新型冠狀病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型的評(píng)價(jià)指標(biāo)

唐 定張瑞安盧 佳李新國(guó)

(武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室,武漢 430207)

一種被命名為SARS-CoV-2 的新型冠狀病毒爆發(fā),導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)疾病,病死率約為2.2%[1]。 我國(guó)將SARS-CoV-2 按照第二類病原微生物進(jìn)行管理,涉及病毒培養(yǎng)和動(dòng)物感染實(shí)驗(yàn)則必須在生物安全三級(jí)或以上級(jí)別實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行[2-3]。 盡管人類患者的數(shù)量非常的龐大,但SARS-CoV-2 某些方面的發(fā)病機(jī)制和疫苗的前期評(píng)估只能在動(dòng)物感染模型中才能夠?qū)崿F(xiàn)反復(fù)采樣和病理解剖。 因?yàn)榉侨遂`長(zhǎng)類動(dòng)物(non-human primates,NHP)在親緣關(guān)系上與人類非常接近,并且生理結(jié)構(gòu)和解剖病理結(jié)構(gòu)等都與人類十分類似,所以疫苗或藥物一般會(huì)選擇NHP 進(jìn)行臨床前研究[4-5]。 在非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物新冠病毒感染模型研究中發(fā)現(xiàn),SARS-CoV-2 能夠?qū)е潞愫雍锏暮粑到y(tǒng)疾病,但NHP 感染新冠病毒后大多表現(xiàn)為輕度到中度的臨床癥狀,并且在感染后1 周左右開始恢復(fù)[6]。 因此,單一的評(píng)價(jià)指標(biāo)難以準(zhǔn)確判斷實(shí)驗(yàn)猴的感染階段和感染模型的建立是否成功,正確選擇能觀察或檢測(cè)表現(xiàn)疾病關(guān)鍵特征性的指標(biāo)不僅能夠節(jié)省人力、物力和時(shí)間,也更能保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的有效性。 新冠病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型關(guān)鍵特征性評(píng)價(jià)指標(biāo)包括臨床表現(xiàn)指標(biāo)、影像學(xué)診斷、血液學(xué)指標(biāo)、病原學(xué)指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)等,結(jié)合這些指標(biāo)綜合判斷動(dòng)物感染模型的建立是否成功對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析至關(guān)重要[7-8]。

1 臨床表現(xiàn)指標(biāo)

臨床評(píng)分是對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的一些主要癥狀、體征和生理參數(shù)等進(jìn)行加權(quán)或賦值,從而量化評(píng)價(jià)疾病的嚴(yán)重程度,預(yù)測(cè)后續(xù)發(fā)展,也能控制研究時(shí)的組間可比性[9]。 實(shí)驗(yàn)表明,非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物在感染新冠病毒后會(huì)產(chǎn)生與人類患者相似的臨床癥狀,主要表現(xiàn)為呼吸模式的變化、弓背姿勢(shì)、體表蒼白、脫水、食欲下降、偶爾咳嗽和體溫變化等[6]。 對(duì)NHP感染新冠病毒后的臨床癥狀進(jìn)行賦值,建立臨床評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)實(shí)驗(yàn)猴進(jìn)行臨床評(píng)分,其結(jié)果可以有效評(píng)估實(shí)驗(yàn)猴的感染階段,有助于判斷實(shí)驗(yàn)進(jìn)程和實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)(見表1)[6]。

2 影像學(xué)診斷

計(jì)算機(jī)斷層掃描(CT)和X 射線檢查是影像學(xué)檢查中非常重要的檢查方法。 在新冠病毒感染早期,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)方法很容易出現(xiàn)假陰性[10],因此,識(shí)別該病的早期影像表現(xiàn)及臨床特征在新冠肺炎診斷方面具有重要意義。 臨床診斷結(jié)果也證明使用CT 或胸部X 射線檢查能對(duì)新冠病毒患者進(jìn)行有效診斷,其中CT 通常會(huì)產(chǎn)生更準(zhǔn)確的結(jié)果。 人類患者的影像特征包括單發(fā)或散在磨玻璃密度陰影,病變部位主要分布在胸膜下緣或肺中央,伴隨征象包括胸腔積液、縱隔及肺門區(qū)淋巴結(jié)增大等[11]。 通過(guò)制定新冠病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型的肺部CT 評(píng)分方法,能夠半定量分析肺內(nèi)病變程度,評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)為:無(wú)異常密度影,0分;存在少量異常密度影,累及面積＜5%,1 分;累及面積＜25%,2 分;累及面積＜50%,3 分;累及面積＜75%,4 分;累及面積＞75%,5 分[12]。 根據(jù)CT 評(píng)分結(jié)果能夠客觀的評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)猴的感染階段,及時(shí)調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案,取得更加理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 血液學(xué)指標(biāo)

3.1 血常規(guī)檢驗(yàn)

