利用重組自交系群體定位水稻莖粗QTL

朱小平，李傳旭，寧衛(wèi)東，張建國，曾靜，毛毳，李永洪，林擁軍

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/作物遺傳改良全國重點實驗室，武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，德陽 618000

抗倒伏和高產(chǎn)一直是水稻育種的重要方向，水稻的株型與水稻的抗倒伏能力、產(chǎn)量密切相關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者針對不同的生態(tài)地區(qū)和秈粳亞種提出了多種水稻的理想株型模型，粗壯稈是其中重要的指標(biāo)[1]，粗稈水稻品種能夠積累更多的生物量和提供更強的大穗和大粒性狀，在保證高產(chǎn)的同時具有良好的抗倒伏能力[2]。水稻的倒二節(jié)和倒三節(jié)莖粗對于水稻抗彎曲型倒伏具有重大影響，尤其是大穗、長穗的水稻品種。比如Kashiwagi等[3]指出Koshihikari品種，由于其稻穗大而重，上部莖稈較細(xì)，植株較高，在種子成熟后受到雨水和風(fēng)力的影響，容易導(dǎo)致彎曲型倒伏[3]。因此，挖掘水稻倒二節(jié)、倒三節(jié)莖粗QTL，對于增加水稻上部節(jié)間的莖粗從而抵抗環(huán)境應(yīng)力與稻穗的壓力具有重要意義。

已有研究發(fā)現(xiàn)，水稻的莖粗性狀為多基因控制的數(shù)量性狀，不同節(jié)間的莖粗性狀可能由相同的QTL控制，具有一因多效性[4-6]。聚合不同的莖粗QTL，相比于單個QTL位點具有更大的效應(yīng)，并能夠?qū)λ镜亩鄠€性狀進行改良[7-9]。目前已經(jīng)報道了多個水稻莖粗相關(guān)QTL，在12條染色體上均有分布。并對部分QTL進行了精細(xì)定位，比如常思源[10]利用回交導(dǎo)入系鑒定得到1個莖粗主效位點qSc8-1并將其精細(xì)定位到50 kb范圍內(nèi)。目前通過圖位克隆的方法已克隆到部分控制莖粗的基因，其中控制壯稈位點SCM2[11]、SCM3[12]和穗頸節(jié)直徑位點PND1[13]的基因分別為已報道的穗發(fā)育相關(guān)基因APO1、分蘗調(diào)控基因FC1、每穗實粒數(shù)基因Gn1a，表明水稻的莖粗相關(guān)QTL也影響水稻的產(chǎn)量。由于前人大多采用較低密度的分子標(biāo)記構(gòu)建遺傳圖譜，已報道的部分莖粗QTL定位的區(qū)間較大，后續(xù)進行QTL的效應(yīng)驗證和精細(xì)定位耗時長[7-9]。因此，利用高密度的遺傳圖譜對莖粗性狀進行QTL作圖，相比于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記具有更高的精度，QTL區(qū)間較小，有利于縮短QTL精細(xì)定位的時間。

本研究利用已構(gòu)建完成的崗46B/A232的高世代重組自交系和高密度的遺傳連鎖圖譜，考察2019年和2020年海南與武漢兩地群體的莖粗表型，采用R/qtl軟件分析水稻的倒二節(jié)莖粗（diameter of reciprocal second internode，RSID）和倒3節(jié)莖粗（diameter of reciprocal third internode，RTID）性狀，以期獲得在不同環(huán)境下重復(fù)檢測到的莖粗QTL，為水稻莖粗相關(guān)基因的精細(xì)定位、克隆以及利用提供遺傳資源與材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

三系保持系崗46B為粗稈秈稻品種，A232為細(xì)稈秈稻品種。本研究所使用的崗46B/A232重組自交系群體共包括265個株系，是以G46B為母本、A232為父本，雜交得到F1代，再通過連續(xù)自交，并采用單粒傳法構(gòu)建形成的。本研究以雙親和F13代的RIL群體作為試驗材料，F(xiàn)9代之前由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院李永洪老師團隊構(gòu)建[13]。

1.2 田間種植與性狀考察

RIL群體夏季種植于武漢華中農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗田，冬季種植于海南陵水華中農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁基地試驗田。田間按每個株系種4行，每行5株，行株距28 cm×18 cm進行種植，田間管理同當(dāng)?shù)卮筇锕芾?。水稻成熟期剝?nèi)デo稈外的葉鞘，用游標(biāo)卡尺測量莖稈倒二節(jié)和倒三節(jié)節(jié)間的上、中、下3個部位的直徑，以其平均值作為該節(jié)的莖粗表型值；取中間6個單株的主分蘗作為6個重復(fù)，以6個重復(fù)的平均值作為莖粗的表型值。

