者主要來自歐洲和美洲[1-2]。 同年5月21 日,世界衛(wèi)生組織(WHO)發(fā)布猴痘病毒疫情爆發(fā)預(yù)警。 猴痘病毒最早發(fā)現(xiàn)于1958 年,猴痘病毒感染人病例最早于1970 年發(fā)現(xiàn)于剛果[3],通常在西非和中非國家出現(xiàn)猴痘散發(fā)病例,病例通過直接接觸感染動物的血液、體液、皮膚或粘膜損傷而被病毒感染。 因密切接觸感染者的呼吸道分泌物、皮膚損傷或病人污染物可導(dǎo)致人際間的二次傳播[4]。猴痘主要癥狀為發(fā)熱、頭痛、肌肉疼痛,典型特征為不同程度的皮疹。 猴痘通常是一種自限性疾病,持續(xù)14～21 d 多可自愈。 猴痘病毒主要包括西非和剛果盆地兩個分支,其中西非分支的致死率約1%,剛果盆地分支的致死率約10%,兒童、青年和免疫缺陷者感染后致死率較高[4]。

猴痘病毒屬于痘病毒科(Poxviridae),痘病毒為病毒顆粒最大的一類DNA 雙鏈線性病毒,病毒顆粒呈磚形或橢圓形,大小為200～400 nm,病毒在感染細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制。 痘病毒科包括兩個病毒亞科:脊椎動物痘病毒亞科(Chordopoxvirinae)和昆蟲痘病毒亞科(Entomopoxvirinae)。 脊椎動物痘病毒亞科包含9 個屬:正痘病毒屬(Orthopoxvirus)、副痘病毒屬(Parapoxvirus)、豬痘病毒屬(Suipoxvirus)、山羊痘病毒屬 (Capripoxvirus)、 鹿痘病毒屬(Cervidopoxvirus)、兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)、雞痘病毒屬(Avipoxvirus)、雅塔痘病毒屬(Yatapoxvirus)和軟疣病毒屬(Molluscipoxvirus),猴痘病毒、牛痘病毒(Cowpoxvirus)與著名的天花病毒(Smallpox)同屬于正痘病毒屬。 其中,可導(dǎo)致人類疾病的主要是正痘病毒和副痘病毒,包括天花病毒、猴痘病毒、牛痘病毒、駱駝痘病毒(Camelpox virus) 和痘苗病毒(Vaccinia virus)[5]。 由于親緣關(guān)系相近,接種天花疫苗可有效抵抗猴痘病毒感染[6],但自1980 年停止接種天花疫苗后,猴痘病毒感染病例呈上升趨勢[7-8]。

動物模型是研究傳染病的病原學(xué)、免疫學(xué)和病理學(xué)機(jī)制的工具,也是評價疫苗、抗體和藥物有效性的工具,基于動物模型開展傳染病基礎(chǔ)研究和防治策略轉(zhuǎn)化是控制疫情擴(kuò)散和臨床救治的基礎(chǔ)。傳染病動物模型構(gòu)建的主要難點是非人獸共患病的人類病原的宿主范圍窄,導(dǎo)致人類病原對大部分動物的嗜性較差,表現(xiàn)為動物對病原感染不敏感,病原難以在動物體內(nèi)復(fù)制并引發(fā)病理損傷。 對于猴痘動物模型研制來說,幸運的是,據(jù)報道多種動物對猴痘病毒敏感,包括松鼠、樹松鼠、跳鼠、岡比亞袋鼠、負(fù)鼠、刺猬、土撥鼠、睡鼠、豪豬、家豬、食蟻獸、象鼩,以及各種非人靈長類動物如恒河猴與食蟹猴等[8-9],為猴痘動物模型的研制帶來了便利,而豚鼠和金黃地鼠等則對猴痘病毒敏感性較差。 本文將綜述猴痘病毒感染不同物種動物模型的研究進(jìn)展,并比較不同動物模型的病原學(xué)和病理學(xué)特征,以及動物模型的應(yīng)用情況。