血常規(guī)是臨床檢測(cè)中應(yīng)用最普遍的檢測(cè)項(xiàng)目,其中外周白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比率(NLR)、衍生 NLR 比率(d-NLR,中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)除以白細(xì)胞計(jì)數(shù)減去中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)的結(jié)果)、血小板與淋巴細(xì)胞比率(PLR)和淋巴細(xì)胞與單核細(xì)胞比率(LMR)是炎癥反應(yīng)的指標(biāo)[13]。 對(duì)動(dòng)物感染模型臨床檢查中收集的血液進(jìn)行血常規(guī)分析顯示,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)猴的單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)都在感染后短暫上升,然后恢復(fù)到基線水平;淋巴細(xì)胞則短暫下降再恢復(fù);所有動(dòng)物都觀察到紅血細(xì)胞壓積、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)和血紅蛋白下降,網(wǎng)織紅細(xì)胞的百分比和計(jì)數(shù)也有所下降[6]。 淋巴細(xì)胞數(shù)量的下降與COVID-19 感染的嚴(yán)重程度成正比,并且該疾病的存活率與淋巴細(xì)胞尤其是T 淋巴細(xì)胞的更新能力有關(guān),這對(duì)摧毀受感染的細(xì)胞至關(guān)重要[14]。 近年來(lái),有研究表明平均血小板體積(MPV)可能是預(yù)測(cè)肺炎患者病情發(fā)展及預(yù)后的一個(gè)指標(biāo)[15]。 研究發(fā)現(xiàn)NLR 也可用作評(píng)估COVID-19 患者的預(yù)后情況和臨床癥狀的嚴(yán)重程度,NLR 與COVID-19 的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[12]。

3.2 血液生化檢測(cè)

通過(guò)對(duì)臨床病例分析發(fā)現(xiàn),部分新冠患者的肝功能指標(biāo)出現(xiàn)異常,主要表現(xiàn)為谷草轉(zhuǎn)氨酶升高,谷丙轉(zhuǎn)氨酶升高,谷草轉(zhuǎn)氨酶和谷丙轉(zhuǎn)氨酶比例異常,乳酸脫氫酶升高;但這不是普遍現(xiàn)象,與感染的毒株和患者年齡有較大關(guān)系[16]。 血尿素氮和血清肌酐都是腎損傷的常規(guī)指標(biāo),現(xiàn)有數(shù)據(jù)表明,新冠患者中急性腎損傷(AKI)的患病率相對(duì)較低,各項(xiàng)研究結(jié)果顯示在0.5%～19.1%之間[17]。 但是,在新冠病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型中,生化指標(biāo)的變化較小,腎功能和肝功能的標(biāo)志物基本保持不變[18]。

4 病原學(xué)指標(biāo)

Real-time PCR 是世界衛(wèi)生組織(WHO)、中國(guó)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)等單位推薦的新冠肺炎確診的標(biāo)準(zhǔn)之一,能夠高效處理較大數(shù)量樣本[19]。 在恒河猴的新冠感染模型中,鼻拭子、咽拭子和支氣管肺泡灌洗液中的病毒載量都很高,并且能夠從感染早期的鼻拭子、咽拭子和肺泡灌洗液中分離出新冠病毒,也能從肺組織勻漿上清中分離出新冠病毒[6];在呼吸系統(tǒng)及其附近的淋巴結(jié)中不僅檢測(cè)到了高病毒載量,還檢測(cè)到了新冠病毒的mRNA,這表明新冠病毒在呼吸系統(tǒng)中有較高的復(fù)制活性[20-21]。通過(guò)新冠病毒的核酸檢測(cè),可以有效指示新冠病毒能夠侵入的組織器官以及在其中的病毒載量,這對(duì)疫苗的免疫保護(hù)力評(píng)價(jià)、病毒感染模型的構(gòu)建和其它相關(guān)生物或化學(xué)制劑的作用研究都至關(guān)重要。

5 病理學(xué)指標(biāo)

常用的病理學(xué)技術(shù)有蘇木精-伊紅(HE)染色和免疫組化技術(shù),HE 染色可以觀察細(xì)胞結(jié)構(gòu)、組織層次,對(duì)組織器官的病理學(xué)診斷非常重要;免疫組化染色技術(shù)能對(duì)新冠病毒抗原進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究[22-23]。 迄今為止描述的COVID-19 肺組織病理學(xué)表現(xiàn)在很大程度上是非特異性的,包括水腫、蛋白質(zhì)滲出物、伴有透明膜形成的彌漫性肺泡損傷 (DAD)、反應(yīng)性肺細(xì)胞增生、以淋巴細(xì)胞為主的間質(zhì)單核炎性浸潤(rùn)和多核巨細(xì)胞,通常沒(méi)有出現(xiàn)病毒致細(xì)胞病變的變化或特性核內(nèi)或胞漿內(nèi)病毒包涵體[24-30]。 然而, 血管血栓形成似乎在COVID-19 患者的肺中更為常見[31]。 研究發(fā)現(xiàn),非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物新冠病毒感染模型中的病理學(xué)變化主要表現(xiàn)為以淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn),形成間質(zhì)性肺炎;同時(shí)在多個(gè)組織器官中檢測(cè)到新冠病毒抗原,包括整個(gè)呼吸道、扁桃體、縱膈淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、頸部淋巴結(jié)、胃腸道,在部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的心臟中也檢測(cè)到了新冠病毒抗原[6,20]。

