寧夏地區(qū)犢牛腹瀉型產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌的篩選及相關(guān)基因型分析

高海慧，汪 潔，扈寧霞，王培柱，吳學(xué)青，康曉冬*

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，寧夏銀川 750002；2.陜西榆林市綏德縣名州區(qū)農(nóng)牧業(yè)綜合服務(wù)站，陜西綏德 718000；3.寧夏吳忠市利通區(qū)扁擔(dān)溝鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)工作站，寧夏吳忠 751100)

犢牛大腸埃希氏菌性腹瀉是危害犢牛生長(zhǎng)的重要疾病，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡。在規(guī)?；膛?chǎng)和肉牛場(chǎng)，抗菌藥物是治療該病的首選藥物，寧夏地區(qū)牛只對(duì)阿米卡星敏感性最高[1]。由于長(zhǎng)期用各種抗菌藥物治療，加之濫用嚴(yán)重，形成了大腸埃希氏菌耐藥性日趨嚴(yán)重的狀況。β-內(nèi)酰胺酶是一種細(xì)菌產(chǎn)生的能水解β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物的滅活酶，是細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥性的主要機(jī)制。超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)主要存在于臨床分離的革蘭氏陰性桿菌，大腸埃希氏菌是產(chǎn)β-內(nèi)酰胺的代表菌株，耐藥基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)和接合等形式在細(xì)菌中傳播擴(kuò)散[2]。β-內(nèi)酰胺類抗生素是使用廣泛的治療藥物，導(dǎo)致大量β-內(nèi)酰胺失活和β-內(nèi)酰胺酶出現(xiàn)[3]。國(guó)際上研究認(rèn)為，ESBLs和頭孢菌素酶(Amp C)是較為活躍的2類β-內(nèi)酰胺酶，尤其是在腸桿菌科細(xì)菌中起到較為重要的作用[4]。不同國(guó)家或地區(qū)獸醫(yī)用藥習(xí)慣、劑量不同，使得不同地區(qū)菌株的基因型和基因亞型存在差異，其所攜帶的某些耐藥基因可能會(huì)通過(guò)水平轉(zhuǎn)移的方式轉(zhuǎn)移到人類，給臨床治療帶來(lái)壓力。ESBLs相關(guān)基因中主要流行的是TEM型，CTX-M型[3,5]。奶牛和肉牛是我區(qū)畜牧業(yè)重要的支柱產(chǎn)業(yè)，肉牛又是南部山區(qū)脫貧攻堅(jiān)的主力軍，本研究開(kāi)展寧夏地區(qū)犢牛腹瀉型產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌篩選、耐藥性調(diào)查與優(yōu)勢(shì)基因型分析，為犢牛腹瀉型產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌在寧夏地區(qū)的感染和流行情況提供資料，為明確大腸埃希氏菌ESBLs耐藥基因的傳播趨勢(shì)，有效監(jiān)控細(xì)菌耐藥性，指導(dǎo)犢牛大腸桿菌病用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所動(dòng)物疫病防治實(shí)驗(yàn)室于2019年10月-2021年9月采集寧夏地區(qū)規(guī)?；?chǎng)犢牛腹瀉型肛門拭子180份，離心管收集，冰袋運(yùn)輸。

1.1.2 試劑與材料 伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基EMB(批號(hào):161119)、麥康凱培養(yǎng)基MAC(批號(hào):161119)、MH 瓊脂(批號(hào):161021)，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；4.5 mg/mL NaCl溶液，法國(guó)梅里埃公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000、DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200、2×TaqPCR MasterMix，天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品；blaTEM、blaCTX-M-1、blaCTX-M-9、blaCTX-M、blaOXA、blaSHV基因擴(kuò)增引物，生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成；ESBLs測(cè)定盒(頭孢他定(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢他定/克拉維酸(CAZ/clav))、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/clav),杭州天和微生物試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 大腸埃希氏菌的分離 將肛拭子于營(yíng)養(yǎng)肉湯中37 ℃培養(yǎng)16 h～24 h，培養(yǎng)物接種于EMB、MAC，培養(yǎng)16 h～24 h，疑似菌鏡檢純化，用于菌株的鑒定。

1.2.2 疑似菌的16S rRNA鑒定 將純培養(yǎng)的大腸埃希氏菌，用滅菌生理鹽水洗脫，吸取1.5 mL，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取DNA，分裝后，置-20 ℃保存?zhèn)溆?。參?6S rRNA通用引物序列[7]，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為2×TaqPCR Master Mix 25 μL，DNA模板2.0 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共循環(huán)30次；72 ℃ 10 min。陽(yáng)性樣品送公司測(cè)序，測(cè)得序列進(jìn)行Blast比對(duì)。

1.2.3 大腸埃希氏菌ESBLs篩選 復(fù)壯保存的大腸埃希氏菌后，用麥?zhǔn)媳葷醿x調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬臃N于MH平板上，均勻涂布，采用雙紙片協(xié)同法，將ESBLs測(cè)定盒中的CTX(30 μg)、CTX/CLA(30 μg/10 μg)，CAZ(30 μg)、CAZ/CAL(30 μg/10 μg)兩組，37 ℃過(guò)夜培養(yǎng)，比較加入克拉維酸與不加克拉維酸的抑菌直徑≥5 mm者判定為產(chǎn)ESBLs菌株。

1.2.4 ESBLs引物的合成 參考文獻(xiàn)[6-9]設(shè)計(jì)基因的特異性引物，由生工生物工程(上海)技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列見(jiàn)表1。