1 人猴痘臨床表現(xiàn)及診斷

人感染猴痘病毒后的疾病潛伏期為7～14 d,前4 d 可出現(xiàn)頭疼和疲勞癥狀,隨后出現(xiàn)發(fā)熱癥狀,面部出現(xiàn)丘疹、水泡和膿皰,皮疹從面部向全身擴(kuò)散,包括四肢、手部和腳部,以及生殖器,進(jìn)而形成結(jié)痂病變,并出現(xiàn)淋巴結(jié)病。 猴痘的并發(fā)癥包括嘔吐和腹瀉、結(jié)膜炎和角膜瘢痕、敗血癥、腦炎和支氣管肺炎。 疾病一般持續(xù)4 周,隨后皮疹脫落自愈,常見的后遺癥包括繼續(xù)性細(xì)菌感染導(dǎo)致的永久性瘢痕[10]。孕婦感染后易流產(chǎn)和出現(xiàn)更嚴(yán)重的疾病[11]。 皮膚病變的組織病理學(xué)特征為表皮增生、角化細(xì)胞球囊變性并伴有包漿內(nèi)包涵體、表皮內(nèi)小泡和膿皰,皮膚水腫并伴隨淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞浸潤,角質(zhì)細(xì)胞內(nèi)可見痘病毒顆粒[12]。 人感染猴痘病毒與天花病毒最主要的區(qū)別之一是前者會導(dǎo)致淋巴結(jié)病,但缺乏淋巴結(jié)病及其它臟器病理的臨床研究報道。

猴痘病毒的實驗室診斷主要采用實時熒光定量PCR 法檢測病毒DNA[13-14],采用猴腎細(xì)胞(Vero或者Vero E6)進(jìn)行分離培養(yǎng),并輔助以電鏡觀察[15]。 免疫學(xué)檢測方法包括ELISA 檢測病毒特異的IgG 和IgM,以及免疫組化方法檢測病毒抗原[16]。臨床檢測可見白細(xì)胞增多、輕度至中度的低蛋白血癥和血小板減少[17]。

2 猴痘動物模型

非人靈長類動物對猴痘病毒天然敏感,此外,地松鼠、岡比亞袋鼠、睡鼠和繩松鼠等嚙齒類動物在猴痘病毒從非洲向美洲的傳播中起到了中間宿主作用,這些動物將病毒傳播至圈養(yǎng)的美國土撥鼠,從而導(dǎo)致人感染猴痘病毒疫情的發(fā)生[18]。 因此,非人靈長類動物和嚙齒類動物常被用于猴痘感染動物模型的研究。

2.1 非人靈長類動物模型

2.1.1 食蟹猴模型

最具有猴痘特征的是靜脈感染食蟹猴(Macaca fascicularis)為代表的非人靈長類動物模型[19]。 但是,靜脈感染方式繞過了潛伏期和原發(fā)性病毒血癥階段,人工導(dǎo)致了繼發(fā)性病毒血癥,直接導(dǎo)致主要器官和皮膚感染病毒。 而在臨床上,猴痘病毒被普遍認(rèn)為是通過密切接觸或吸入液滴。 由于靜脈感染途徑不同于臨床感染途徑,且沒有潛伏期,不適用于評價抗氣溶膠暴露感染的疫苗和藥物[20]。 Goff等[20]與Zaucha 等[21]先后采用氣溶膠感染途徑,建立了猴痘病毒感染食蟹猴模型。 動物感染后出現(xiàn)皮膚和黏膜損傷、輕度厭食、發(fā)熱、咳嗽和流鼻涕癥狀,隨后出現(xiàn)呼吸困難,9～17 d 死亡。 感染動物的肺、脾內(nèi)病毒滴度最高,同時可從肝、腎和腎上腺內(nèi)分離到病毒。 動物尸檢均見肺重、充血和實變,出現(xiàn)深紅色的小葉斑駁水腫、肺失張和壞死,偶爾可見纖維蛋白性胸膜炎和內(nèi)臟胸膜多灶性白色斑塊樣增厚,組織病理學(xué)表現(xiàn)為支氣管肺炎、肺水腫、壞死性血管炎,可觀察到壞死性淋巴結(jié)炎和淋巴濾泡壞死,巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤的脾炎,上皮細(xì)胞腫脹、壞死、潰瘍和增生,可見胞質(zhì)包涵體。 此外,可觀察到胃腸道、氣管、喉部、縱膈、扁桃體、胸腺、生殖系統(tǒng)和肝的病變(見表1)。 食蟹猴模型的特點是可模擬臨床癥狀,但靜脈感染對病毒劑量要求高,且與自然感染途徑不吻合,氣溶膠感染模型較好的解決了該問題,適合于阻斷型疫苗和藥物的評價。