6 免疫學(xué)指標(biāo)

6.1 細(xì)胞免疫

細(xì)胞因子風(fēng)暴被認(rèn)為是急性呼吸窘迫綜合征和多器官衰竭的主要原因之一,它在疾病加重過(guò)程中起著重要的作用。 臨床研究已經(jīng)證實(shí)COVID-19的危重癥患者體內(nèi)存在細(xì)胞因子風(fēng)暴[32]。 研究發(fā)現(xiàn),與非重癥患者相比,重癥監(jiān)護(hù)病房患者血漿中IL-2、IL-7、IL-10、GCSF、IP-10、MCP-1、MIP-1a 和TNF-α 的水平更高,提示重癥患者體內(nèi)可能存在細(xì)胞因子風(fēng)暴[33-34]。 盡管呼吸道中的病毒滴度相似,但感染SARS-CoV-2 的老年非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物比受感染的年輕非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物更容易出現(xiàn)免疫失調(diào),導(dǎo)致更嚴(yán)重的臨床癥狀,可能是過(guò)度的炎癥反應(yīng)而不是高病毒滴度導(dǎo)致老年非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的死亡[35-38]。 以上研究結(jié)果表明,細(xì)胞因子風(fēng)暴與疾病嚴(yán)重程度呈正相關(guān),因此在新冠病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型建立過(guò)程中監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)猴的細(xì)胞因子水平有助于判斷感染情況和疾病發(fā)展階段。

6.2 體液免疫

大多數(shù)COVID-19 患者在出現(xiàn)癥狀后1～2 周內(nèi)可檢測(cè)到抗體反應(yīng)[39]。 具體而言,在出現(xiàn)臨床癥狀的第2 天能夠檢測(cè)到IgA 抗體,在臨床癥狀出現(xiàn)后的第5 天能夠檢測(cè)到IgM 和IgG 抗體[40-43]。 最近的研究表明,中和抗體水平與COVID-19 患者的嚴(yán)重程度密切相關(guān),并且抗體反應(yīng)在感染后數(shù)周內(nèi)消退[44]。 此外,與有癥狀的個(gè)體相比,無(wú)癥狀個(gè)體的中和抗體水平下降得更快,并且水平較低[45]。 在新冠病毒恒河猴感染模型中,血清中IgG 抗體水平在感染后第7 天快速上升,在感染后第14 天達(dá)到峰值;中和抗體水平在感染后第10 天開始迅速上升,在感染后第15 天左右達(dá)到峰值[6]。 監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物血清中抗體水平的變化有助于判斷其感染階段和評(píng)估疫苗的免疫保護(hù)力。

6.3 固有免疫

固有免疫,即非特異性免疫,包括皮膚、粘膜、血腦屏障、固有免疫細(xì)胞等。 作為基礎(chǔ)保護(hù)屏障,雖然不存在病原特異性,但穩(wěn)定性強(qiáng),同時(shí)涉及到的免疫細(xì)胞種類繁多,因此同樣具有重要的檢測(cè)意義。 采集黏膜拭子是對(duì)固有免疫系統(tǒng)指標(biāo)監(jiān)測(cè)的最常見途徑,同時(shí)對(duì)相關(guān)免疫細(xì)胞,如單核-巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等的變化趨勢(shì)檢測(cè)也尤為重要。 研究發(fā)現(xiàn)SARS-CoV-2 能夠侵入大腦并感染腦血管內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致動(dòng)物模型中的腦損傷,但是病毒如何進(jìn)入大腦的機(jī)制尚未可知[46]。

7 總結(jié)

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)大多數(shù)人類致病性病毒都具有易感性,可以很好地模擬人類感染病毒后的臨床癥狀和病理變化等,非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型對(duì)研究疾病的發(fā)病機(jī)制,疫苗、藥物的評(píng)價(jià)都發(fā)揮著非常重要的作用。 但是非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物繁殖周期長(zhǎng),資源比較稀缺,并且成本高昂,所以選擇合適的評(píng)價(jià)指標(biāo)以正確評(píng)估動(dòng)物模型是否成功建立,從而獲得準(zhǔn)確、有效的實(shí)驗(yàn)結(jié)果才能減少不必要的重復(fù)實(shí)驗(yàn)。 臨床表現(xiàn)指標(biāo)、影像學(xué)診斷、血液學(xué)指標(biāo)、病原學(xué)指標(biāo)、病理學(xué)指標(biāo)、免疫學(xué)指標(biāo)對(duì)評(píng)價(jià)新冠病毒非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物感染模型的建立具有重要作用。