1.2.5 PCR檢測(cè)blaCTX、blaCTX-M-9基因的PCR條件為：40 μL體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 17 μL；blaCTX-M-1、blaTEM、blaOXA、blaSHV基因的PCR條件為40 μL體系：2×TaqPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，DNA模板0.5 μL，ddH2O 17.5 μL。PCR條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29個(gè)循環(huán)；72℃ 10min，退火溫度見(jiàn)表1。

表1 基因檢測(cè)引物序列及大小

2 結(jié)果

2.1 大腸埃希氏菌的16S rRNA鑒定

分離株在MAC上呈圓形、突起光滑、邊緣整齊的粉色菌落，在EMB上呈具有金屬光澤菌落，革蘭氏染色可見(jiàn)紅色、兩端鈍圓的桿菌。以疑似為E.coli的純培養(yǎng)物DNA為模板，擴(kuò)增分離株16 S rRNA基因，目的條帶為370 bp，與預(yù)期條帶一致(圖1)。產(chǎn)物送測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)確定為大腸埃希氏菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 500;1～5.分離菌株;6.陰性對(duì)照

2.2 ESBLs檢測(cè)結(jié)果

測(cè)量抑菌圈直徑分析顯示，腹瀉源性74株E.coli有51株為產(chǎn)ESBLs菌株，陽(yáng)性率為68.92%。

2.3 相關(guān)基因檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見(jiàn)表2和圖2～圖7。51株產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，bla-TEM基因陽(yáng)性率為100%(51/51)，bla-CTX基因陽(yáng)性率為100%(51/51)，其中bla-CTX-M-1基因亞型株62.75%(32/51)、bla-CTX-M-9基因亞型株100%(51/51)，bla-OXA基因陽(yáng)性率為50.98%(26/51),bla-SHV基因陽(yáng)性率為23.53%(12/51)。攜帶CTX+CTX-M-1+CTX-M-9+TEM基因的菌株占比最高，為21.57%。

表2 腹瀉源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因型分布

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1～9.分離菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1～14.分離菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1～10.分離菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1～10.分離菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 1 200;1～11.分離菌株

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn)DL 600;1～13.分離菌株

3 討論

大腸埃希氏菌腸道正常菌群，數(shù)量大，是維護(hù)腸道健康的重要菌群，這無(wú)疑加速了細(xì)菌耐藥基因的產(chǎn)生、累積和轉(zhuǎn)移[10]，隨著人醫(yī)和獸醫(yī)在治療臨床疾病中廣泛使用第三代頭孢菌素、單環(huán)β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物，使得ESBLs菌株出現(xiàn)耐藥及傳播，通過(guò)環(huán)境污染，食用畜產(chǎn)品等途徑威脅著人類健康。ESBLs主要由腸桿菌科產(chǎn)生，ESBLs使大腸埃希氏菌對(duì)新型廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥性增加，ESBLs陽(yáng)性株的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致臨床的高病死率及高比率持續(xù)性定殖，給臨床治療相關(guān)疾病帶來(lái)挑戰(zhàn)。

ESBLs基因型主要有blaTEM、blaSHV、blaCTX和blaOXA[11]，本研究中51株產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌中，優(yōu)勢(shì)基因型為bla-TEM、bla-CTX、bla-CTX-M-1、bla-CTX-M-9。bla-CTX型酶是近年來(lái)研究較多且流行較廣泛的，分為CTX-M-1、CTX-M-9和KLUC等6組，每組又存在亞型，總數(shù)有150多種[11]。本研究中發(fā)現(xiàn)blaCTX-M-1基因亞型陽(yáng)性率為62.75%，blaCTX-M-9基因亞型陽(yáng)性率為100%。blaTEM來(lái)源于TEM-1和TEM-2基因序列發(fā)生突變?cè)斐?個(gè)～5個(gè)氨基酸改變而形成的一系列酶，本研究中bla-TEM基因陽(yáng)性率為100%，TEM-1基因是目前革蘭氏陰性菌中流行范圍最廣、檢出率最高的TEM基因亞型。OXA型ESBLs國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道主要存在于銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌中[12]，而在腸桿菌科細(xì)菌中所占比例較少，本研究中blaOXA基因檢出率為50.98%，與報(bào)道有一定差異。SHV型是較早發(fā)現(xiàn)的酶型之一，且產(chǎn)SHV型ESBLs的菌株日益增多，對(duì)第三代頭孢菌素等呈現(xiàn)多重耐藥現(xiàn)象，給臨床抗感染治療帶來(lái)很大的困難，已引起世界各地高度重視[13]，本研究中bla-SHV基因陽(yáng)性率為23.53%，相對(duì)其他基因型檢出率最低。據(jù)有關(guān)報(bào)道，blaCTX型和TEM型或SHV型的同源性較低，僅為40%[14-15]。本研究中腹瀉源產(chǎn)ESBLs大腸埃希氏菌攜帶CTX+CTX-M-1+CTX-M-9+TEM基因型的菌株占比最高(21.57%)。

寧夏地區(qū)犢牛腹瀉型產(chǎn)ESBLs菌株檢出率高，提示我區(qū)牛場(chǎng)中產(chǎn)ESBLs菌株流行普遍。牛源ESBLs大腸埃希氏菌攜帶的某些耐藥基因，可能會(huì)通過(guò)復(fù)制、變異、水平轉(zhuǎn)移等方式傳遞到人類的致病菌中，有重要公共衛(wèi)生意義，應(yīng)定期開(kāi)展ESBLs監(jiān)測(cè)，平時(shí)生產(chǎn)實(shí)踐中減少抗菌藥物的使用。