2.1.2 狨猴模型

食蟹猴模型對猴痘病毒的感染劑量要求高,研究報道中使用的感染劑量一般超過每只104PFU,甚至達(dá)到每只106PFU[20],如此高的感染劑量不同于自然感染方式。 Mucker 等[22]發(fā)現(xiàn)狨猴(Callithrix jacchus)對猴痘病毒十分敏感,分別采用不同劑量的猴痘病毒靜脈注射感染狨猴后,發(fā)現(xiàn)接種超過48 PFU 即可導(dǎo)致部分動物死亡,而超過510 PFU 可導(dǎo)致動物全部死亡。 動物感染后出現(xiàn)嗜睡、活動度下降和皮膚紅斑等癥狀,部分動物全身出血,并出現(xiàn)淋巴結(jié)病。 動物感染后3 d 出現(xiàn)明顯的病毒血癥,上皮細(xì)胞、肝、粘膜和淋巴結(jié)可檢測到病毒。 尸檢可見外周淋巴結(jié)增大并呈深紅色、皮下水腫、肝和肺病變,以及膀胱、睪丸、腎、胃、結(jié)腸和結(jié)膜等出血,多個組織可見廣泛的巨噬細(xì)胞浸潤(見表1)。狨猴模型與睡鼠模型類似,均出現(xiàn)了嚴(yán)重的出血癥狀,與出血型天花類似。 狨猴模型的特點是對猴痘病毒十分敏感,低劑量致死,且可出現(xiàn)出血癥狀,適合于研究感染機(jī)制和重癥機(jī)制。

2.2 嚙齒類動物模型

2.2.1 土撥鼠模型

土撥鼠(Cynomysludovicianus)被認(rèn)為是2003年美國人感染猴痘病毒疫情的中間宿主[18],由于其對猴痘病毒的易感性,被不同的研究團(tuán)隊用于構(gòu)建動物模型。 Xiao 等[23]分別通過滴鼻和腹腔注射兩種途徑,對土撥鼠感染西非分支的猴痘病毒,感染4 d 后動物出現(xiàn)嗜睡和厭食癥狀,唇部和舌部出現(xiàn)水泡,伴隨鼻塞和膿性鼻涕,并在8～14 d 內(nèi)死亡,其中滴鼻感染動物存活時間較長。 感染5～6 d 后咽部和血液可檢測到病毒,肝和脾內(nèi)病毒滴度最高,腎和肺內(nèi)較低,滴鼻感染動物的病毒滴度相對較低。 尸檢可見肺水腫、出血和壞死,滴鼻感染動物肺部病變相對嚴(yán)重,腹腔注射感染動物脾呈中度至重度壞死和肝小葉壞死,脂肪組織呈多灶性壞死(見表1)。

Hutson 等[24]通過滴鼻和皮內(nèi)注射兩種途徑,分別對土撥鼠感染西非分支和剛果盆地分支的猴痘病毒,6～12 d 后,動物頭部、四肢和軀干出現(xiàn)典型的黃斑、水泡和膿皰,部分動物死亡。 血液、口、鼻和眼部分泌物、糞便中可檢測到病毒,除血液外,上述樣品均可分離到病毒。 尸檢時病變部位、心、肺、肝、脾、腎、皮膚、淋巴結(jié)和腦內(nèi)可檢測到病毒,但未進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。 在該模型中,動物在囊泡和膿皰病變、口腔病變、呼吸道癥狀、嗜睡和厭食等方面與人感染猴痘病毒癥狀相似。 此外,猴痘病毒與天花病毒的典型區(qū)別之一是前者感染會導(dǎo)致淋巴結(jié)病,土撥鼠模型雖然未出現(xiàn)淋巴結(jié)病,但可在淋巴結(jié)中檢測到猴痘病毒(見表1)。

土撥鼠模型的特點是可出現(xiàn)典型的猴痘癥狀,且高劑量排毒,適用于發(fā)病機(jī)制和病毒傳播研究。

2.2.2 松鼠模型

松鼠是猴痘病毒的敏感物種之一[9]。Marennikova 等[25]和Hutson 等[26]分別采用滴鼻、經(jīng)口和皮膚劃痕等方式對成年普通松鼠(Sciurus vulgaris)感染猴痘病毒。 滴鼻和經(jīng)口感染的動物疾病進(jìn)程快于皮膚劃痕感染動物,癥狀包括發(fā)熱、活動度下降、厭食、鼻炎、咳嗽和呼吸困難,7～8 d 后死亡率達(dá)100%,但動物未出現(xiàn)皮膚病變。

