沉默N-cadherin對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

近年來，基于牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）的牙髓再生是一個(gè)研究熱點(diǎn)

。DPSCs 作為牙髓再生的重要種子細(xì)胞，其生物學(xué)特性受到復(fù)雜因素的調(diào)控

。間充質(zhì)干細(xì)胞的再生潛能很大程度取決于其所處的由各種組織成分、細(xì)胞群體和可溶性因子組成的微環(huán)境

。鈣黏蛋白（cadherins）是一類鈣依賴性的黏附分子，目前在人類中已鑒定出100 多種，分為11 個(gè)亞家族

。它們具有不同的組織分布，E-cadherin 主要表達(dá)于上皮細(xì)胞，N-cadherin 則主要表達(dá)于間充質(zhì)細(xì)胞

。Ncadherin 屬于單次跨膜糖蛋白，其胞外結(jié)構(gòu)域以鈣離子依賴性的方式介導(dǎo)鈣黏蛋白分子之間的相互作用，形成細(xì)胞間黏附連接；其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域不僅與細(xì)胞骨架蛋白相連從而使細(xì)胞錨定，而且與黏著斑蛋白、α-catenin 和β-catenin 等多種信號(hào)分子相互作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化等生理過程

。本課題組前期研究顯示，N-cadherin 表達(dá)于人DPSCs

，沉默N-cadherin可在體內(nèi)外促進(jìn)DPSCs 成牙本質(zhì)向分化

。然而，N-cadherin 是否可以調(diào)控DPSCs 的增殖和遷移能力，尚未見報(bào)道。因此，本研究探討沉默N-cadherin對(duì)人DPSCs 增殖和遷移能力的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清、青霉素、鏈霉素、DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；PrimeScriptTM RT Master Mix 試劑盒、SYBR

Premix Ex TaqTM 試劑盒（Takara，日本）；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑PMSF、磷酸酶抑制劑、BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（碧云天，中國）；N-cadherin 抗體（Santa Cruz，美國）；GAPDH 抗體、羊抗兔IgG 二抗（Abcam，美國）；CCK-8 試劑（同仁，日本）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（凱基，中國）；Transwell 小室（Corning，美國）；CO

恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Forma 311，Thermo，美國）；超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，Thermo，美國）；MD 多功能酶標(biāo)儀（SpectraMax M5，Molecular Devices，美國）；流式細(xì)胞儀（FACSCanto II，BD，美國）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR 系統(tǒng)（Light Cycler 480，Roche，瑞士）；倒置相差顯微鏡（IX71，Olympus，日本）。

1.2 方法

1.2.1 DPSCs 培養(yǎng) 本實(shí)驗(yàn)關(guān)于人離體牙及DPSCs 的使用已獲得南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（審批號(hào)：NFEC-2017-017）。在簽署知情同意書的前提下，于南方醫(yī)院口腔頜面外科門診收集13～18 歲因正畸需要而拔除的健康前磨牙，采用改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人DPSCs

。將DPSCs 接種于含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基中，放置于37 ℃、5%CO

的孵箱中培養(yǎng)。使用第3 代或第4 代DPSCs 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)所使用慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因公司提供，慢病毒載體為GV248，元件順序?yàn)閔U6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin。Ncadherin shRNA 沉默組干擾靶點(diǎn)序列為5'-AGTGACTATTAAGAGAAAT-3'，陰性對(duì)照組（shRNANC）靶點(diǎn)序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'。將DPSCs 以3×10

個(gè)/mL 密度接種于6 孔板，慢病毒以50∶1 的感染復(fù)數(shù)加入細(xì)胞中，10 h 后更換病毒液為正常培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h 后檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 qRT-PCR 檢測(cè)N-cadherin 的mRNA 表達(dá) 慢病毒轉(zhuǎn)染DPSCs 72 h 后，Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop 測(cè)定RNA 純度、濃度，使用Prime-Script

RT Master Mix 試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以SYBR

Premix Ex Taq

試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 反應(yīng)，以GAPDH 作為對(duì)照，目的基因的相對(duì)表達(dá)量通過2

