富含γ-氨基丁酸的黃茶悶黃技術(shù)初探

張銘銘，范起業(yè)，李文萃，王家鵬，唐小林

（中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310016）

黃茶是我國(guó)六大茶類之一，但因受原料及工藝的限制，產(chǎn)量極低[1]。雖然近年來(lái)黃茶在地方政府的扶持下產(chǎn)量有所增加，但其發(fā)展也不如其他五大茶類[2]。因此，亟需開展黃茶系列研究，從生產(chǎn)加工、市場(chǎng)推廣、營(yíng)銷渠道等多方面下足功夫，開拓黃茶市場(chǎng)，使其品質(zhì)和功能在六大茶類中大放異彩[3]。

研究表明，γ-氨基丁酸（Gamma-aminobutyric acid，GABA）是重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有顯著的降血壓功能[4,5]，也有安神助眠[6,7]、提高記憶力[8]等效果，對(duì)人體健康和保健具有積極作用。該種非蛋白質(zhì)氨基酸在自然界中分布廣泛，但在茶鮮葉中的含量較低，一般在40～50 mg/100 g 之間[9]。研究表明，植物體內(nèi)合成與轉(zhuǎn)化為GABA 的途徑有兩條[10,11]：一條是L-谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化脫羧而成，另一條是由多胺降解的中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化而來(lái)。外界的脅迫作用（溫度、壓力、氧濃度、鹽濃度）和機(jī)械損傷等刺激可促進(jìn)植物體內(nèi)GABA 的形成[12]。茶葉中GABA 含量達(dá)到150 mg/100 g 時(shí)稱之為GABA 茶[9]，茶葉中常采用植物富集法和微生物富集法來(lái)積累GABA。其中，植物富集法主要是對(duì)茶樹鮮葉進(jìn)行厭氧處理[13]、浸泡處理、冷凍處理、紅外線照射[14]等來(lái)激活谷氨酸脫羧酶，加速將谷氨酸或其鹽脫羧轉(zhuǎn)化成目標(biāo)產(chǎn)物；微生物富集法是利用微生物（如酵母菌）體內(nèi)的谷氨酸脫羧酶，促進(jìn)茶葉應(yīng)激代謝合成和積累GABA，如在制茶揉捻過程中加入乳酸菌發(fā)酵液以增加其含量[15]。以上方法大多基于鮮葉或離體鮮葉進(jìn)行研究，仍需進(jìn)行后續(xù)的加工處理，而且在推廣使用上存在很多問題[16]：比如谷氨酸鈉溶液處理鮮葉容易產(chǎn)生“水悶味”；厭氧處理對(duì)品質(zhì)影響相對(duì)較低，但需要專用的生產(chǎn)設(shè)備（茶鮮葉厭氧處理機(jī)），氮?dú)庀託馓幚沓杀疽草^高；微波及紅外線照射處理能耗大、生產(chǎn)成本過高；菌類處理技術(shù)較復(fù)雜且不夠成熟等。

目前，多數(shù)研究集中于提升GABA 在綠茶、紅茶[17]、烏龍茶[18]、白茶及超微茶粉和速溶茶粉[19]等茶類及茶制品中的含量，而關(guān)于高GABA 含量的黃茶研究少之又少[20]。本研究借助黃茶悶黃工序下的氧脅迫環(huán)境，著重考察悶黃方式、悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)GABA 含量的影響，通過感官審評(píng)、GABA 含量測(cè)定結(jié)果來(lái)綜合判定有利的悶黃技術(shù)參數(shù)。研究結(jié)果不僅有助于豐富GABA 在黃茶領(lǐng)域的研究理論體系，而且對(duì)高GABA 黃茶的生產(chǎn)有重要的借鑒意義。此外，該項(xiàng)研究為功能黃茶的開發(fā)探尋了一條新途徑，對(duì)增加黃茶產(chǎn)品花色、開拓黃茶市場(chǎng)、促進(jìn)企業(yè)提質(zhì)增效具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 原料