Tesh 等[27]應(yīng) 用 地 松 鼠 (Spermophilus tridecemlineatus)進(jìn)行了猴痘病毒感染模型的探索研究。 腹腔注射或滴鼻感染后,動物均在4～5 d 出現(xiàn)嗜睡和厭食癥狀,并在5～7 d 內(nèi)死亡,未見皮膚損傷、呼吸窘迫或其它癥狀。 感染3 d 后可在血液中檢測到病毒,其中肝和脾內(nèi)病毒滴度最高,腎和肺內(nèi)其次,心和腦內(nèi)最低。 組織病理學(xué)改變主要為肝細(xì)胞變性或壞死,細(xì)胞質(zhì)中可見包涵體,脾出現(xiàn)中度至明顯的壞死,肺實變和間質(zhì)性肺炎,淋巴結(jié)局灶性壞死等(見表1)。 與土撥鼠模型相比,地松鼠感染后的存活時間更短,病變程度更重,提示其適用于研究人感染猴痘病毒重癥的發(fā)病機(jī)制。

研究人員曾在剛果民主共和國發(fā)現(xiàn)1 只瀕死的繩松鼠(Funisciurus sp.),在其體內(nèi)分離到猴痘病毒[28]。 隨后,在繩松鼠、太陽松鼠和非人靈長類動物血清內(nèi)檢測到病毒抗體,其中繩松鼠的血清陽性率最高[29],流行病學(xué)研究推測繩松鼠與幾起人猴痘病毒疫情相關(guān)[30]。 因此,Falendysz 等[31]分別采用皮內(nèi)注射和滴鼻途徑對繩松鼠感染猴痘病毒,動物出現(xiàn)皮膚和口腔痘樣病變和膿皰、鼻涕等癥狀,部分動物死亡。 大部分動物可檢測到病毒血癥,皮內(nèi)注射可導(dǎo)致皮膚和口腔部位較高的病毒含量,而滴鼻感染后病毒主要分布于唇部和舌部,肺、脾和唾液腺可檢測到病毒,動物口腔排毒。 組織病理學(xué)改變?yōu)樯掀ぴ錾蛪乃?皮內(nèi)中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤,肺水腫和間質(zhì)性肺炎,腎、心臟和胃可見炎癥(表1)。 繩松鼠模型表現(xiàn)出與感染途徑無關(guān)的較強(qiáng)排毒能力,因此,繩松鼠有可能作為病毒的放大宿主,增加了猴痘病毒向人類更可能接觸的其他物種動物傳播的可能性,適用于病毒學(xué)和傳播研究。

2.2.3 岡比亞袋鼠

2003 年,由于進(jìn)口了幾種嚙齒類動物,猴痘病毒傳播至美國,最初感染了圈養(yǎng)的北美土撥鼠,隨后傳播至人類,當(dāng)時在環(huán)尾鼠(Hybomys sp.)、樹松鼠(Heliosciurus sp.)、 岡比亞袋鼠(Cricetomys gambianus)、睡鼠(Graphiuruskelleni)、帚尾豪豬(Atherurus sp.)和繩松鼠(Funisciurus sp.)等6 種非洲嚙齒類動物體內(nèi)分離到了活病毒[18],其中,岡比亞袋鼠存在持續(xù)性病毒感染[32]。 Falendysz 等[33]使用岡比亞袋鼠進(jìn)行了猴痘病毒滴鼻感染實驗,動物無明顯癥狀,而皮內(nèi)注射感染后動物出現(xiàn)嗜睡、厭食和體重減輕等癥狀,并出現(xiàn)皮膚損傷和口腔水泡。 兩種感染途徑均可在眼、鼻、口和頸部淺表淋巴結(jié)檢測到病毒,動物的口、鼻、肛和結(jié)膜部位排毒。 皮內(nèi)注射感染可在唾液腺、肺、小腸、睪丸、卵巢、腦、皮膚、舌和腹股溝淋巴結(jié)中分離到滴度較高的病毒,頜下淋巴結(jié)和腎內(nèi)含活病毒。 滴鼻感染后肺、脾、食管和腎內(nèi)病毒核酸陽性,但未分離到活病毒(見表1)。 岡比亞袋鼠較強(qiáng)的排毒能力,提示其可能為潛在的猴痘病毒傳播宿主,適用于病毒傳播研究。 Huston 等[34]分別用西非分支和剛果盆地分支猴痘病毒經(jīng)皮內(nèi)注射感染岡比亞袋鼠,結(jié)果與前者研究結(jié)果一致,動物癥狀較輕,絕大多數(shù)動物存活,且排出大量活病毒,驗證了其作為潛在傳播動物的可能性。 遺憾的是,兩個研究團(tuán)隊均沒有觀察動物組織病理學(xué)改變。