方法計(jì)算。相關(guān)基因的引物序列見表1。

傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)植保工作的開展，以大型機(jī)械、人工操作為主導(dǎo)，前者具有作業(yè)效率高的特點(diǎn)，但卻存在設(shè)備成本高的缺陷；后者呈現(xiàn)耗時(shí)長、人力資源多的問題［2］。而在無人機(jī)技術(shù)的衍生下，植保無人機(jī)的使用改變了傳統(tǒng)植保模式，使植保工作更具快速性、高效性。植保無人機(jī)的優(yōu)點(diǎn)具體如下。

試驗(yàn)產(chǎn)品為復(fù)合紡絲制備的PE/PA6皮芯型復(fù)合纖維FDY，皮層為PE材料，芯層為PA6材料。試驗(yàn)紡絲流程如下：

通過非連續(xù)性文本這個(gè)點(diǎn)，帶動(dòng)了現(xiàn)代文閱讀的一片文，就好比將現(xiàn)代文閱讀主觀題的應(yīng)對(duì)關(guān)節(jié)打通了——找到了能動(dòng)起來、施展開來的思維常法。我順勢(shì)提醒學(xué)生——既然“點(diǎn)動(dòng)成線”的有文章可做，那么“線動(dòng)成面”呢——這里的“面”可以是古詩文閱讀、連貫銜接邏輯推斷、作文審題立意完篇……各個(gè)板塊，它們共同構(gòu)成了語文備考這個(gè)“面”。

在細(xì)胞接種后的第3 天，shRNA-NC 組與Ncadherin shRNA 組間凋亡細(xì)胞比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

= 1.322，

＞0.05）（圖4）；在細(xì)胞接種后的第6 天，N-cadherin shRNA 組凋亡細(xì)胞比例大于shRNA-NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

=6.166，

＜0.01）（圖4）。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 收集培養(yǎng)至第3 天和第6 天的shRNA-NC 組和N-cadherin shRNA組DPSCs，加入70%乙醇在4 ℃條件下固定過夜，PBS 洗去固定液，1 000 rpm 離心3 min；將細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒中的RNase A 和PI 以1∶9 的體積比例配制染色工作液；在上述細(xì)胞樣品中加入500 μL新鮮配制的RNase A/PI 染色工作液，在室溫避光環(huán)境下反應(yīng)30 min，上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，記錄激發(fā)波長488 nm 處紅色熒光。

1.2.4 Western blot 檢測(cè)N-cadherin 蛋白表達(dá) 慢病毒轉(zhuǎn)染DPSCs 72 h 后，使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)總蛋白濃度，蛋白樣品經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜上，脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入N-cadherin（1∶1 000）、GAPDH（1∶2 000）一抗，4 ℃搖動(dòng)孵育過夜，然后加入相應(yīng)二抗（1∶5 000）室溫?fù)u動(dòng)孵育1 h，洗膜后化學(xué)發(fā)光顯影并拍照記錄，Image J 軟件進(jìn)行蛋白條帶灰度分析。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集培養(yǎng)至第3 天和第6 天的shRNA-NC 組和N-cadherin shRNA組DPSCs，PBS 洗滌，按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒加入5 μL Annexin V-EGFP 混勻，再加入5 μL PI 混勻，在室溫避光環(huán)境下反應(yīng)15 min，在1 h 內(nèi)上機(jī)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

N-cadherin 可通過多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和分化等生物學(xué)行為。本研究結(jié)果顯示，沉默DPSCs 中N-cadherin 的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖活性呈現(xiàn)早期增高后期減低的趨勢(shì)；在DPSCs增殖早期，沉默N-cadherin 的表達(dá)可通過促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展從而增加細(xì)胞的增殖活性；而在DPSCs增殖后期，沉默N-cadherin 的表達(dá)可通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡和阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展從而降低細(xì)胞的增殖活性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用

檢驗(yàn)，多組間比較用單因素方差分析。

＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定低表達(dá)N-cadherin DPSCs 的構(gòu)建