1.3 數(shù)據(jù)分析與QTL定位

利用Excel對表型數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計、整理；利用GraphPad Prism 9.0進行數(shù)據(jù)的分析與圖形的繪制；利用 MapGene2Chrom web v2.1（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.1/）繪制QTL的染色體物理位置示意圖。

本研究利用的遺傳圖譜為筆者所在課題組已構(gòu)建完成的Bin map圖譜，該圖譜是以秈稻R498作為參考基因組序列（http：//www.mbkbase.org/rice），基于群體重測序得到的232 600個SNP位點開發(fā)得到3 327個Bin標(biāo)記，利用高密度的Bin標(biāo)記構(gòu)建遺傳連鎖圖譜，總圖距為2 136.78 cM，每個Bin標(biāo)記的平均圖距為0.64 cM。采用復(fù)合區(qū)間作圖法（CIM），基于Bin-map的遺傳圖譜，利用R/qtl包對群體的莖粗性狀進行QTL分析，以LOD峰值處的Bin標(biāo)記來評估QTL的效應(yīng)，以2.5-LOD作為QTL的置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體的莖粗表型

A232的莖稈相較于崗46B更細(xì)、更長（圖1），兩親本的倒二節(jié)與倒三節(jié)莖粗的表型值在海南和武漢兩地均存在極顯著的差異（表1）。2019年海南RIL群體的倒二節(jié)莖粗范圍為3.01～6.06 mm，平均值為（4.33±0.55）mm；倒三節(jié)莖粗范圍為 3.07～6.09 mm，平均值為（4.37±0.55）mm。2019年武漢RIL群體的倒二節(jié)莖粗范圍為3.36～7.22 mm，平均值為（4.82±0.71）mm；倒三節(jié)莖粗范圍為 4.08～8.07 mm，平均值為（5.94±0.78）mm。2020年武漢RIL群體的倒二節(jié)莖粗范圍為3.32～7.78 mm，平均值為（5.47±0.69）mm；倒三節(jié)莖粗范圍為 4.68～8.60 mm，平均值為（6.72±0.69）mm。表型統(tǒng)計結(jié)果（表1）顯示倒二節(jié)、倒三節(jié)的莖粗性狀均呈現(xiàn)出雙向超親分離現(xiàn)象，偏度和峰度的絕對值均小于1，基本符合正態(tài)分布的特征。且分離群體在海南的莖粗平均值小于在武漢的莖粗平均值，表現(xiàn)為偏度值更大，說明水稻的莖粗性狀受到環(huán)境的影響。

圖1 親本的莖稈特征Fig，1 Stem characteristics of two parental lines

表1 雙親及RIL群體的莖粗性狀表型統(tǒng)計Table 1 Statistics of phenotypic variations for internode diameter in parents and RIL populations

RIL群體的莖粗性狀頻數(shù)分布呈連續(xù)的正態(tài)分布趨勢，表明這2個性狀是由多基因控制的數(shù)量性狀，群體適用于QTL作圖（圖2）。對倒二節(jié)和倒三節(jié)莖粗進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)兩者間呈極顯著正相關(guān)，在2019年海南、武漢和2020年武漢的相關(guān)系數(shù)分別為0.708、0.926和0.844，表明水稻不同節(jié)間的莖粗可能受到相同的途徑調(diào)控。

圖2 RIL群體的倒二節(jié)莖粗（A）和倒三節(jié)莖粗（B）頻數(shù)分布Fig.2 Frequent distribution of diameter of reciprocal second internode（A）and diameter of reciprocal third internode（B）in RIL populations

2.2 莖粗QTL定位分析

利用R/qtl包對2019年、2020年海南和武漢兩地RIL群體的莖粗性狀進行QTL定位分析，共檢測到10個莖粗相關(guān)QTLs，分布在第2、3、4、11號染色體上，包括3個倒二節(jié)莖粗QTL、7個倒三節(jié)莖粗QTL（表2）。除了qRTID11-1以外，其余的QTL位點加性效應(yīng)均為正，說明群體莖粗的增效等位QTL位點主要來源于粗稈親本崗46B。2019年海南檢測到1個倒二節(jié)莖粗QTL（qRSID2-1），LOD值為6.08，表型貢獻率為8.26%；檢測到2個倒三節(jié)莖粗QTL（qRTID2-1，qRTID7-1），LOD值為9.70和2.96，表型貢獻率為12.36%和1.27%。2019年武漢檢測到1個倒二節(jié)莖粗QTL（qRSID2-2），LOD值為4.60，表型貢獻率為7.89%；檢測到2個倒三節(jié)莖粗QTL（qRTID2-2，qRTID4-1），LOD值為5.66和3.52，表型貢獻率為8.00%和4.09%。2020年武漢檢測到2個倒二節(jié)莖粗 QTL（qRSID2-1，qRSID3-1），LOD值分別為3.95和3.01，表型貢獻率為9.09%和4.71%；檢測到3個倒三節(jié)莖粗QTL（qRTID2-3，qRTID4-2，qRTID11-1），LOD值分別為 4.52、3.34和3.02，表型貢獻率為8.11%、5.03%和1.67%。