2.2.4 睡鼠模型

雖然土撥鼠和松鼠是較為理想的猴痘病毒感染動物模型,但由于這兩種動物每年僅繁育1 胎,因此導(dǎo)致動物供應(yīng)有限,部分實驗用動物來自野外棲息地捕獲,動物的微生物背景和健康狀況難以控制。 睡鼠是產(chǎn)自非洲的一種體型與小鼠相似的嚙齒類動物,也是2003 年非洲猴痘病毒傳播至美國的疑似元兇之一[18]。 Schultz 等[35]使用非洲睡鼠建立了猴痘病毒感染模型,足墊注射感染后,動物在7～11 d 內(nèi)死亡。 滴鼻感染劑量每只大于200 PFU 時致死率也達(dá)到100%,且動物感染3 d 后出現(xiàn)脫水和結(jié)膜炎癥狀,可在鼻腔灌洗液、脾、肝、肺和血液中檢測到病毒,其中肝內(nèi)病毒滴度最高。 尸檢可見消化道出血、肝腫大和淋巴結(jié)病,組織病理學(xué)表現(xiàn)為鼻炎、淋巴結(jié)壞死、肝細(xì)胞壞死、多器官出血,多組織胞漿內(nèi)可見病毒包涵體(見表1)。 猴痘病毒感染睡鼠模型的許多表現(xiàn)與天花病人類似,尤其是出血型的天花病。 出血型天花病人占比為10%,但死亡率接近100%[36],睡鼠模型的多器官出血特性使其適用于做為研究天花出血機(jī)制的參比模型,且由于睡鼠的繁育特點,以及對猴痘病毒的敏感性,可批量用于評價疫苗和藥物的有效性。

2.2.5 小鼠模型

除上述特色的動物模型之外,Osorio 等[37]對猴痘病毒改造并引入熒光標(biāo)記,隨后通過灌胃感染BALB/c 小鼠和SCID 免疫缺陷小鼠,實時觀察了病毒在小鼠體內(nèi)的分布。 BALB/c 小鼠感染后,5 d 出現(xiàn)豎毛、厭食和或動物下降等癥狀,10 d 后恢復(fù)正常,可在腹腔內(nèi)一過性的觀察到病毒復(fù)制,偶爾可在腋窩淋巴結(jié)觀察到病毒,BALB/c 小鼠僅表現(xiàn)為癥狀較輕的自限性感染。 SCID 小鼠感染后初期癥狀與BALB/c 小鼠相似,但在9 d 內(nèi)死亡,可在卵巢、腸肌壁和足部皮膚觀察到病毒,肺、心、肝、腎和胰腺中也可觀測到病毒。 主要組織病理學(xué)表現(xiàn)為卵巢嚴(yán)重壞死、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤,皮膚過度角化、棘皮病和炎癥,皮內(nèi)大皰水腫和氣球樣變性(表1)。 免疫缺陷小鼠雖然感染后出現(xiàn)全身性疾病,并在多個組織和器官內(nèi)檢測到病毒,但是沒有觀察到類似于人和猴感染猴痘病毒后的皮疹癥狀,表明該模型在研究皮疹發(fā)生機(jī)制方面有所欠缺。 隨后,Huston 等[38]分別采用西非分支和剛果盆地分支猴痘病毒,經(jīng)足墊注射或滴鼻感染了BALB/c 小鼠和C57BL/6 小鼠,動物僅在6 d 后出現(xiàn)了一過性的豎毛、體重下降等癥狀,足墊注射組動物出現(xiàn)了注射部位水腫,無其它明顯的疾病表現(xiàn)。 BALB/c 小鼠與C57BL/6 小鼠相比,對猴痘病毒感染更加敏感,表現(xiàn)為體重下降更明顯。 Sergeev等[39]對ICR 小鼠經(jīng)滴鼻感染了猴痘病毒,并與兔和小型豬做了致病力比較。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)成年兔與小型豬對病毒感染不敏感,ICR 小鼠感染后7～13 d 內(nèi)出現(xiàn)化膿性結(jié)膜炎、眼瞼炎和豎毛等癥狀,隨后逐漸康復(fù)。 2～9 d 為病毒復(fù)制高峰期,血液、鼻腔粘膜、肺、脾、十二指腸、腦、氣管、肝和腎內(nèi)均可檢測到較高的病毒滴度,9 d 后病毒滴度逐漸下降。 主要組織病理變化發(fā)生在肺部和氣管,表現(xiàn)為肺間隔增寬和水腫、毛細(xì)血管滲出。 電鏡觀察可見氣管和支氣管上皮細(xì)胞損壞、細(xì)胞核變形、血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等(表1)。 上述研究表明,免疫功能健全的成年小鼠對猴痘病毒敏感性低,不適用于病毒學(xué)、免疫學(xué)、病理學(xué)和藥效學(xué)研究。