轉(zhuǎn)染慢病毒后72 h，采用qRT-PCR 和Western blot 分別從mRNA 和蛋白水平檢測(cè)DPSCs 中N-cadherin 的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，N-cadherin shRNA 組N-cadherin 的表達(dá)水平顯著低于shRNA-NC 組和blank 組（

=80.76，

＜0.001）（圖1）。

2.2 沉默N-cadherin 對(duì)DPSCs 增殖能力的影響

劉堅(jiān)認(rèn)為，農(nóng)業(yè)是國家穩(wěn)定的磐石，中國農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)為中國農(nóng)業(yè)作出不可磨滅的貢獻(xiàn)，為農(nóng)產(chǎn)品豐收立下汗馬功勞。然而，目前談藥色變的情況依舊，社會(huì)對(duì)農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)仍存誤解，唯有認(rèn)清農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展大勢(shì)，明晰發(fā)展思路，全力打造一批新型綠色農(nóng)藥企業(yè)，才是解決當(dāng)前農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)問題的著力點(diǎn)。接下來，農(nóng)藥企業(yè)必須緊握安全之槳，高揚(yáng)綠色之帆，確保農(nóng)藥產(chǎn)業(yè)成為撬動(dòng)鄉(xiāng)村振興的有力杠桿，以切實(shí)舉措為國家糧食安全消除后顧之憂。

2.3 沉默N-cadherin 對(duì)DPSCs 細(xì)胞周期的影響

在低細(xì)胞密度時(shí)，N-cadherin shRNA 組穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量多于shRNA-NC 組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

= 8.81，

＜0.001）；在高細(xì)胞密度時(shí)，N-cadherin shRNA 組穿過小孔的細(xì)胞數(shù)量亦多于shRNA-NC 組（

=15.5，

＜0.001）（圖5）。

2.4 沉默N-cadherin 對(duì)DPSCs 凋亡的影響

1.2.5 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將shRNA-NC 組和N-cadherin shRNA 組DPSCs 以3×l0

個(gè)/孔的密度接種于96 孔板中，于第1～8 天進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)設(shè)置6 個(gè)復(fù)孔。加入10 μL/孔CCK-8 試劑，避光孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長處的OD 值。

與shRNA-NC 組相比，N-cadherin shRNA 組細(xì)胞增殖活性在第1、2、5 天變化無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＞0.05），第3、4 天細(xì)胞增殖活性增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

＜0.05），第6、7、8 天（

＜0.05）細(xì)胞增殖活性降低（圖2）。

2.5 沉默N-cadherin 對(duì)DPSCs 遷移能力的影響

在細(xì)胞接種后第3 天，與shRNA-NC 組相比，N-cadherin shRNA 組細(xì)胞處于G1 期的比例降低，處于S 期和G2 期的比例升高，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

= 3.959，

＜0.05）（圖3）；細(xì)胞接種后第6 天，N-cadherin shRNA 組細(xì)胞處于G1 期的比例大于shRNA-NC 組，N-cadherin shRNA 組細(xì)胞處于S 期和G2 期的比例則低于shRNA-NC 組（

=3.763，

＜0.05）（圖3）。

3 討 論

1.2.8 Transwell 法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 shRNA-NC組和N-cadherin shRNA 組DPSCs 以2×l0

個(gè)（代表低密度）和5×10

個(gè)（代表高密度）的數(shù)量接種于Transwell 小室的上室，上室加入不含血清的DMEM 培養(yǎng)基，下室加入含有10% FBS 的DMEM 培養(yǎng)基，將細(xì)胞放置于孵箱培養(yǎng)20 h。用棉簽拭去上室表面的細(xì)胞，上室底面的細(xì)胞則采用無水甲醇固定15 min，PBS 漂洗后，對(duì)其進(jìn)行結(jié)晶紫染色，室溫孵育15 min，PBS 漂洗至液體澄清。顯微鏡下觀察，拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，隨機(jī)選取5 個(gè)視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

研究表明，細(xì)胞密度影響細(xì)胞的生物學(xué)特性，細(xì)胞活性和增殖能力隨著細(xì)胞融合度的增加而增強(qiáng)，在80%融合度時(shí)達(dá)到頂峰，而在達(dá)到100 %細(xì)胞匯合時(shí)則明顯下降