將3次的QTL數(shù)據(jù)進行匯總，并繪制QTL在染色體上的物理位置示意圖（圖3）。發(fā)現(xiàn)2號染色體上的莖粗QTL最多，部分QTL的物理距離相近，并在3次試驗中被重復(fù)檢測到，表型貢獻率為7.89%～12.36%。其中qRTID2-1為一個主效的莖粗QTL；qRSID2-1在2019年海南和2020年武漢均被檢測到，且表型貢獻率均超過8%；2019年武漢檢測到的qRSID2-2與qRTID2-1為同一個QTL；qRSID2-1和qRTID2-1的物理位置相距80 kb，qRSID2-2/qRTID2-2和qRTID2-3的物理距離為120 kb。

表2 RIL群體中莖粗QTLs的定位Table 2 QTLs for internode diameter in RIL populations

圖3 莖粗QTL在染色體上的物理位置示意圖Fig.3 Schematic diagram of the physical location of QTL to internode diameter on chromosomes

3 討論

本研究利用莖粗性狀具有極顯著差異的A232和崗46B作為親本構(gòu)建的F13代RIL群體，以及基于重測序構(gòu)建的高密度遺傳連鎖圖譜，對海南和武漢兩地RIL群體的莖粗性狀進行QTL定位分析，得到了多個莖粗性狀的QTL。其中在2號染色體上的QTL距離較近，并被重復(fù)檢測到，表型貢獻率在8.26%～12.36%，說明2號染色體上的莖粗QTL重復(fù)性較好，可靠性高。多個相距較近的QTL位點可能是同一個QTL，并控制水稻不同節(jié)間的莖粗性狀，這與前人的研究[15]相符。其中多個QTL位點在前人的研究中已被報道，如qRSID2-2/qRTID2-2和qRTID2-3位于薄娜娜等[16]定位到的穗頸圍位點qRC-2-2的區(qū)間內(nèi)，并且與鞠曉晨等[15]定位到的基部第二伸長節(jié)間莖粗位點qSCM2和基部節(jié)間莖粗位點qBCM2距離相近。qRSID2-1和qRTID2-1位于穆平等[9]在水田和旱田環(huán)境下聯(lián)合分析檢測到的基部節(jié)間莖粗位點bct2c的區(qū)間內(nèi)，并與楊窯龍等[7]檢測到的節(jié)間長和株高位點qLS-2、qPH-2相近。在除2號染色體以外的其他染色體上也檢測到了一些莖粗QTL，但未被重復(fù)檢測到，且表型貢獻率較低。部分QTL的區(qū)間較大，可能是因為這些QTL是微效的莖粗QTL，導(dǎo)致QTL的效應(yīng)容易受到環(huán)境和表型鑒定的影響，因此難以被重復(fù)檢測到。但這些位點大部分也與前人的莖粗相關(guān)性狀的位點重合，包括qSDM3.1[17]、bct4[9]、qCS-4[16]、bct7[9]、qSC-7-1[16]、qRC-7-1[16]、bct11c[9]等，需要進一步重復(fù)驗證。

RIL群體的莖粗性狀受到環(huán)境的影響，表現(xiàn)為在武漢相比于海南具有更粗的莖稈，這可能與兩地不同的日照條件相關(guān)。但在兩地檢測到的莖粗QTL重復(fù)性較好，均檢測到了倒二節(jié)莖粗位點qRTID2-1，說明該位點受環(huán)境的影響較小，可利用該位點在不同環(huán)境下改良水稻的莖粗性狀。

目前在2號染色體上未有水稻莖粗相關(guān)基因被克隆。在qRSID2-2/qRTID2-2下游100 kb存在1個脆稈基因BC3，bc3突變體表現(xiàn)為矮稈、脆稈，該基因編碼1個動力相關(guān)蛋白OsDRP2B，通過參與胞吞作用和高爾基體的跨膜運輸，參與纖維素的合成，介導(dǎo)細(xì)胞次生細(xì)胞壁的形成，從而影響莖稈的機械強度[18]。在qRTID2-1區(qū)間內(nèi)存在1個基因AFD1，其afd1突變體表現(xiàn)為矮稈[19]，該基因調(diào)控水稻穗和內(nèi)外稃的發(fā)育。推測這2個基因可能與水稻的莖粗性狀相關(guān)，可作為莖粗的候選基因，后續(xù)需要分析兩親本的候選基因變異情況并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進行功能驗證和遺傳效應(yīng)分析。