表1 猴痘病毒感染動物模型比較分析Table 1 Comparison analysis on different animal models of Monkey pox

續(xù)表1

續(xù)表1

雖然成年小鼠對猴痘病毒敏感性低,但研究發(fā)現(xiàn)感染結(jié)果可受動物日齡和接種途徑的影響。Marennikova 等[9]發(fā)現(xiàn)成年小鼠顱內(nèi)接種猴痘病毒的死亡率是100%,與此類似,乳鼠滴鼻感染猴痘病毒的死亡率也是100%。 8 日齡小鼠經(jīng)足墊注射、腹腔注射和滴鼻接種猴痘病毒后,死亡率也可達(dá)100%,而皮內(nèi)注射或灌胃感染的致死率分別為50%與40%。 隨著小鼠日齡增長,對病毒敏感性下降,灌胃感染14 日齡小鼠的死亡率下降至14%。 但滴鼻感染15 日齡小鼠的死亡率依然為100%[9]。 同樣,1 ～ 3 日齡大鼠滴鼻感染猴痘病毒死亡率達(dá)100%。 但是,低日齡大小鼠在評價藥物和疫苗有效性方面存在操作和實驗設(shè)計上的困難,且由于其免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全,限制了其應(yīng)用范圍。

近年來隨著技術(shù)發(fā)展,人源化小鼠成為研究傳染病的有力模型。 Huston 等[40]應(yīng)用NSG 小鼠分別進(jìn)行人的外周血單核細(xì)胞、造血干細(xì)胞和胎肝的移植,研制了不同類型的人源化小鼠模型,隨后對動物滴鼻接種天花病毒。 感染后部分動物出現(xiàn)了皮膚病變,主要癥狀為體重下降,高劑量組發(fā)生死亡。病理表現(xiàn)為多灶性合并肝壞死,皮膚呈表皮增生和過度角化,其它多個器官也可見病變。 與猴痘病毒較為廣泛的宿主范圍不同,天花病毒只感染人類,給天花動物模型構(gòu)建帶來困難,人源化小鼠模型是天花動物模型研制的一次成功嘗試,也對研究猴痘病毒與人免疫系統(tǒng)互作有一定的借鑒意義。

2.3 兔模型

Sergeev 等[39]發(fā)現(xiàn)兔對滴鼻接種猴痘病毒不敏感。 但是,Marennikova 等[9]研究發(fā)現(xiàn)兔對猴痘病毒的敏感性與日齡和感染途徑相關(guān)。

靜脈接種猴痘病毒可導(dǎo)致成年兔發(fā)生急性疾病,出現(xiàn)發(fā)熱、結(jié)膜炎和鼻炎,以及皮膚與粘膜部位廣泛的皮疹。 皮疹在感染后5～6 d 出現(xiàn),并從丘疹進(jìn)展為膿皰,甚至出血,僅極少數(shù)動物死亡。 感染之初可從血液中分離到病毒,7 d 后可從部分淋巴結(jié)和腎分離到活病毒,甚至部分動物睪丸內(nèi)也可分離到病毒[9]。 該研究表明靜脈接種成年兔是較為成功的猴痘感染動物模型,但由于接種方式不同于自然感染途徑,限制了其在病毒入侵機(jī)制研究方面的應(yīng)用。