。值得關(guān)注的是，隨著時(shí)間的推移，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的密度增加，N-cadherin 的表達(dá)水平則明顯下降

。在體外和體內(nèi)過表達(dá)N-cadherin 均可抑制成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡

。這些結(jié)果提示N-cadherin 可能對(duì)細(xì)胞的增殖能力起負(fù)性調(diào)節(jié)作用，這也與本研究結(jié)果一致，即在細(xì)胞未達(dá)到100%融合度時(shí)，沉默N-cadherin 的表達(dá)可促進(jìn)DPSCs 的增殖活性，但在細(xì)胞達(dá)到100%融合度后，沉默N-cadherin 的表達(dá)不僅可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而且可阻礙細(xì)胞周期進(jìn)展，從而降低細(xì)胞的增殖活性，這可能與細(xì)胞由增殖轉(zhuǎn)向分化有關(guān)

，本課題組前期研究也顯示，沉默Ncadherin 可在體內(nèi)外促進(jìn)DPSCs 成牙本質(zhì)向分化

。本研究證明沉默DPSCs 中N-cadherin 的表達(dá)可改變細(xì)胞周期和凋亡從而影響早期和后期的細(xì)胞增殖活性，并推測(cè)早期與后期細(xì)胞密度的不同可能在其中起著決定性的作用。然而，仍需進(jìn)一步通過檢測(cè)不同細(xì)胞密度條件下DPSCs 中N-cadherin 的表達(dá)水平以及研究其中的分子機(jī)制為上述推測(cè)提供更多證據(jù)。

從技術(shù)層面，主要從信息輸出、加工、使用三個(gè)方面來比較BIM與傳統(tǒng)項(xiàng)目管理系統(tǒng)的區(qū)別。工程項(xiàng)目參與方較多，信息輸入多停留在本部門或者單體工程的界面，易形成質(zhì)量信息孤島。整個(gè)工程的相互傳輸不及時(shí)，阻礙了整個(gè)工程的信息統(tǒng)計(jì)匯總。建設(shè)行業(yè)是大數(shù)據(jù)行業(yè)，工程的圖紙、文件、資料等質(zhì)量文檔，一般以紙質(zhì)的形式保存，電子文件格式繁多，沒有統(tǒng)一的數(shù)據(jù)接口，造成無法隨時(shí)查詢工程質(zhì)量信息，影響了質(zhì)量管理和信息的使用效率（見圖3）。

本研究發(fā)現(xiàn)，沉默N-cadherin 表達(dá)無論是在低細(xì)胞密度還是在高細(xì)胞密度時(shí)均可促進(jìn)細(xì)胞遷移能力。N-cadherin 對(duì)細(xì)胞遷移的能力的作用受到不同細(xì)胞來源的影響。N-cadherin 在上皮源性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮重要作用，通常作為腫瘤細(xì)胞獲得侵襲轉(zhuǎn)移能力的標(biāo)志

。然而，在間充質(zhì)來源的小鼠骨肉瘤細(xì)胞系中，N-cadherin 呈現(xiàn)出低表達(dá)水平，過表達(dá)N-cadherin 可抑制體外細(xì)胞的遷移能力以及體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的能力

。因此，DPSCs 來源于間充質(zhì)的屬性有可能決定了沉默Ncadherin 對(duì)DPSCs 遷移能力的促進(jìn)作用。

綜上所述，沉默N-cadherin 可促進(jìn)DPSCs 增殖、遷移，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合后則轉(zhuǎn)向成牙本質(zhì)向分化，從而促進(jìn)牙髓-牙本質(zhì)復(fù)合體再生，但其中的分子機(jī)制需要更深入的探索。

1.2.3 咳嗽運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練 患者可采用坐姿或半臥位，將手掌輕按胸部，當(dāng)咳嗽時(shí)以手支撐，教會(huì)患者做一深吸氣，自肺部深部咳嗽;連續(xù)3次短吸氣后，咳嗽1聲。

Deng ZL performed the research, and wrote the article. Yan WJ, Zhao WH revised the article. Wu BL designed the study.All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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