分別于2020 年春、秋季和2021 年春季，采摘浙江省湖州市德清縣的鳩坑品種鮮葉，嫩度等級(jí)以一芽二葉為主。

1.2 儀器與設(shè)備

YJY-EM-80 茶葉電磁殺青機(jī)，余姚市姚江源茶葉茶機(jī)有限公司；6CR-40 茶葉揉捻機(jī)，浙江綠峰機(jī)械有限公司；6CFJ-200 紅茶發(fā)酵機(jī)，浙江綠峰機(jī)械有限公司；60 型竹編炭焙熱源烘焙籠，浙江省德清莫干山黃芽茶業(yè)有限公司；6CHW-4 鏈板式茶葉烘干機(jī)，浙江綠峰機(jī)械有限公司；DL-6CH-6 型茶葉烘焙機(jī)，泉州得力農(nóng)林機(jī)械有限公司；6CDY-10 茶葉多用機(jī)，安吉元豐茶葉機(jī)械有限公司；SOP 電子天平，賽多利斯儀器公司；TSQ Quantum Access Max 液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，賽默飛世爾科技公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 加工工藝

（1）不同季節(jié)原料對(duì)GABA 含量的影響研究

以2020 年春、秋季鮮葉為原料，均按照干坯悶黃（攤放→殺青→揉捻→初干→悶黃→復(fù)干）的工藝流程加工，通過控制初干時(shí)間（干燥2、4、6 min）得到不同程度的干坯悶黃樣品，進(jìn)行系統(tǒng)性的比較實(shí)驗(yàn)。各工序參數(shù)保持一致：攤放（3 cm 厚，攤放12 h 至鮮葉萎軟，含水率70%左右）、滾筒殺青（前/中/后段溫度：270 ℃/245 ℃/156 ℃，投葉量120 kg/h，含水率48%左右）、揉捻（輕重輕原則，揉30 min）、初干（理?xiàng)l機(jī)轉(zhuǎn)速1000 r/min，250 ℃）、悶黃（自然悶黃16 h）、復(fù)干（鏈板式烘干機(jī)110 ℃，10 min）。

（2）不同悶黃方式對(duì)GABA 含量的影響研究

以春季鮮葉為原料，設(shè)計(jì)4 種不同的悶黃方式進(jìn)行研究，具體工藝流程見表1。相同工序統(tǒng)一技術(shù)參數(shù)，其中攤放、殺青、揉捻的工藝參數(shù)同1.3.1（1），干燥工藝采用鏈板式烘干機(jī)：初烘120 ℃，10～20 min，復(fù)烘110 ℃，至足干。針對(duì)初步實(shí)驗(yàn)結(jié)果，再以烘籠悶黃為研究對(duì)象，細(xì)化研究對(duì)比干坯悶黃和濕坯悶黃兩種方式（見表2）。

表1 黃茶不同悶黃方式的工藝流程Table 1 Yellow tea process flow of different yellowing process methods

表2 干坯悶黃和濕坯悶黃方式比較實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2 The design of the comparative experiment of dry and wet yellowing process

（3）悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)GABA 含量的影響研究

以春季鮮葉為原料，按照濕坯悶黃（攤放→殺青→揉捻→悶黃→干燥）的工藝加工，悶黃工序外的其他工藝參數(shù)保持一致。攤放、殺青、揉捻的工藝參數(shù)同1.3.1（1），干燥工藝參數(shù)同1.3.1（2）。以不悶黃的茶樣作對(duì)照組，不同悶黃設(shè)施及悶黃條件設(shè)計(jì)如表3 所示。

表3 不同悶黃設(shè)施及對(duì)應(yīng)的悶黃條件Table 3 Different yellowing process facilities and corresponding conditions

1.3.2 感官審評(píng)由具有多年評(píng)茶經(jīng)驗(yàn)的專家嚴(yán)格按照GB/T 23776-2018 審評(píng)，并按照品質(zhì)加權(quán)法評(píng)分（總分=外形×25%+湯色×10%+香氣×25%+滋味×30%+葉底×10%）。

1.3.3γ-氨基丁酸含量的檢測(cè)分析

GABA含量按照GB/T 30987-2020的第三法-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定。液相色譜：HILIC 柱，1.9 μm，2.1 mm×100 mm；以20 mmol/L 甲酸銨-水溶液為流動(dòng)相A，20 mmol/L 甲酸銨-乙腈溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫（程序見表4）；流速0.5 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；質(zhì)譜條件：電噴霧離子化；正離子模式掃描；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)法檢測(cè)；噴霧電壓3500 V；離子傳輸管溫度350 ℃；鞘氣10 arb；輔助氣3 arb；吹掃氣1 arb。游離氨基酸含量按照GB/T 8314-2013 測(cè)定。

表4 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法洗脫程序Table 4 Elution procedure by liquid chromatography-tandem mass spectrometry

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

標(biāo)準(zhǔn)偏差分析采用Microsoft office excel 2013 軟件，顯著性分析采用SAS 9.4 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料季節(jié)性對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