年幼兔對猴痘病毒更敏感。 10 日齡兔經(jīng)口感染猴痘病毒后,4～6 d 出現(xiàn)癥狀,包括皮疹、食欲不振和腹瀉,皮疹在耳朵內(nèi)側(cè)、鼻部和唇部出現(xiàn),繼發(fā)化膿性結(jié)膜炎和鼻炎,皮疹進(jìn)而擴(kuò)散至全身,體重下降并在4～14 d 內(nèi)死亡。 可從感染動物的血液、肺、肝、腎和脾內(nèi)分離到病毒。 10 日齡兔對滴鼻接種同樣敏感,表現(xiàn)為厭食和體重下降,動物在4～5 d內(nèi)死亡,但未出現(xiàn)皮疹[9]。 10 日齡兔模型可作為非人靈長類動物模型和土撥鼠模型等的補(bǔ)充,適用于病毒性核病理學(xué)研究,以及藥物評價,但由于其日齡低、免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育成熟,限制了其在免疫學(xué)研究和疫苗評價方面的應(yīng)用。

3 猴痘動物模型的應(yīng)用

猴痘動物模型被應(yīng)用于藥物篩選與評價、西非分支與剛果盆地分支致病力比較研究、猴痘病毒傳播研究、疫苗保護(hù)效果評價,以及免疫學(xué)、病理學(xué)等研究,本文主要介紹其在前四個方面的應(yīng)用情況。

3.1 藥物篩選與評價

在感染途徑、感染劑量、病毒復(fù)制水平和癥狀等方面接近臨床的動物模型可以用于藥物評價,目前,土撥鼠、睡鼠、地松鼠和小鼠模型曾被用于評價猴痘藥物。 Schultz 等[35]在構(gòu)建猴痘病毒感染非洲睡鼠模型的基礎(chǔ)上,用該模型評價了西多福韋(Cidofovirb)對猴痘的抗感染效果。 作者發(fā)現(xiàn)在感染前4 h 內(nèi)給予一次西多福韋治療,可將干預(yù)組動物的死亡率降低至19%,而安慰劑組的死亡率為100%。 Smith 等[41]應(yīng)用土撥鼠模型評價了ST246對猴痘的治療效果,對土撥鼠滴鼻接種猴痘病毒后,分別選擇感染后0、3 d 或出現(xiàn)皮疹后3 個時間點,開始每日給予ST246 治療,與安慰劑組相比,0 d和3 d 開始給藥組動物未出現(xiàn)明顯的疾病癥狀或死亡,而出現(xiàn)皮疹后給藥組動物體重依然下降,癥狀與安慰劑組相似但是相對較輕,且病變很快恢復(fù)。但3 種治療方式都未能阻止動物排毒。 在猴痘藥物的動物模型評價方面,Huston 等[26]進(jìn)行了較為系統(tǒng)的概括總結(jié)。

3.2 不同分支毒株致病力比較

根據(jù)臨床表現(xiàn)、流行病學(xué)特征、地理位置和基因分型,猴痘病毒包含剛果盆地和西非兩個分支。其中,剛果盆地分支感染致死率顯著高于西非分支,可達(dá)到10%,且可以在人間傳播,而西非分支感染癥狀相對溫和,且少見人間傳播的報道。 針對這一特性,研究人員在構(gòu)建動物模型的過程中,經(jīng)常會對兩個分支的致病力進(jìn)行比較研究,以期揭示導(dǎo)致癥狀差異的發(fā)病機(jī)制區(qū)別。 Saijo 等[42]使用食蟹猴模型比較了兩個猴痘病毒分支的致病力,發(fā)現(xiàn)剛果盆地分支在感染動物的皮膚、淋巴結(jié)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、生殖泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和消化系統(tǒng)中廣泛復(fù)制,而西非分支僅在皮膚、淋巴結(jié)和網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)中復(fù)制,表明剛果盆地分支在內(nèi)臟器官中的復(fù)制效率遠(yuǎn)高于西非分支,且剛果盆地分支感染猴的肺受到嚴(yán)重影響,胃腸和生殖泌尿器官功能障礙,提示剛果盆地分支的食蟹猴毒力高于西非分支。

Huston 等[43]基于土撥鼠模型,比較了西非分支和剛果盆地分支的致病力,作者分別采用滴鼻和皮內(nèi)注射兩種途徑,對動物分別接種西非分支和剛果盆地分支病毒,兩種病毒感染后大體癥狀一致,但剛果盆地分支感染動物發(fā)熱的比例較高、體重下降幅度較大、致死率高[24]。 在此基礎(chǔ)上,作者進(jìn)一步采用不同劑量病毒滴鼻接種土撥鼠,深入比較了兩種分支病毒的致病力,發(fā)現(xiàn)剛果盆地分支的LD50比西非分支低近百倍。 與西非分支相比,剛果盆地分支感染動物口腔病毒滴度更高,排毒時間更長。 后續(xù),作者基于土撥鼠模型深入比較了兩個分支毒株感染動物的病毒學(xué)和病理學(xué)差異,發(fā)現(xiàn)可從剛果盆地分支感染動物的粘膜、口咽部淋巴結(jié)和脾中相對較早的分離到病毒,兩個分支感染動物組織病理學(xué)差異不明顯,但剛果盆地分支感染動物的脾內(nèi)發(fā)生更多的細(xì)胞凋亡[44]。 這些研究表明,剛果盆地分支的體內(nèi)復(fù)制效率高于西非分支,但毒力差異的病理學(xué)機(jī)制還有待深入研究。

3.3 病毒傳播研究

2003 年猴痘病毒自非洲傳播至美國,其途徑首先是非洲嚙齒類動物將病毒傳播至美國的土撥鼠,土撥鼠再將病毒傳播至人,從而爆發(fā)猴痘疫情[18]。不同于其它動物,土撥鼠是常見的寵物,分布在家庭、寵物店和公園等環(huán)境中,猴痘病毒在土撥鼠間的傳播風(fēng)險值得關(guān)注。 因此,Huston 等[45]使用土撥鼠模型,對土撥鼠滴鼻接種猴痘病毒后,采用3 種策略評估了傳播風(fēng)險。 第一種策略為間接接觸,將未感染動物置于感染動物生活過的籠具和墊料中;第二種策略為密切接觸,將未感染動物與感染動物合籠飼養(yǎng);第三種策略為呼吸道傳播,未感染動物與感染動物飼養(yǎng)在1 英寸間隔且?guī)в型L(fēng)孔的生物安全柜內(nèi),氣流單向從感染動物向未感染動物流動,允許呼吸道飛沫傳播或空氣傳播。 間接接觸組的3只未感染動物暴露后均被感染,可從口腔內(nèi)檢測到病毒DNA,后續(xù)在血液中檢測到病毒DNA,動物感染后體重下降,出現(xiàn)腹瀉和口腔病變;直接接觸組的3 只未感染動物暴露后均被感染,可從口腔內(nèi)檢測到病毒DNA,動物腹瀉和口腔病變較為嚴(yán)重。 呼吸道傳播組的未感染動物出現(xiàn)眼部感染,可在眼部和口腔分離到病毒,腹部和腿部出現(xiàn)病變,體重下降。 暴露后瀕死動物的舌部、脾、皮膚和病變部位都分離到了活病毒,且肝功指標(biāo)顯著提高,提示出現(xiàn)了嚴(yán)重的肝疾病。

3.4 疫苗保護(hù)效果評價

天花病毒、猴痘病毒和牛痘病毒均屬于痘病毒科的正痘病毒屬,研究認(rèn)為天花疫苗可對猴痘病毒感染提供保護(hù)[6]。 1977 年以后未發(fā)生過天花病毒自然感染病例,1980 年WHO 宣布在全球范圍內(nèi)成功消滅了天花,隨后,停止了廣泛的天花疫苗接種,此后出生的人群(兒童和青年)缺乏對天花病毒和猴痘病毒的免疫力[6]。 Schultz 等[35]用非洲睡鼠模型研究了天花疫苗對猴痘病毒感染的保護(hù)效果,發(fā)現(xiàn)對動物接種一次疫苗,4 周后再進(jìn)行猴痘病毒感染時存活率為100%,而安慰劑對照組動物死亡率為100%。 傳統(tǒng)的天花疫苗和第二代疫苗接種依賴于病毒的復(fù)制,此類疫苗雖然效果較好,但存在一定的副反應(yīng)。 第三代疫苗是復(fù)制缺陷型的減毒疫苗,但由于天花已經(jīng)被消滅,無法通過III 期臨床試驗來證實其有效性,Hatch 等[46]用食蟹猴模型評價了第三代天花疫苗對猴痘病毒感染的有效性,從而評估其對天花病毒的有效性,實驗證實單次接種第三代疫苗不能完全避免嚴(yán)重/致死性的感染,而加強(qiáng)接種則可有效保護(hù)動物。