以同一品種、嫩度，不同季節(jié)（春、秋季）的鮮葉為原料，采用同一干坯悶黃工藝，改變初干的干燥時(shí)間分別進(jìn)行悶黃以獲得不同茶樣，提升實(shí)驗(yàn)可靠性。由表5 可知，春季黃茶的GABA 含量均高于秋季黃茶，且均值高出15.16 mg/100 g；感官品質(zhì)也顯著優(yōu)于秋季茶樣，總體評(píng)分高出3 分左右。春季鮮葉內(nèi)含物質(zhì)豐富，游離氨基酸含量多（如L-谷氨酸），能為GABA 的形成提供較多的合成先質(zhì)，故反映在成品茶中其氨基酸總量稍高于秋季茶樣，這與前人的研究結(jié)果[21]相一致。

表5 不同季節(jié)原料對(duì)實(shí)驗(yàn)相關(guān)指標(biāo)的影響Table 5 Effects of raw materials in different seasons on relevant experiment indexes

2.2 悶黃方式對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

以春季鮮葉為原料，設(shè)計(jì)4 種悶黃方式，每種悶黃方式下對(duì)應(yīng)3 個(gè)不同樣品進(jìn)行探究，結(jié)果如表6 所示。GABA 的產(chǎn)生量與悶黃方式顯著相關(guān)，表現(xiàn)為：濕坯悶黃＞干坯悶黃＞復(fù)合悶黃2＞復(fù)合悶黃1；感官品質(zhì)也因悶黃方式不同而有所差異，表現(xiàn)為：濕坯悶黃＞復(fù)合悶黃2＞干坯悶黃＞復(fù)合悶黃1。總體而言，濕坯悶黃的GABA 產(chǎn)生量要顯著高于其他三種方式，平均水平最高超出量達(dá)29.63 mg/100 g。整體感官品質(zhì)也以濕坯悶黃方式為最佳，評(píng)分達(dá)到89.67，這與前人研究結(jié)果相似[22]。其次是復(fù)合悶黃2，感官品質(zhì)顯著優(yōu)于復(fù)合悶黃1，這表明揉捻后悶黃效果優(yōu)于殺青后悶黃。濕坯悶黃的茶葉含水率更高，一方面，水分是一切化學(xué)反應(yīng)的介質(zhì)，適宜的含水率能保證茶葉體內(nèi)各類反應(yīng)的正常進(jìn)行；另一方面，高含水率與適宜溫度構(gòu)成的濕熱環(huán)境可促使蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸[23]，從而有利于積累更多的GABA 合成先質(zhì)。而揉捻后茶葉細(xì)胞破損率增加，谷氨酸脫羧酶與基質(zhì)物質(zhì)接觸更加充分，比未揉捻直接悶黃更利于GABA 的形成反應(yīng)，因此復(fù)合悶黃2 的茶樣表現(xiàn)優(yōu)于復(fù)合悶黃1。

表6 不同悶黃方式對(duì)GABA 含量及黃茶感官品質(zhì)的影響Table 6 Effects of different yellowing process methods on GABA content and sensory quality

進(jìn)一步地，選擇GABA 生成量較高的干坯悶黃和濕坯悶黃方式，并且統(tǒng)一悶黃設(shè)施、悶黃溫度及時(shí)間進(jìn)行細(xì)化研究。結(jié)果表明，無(wú)論是GABA 的含量還是總體的感官品質(zhì)，濕坯悶黃方式均優(yōu)于干坯悶黃（見表7），且GABA 的含量差異達(dá)到了顯著水平，也再次證實(shí)了上述結(jié)論的準(zhǔn)確性。

表7 干坯悶黃和濕坯悶黃方式比較實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 7 Results of the comparative experiment of dry and wet yellowing process

綜上，單一的濕坯悶黃與其他悶黃方式相比，能有效提升GABA 含量20～30 mg/100 g，這表明濕熱作用對(duì)悶黃工序中GABA 的產(chǎn)生有重要影響，而該條件下茶坯含水率的適宜范圍及微生物分泌胞外酶的有利溫濕度條件均有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

2.3 悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)γ-氨基丁酸含量的影響

由悶黃方式實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步預(yù)判GABA 生成效果：機(jī)械悶黃＞烘籠悶黃＞自然悶黃（復(fù)合悶黃）。為進(jìn)一步探究悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)GABA 含量的影響，統(tǒng)一采用GABA 生成效果較好的濕坯悶黃方式進(jìn)行試驗(yàn)。秋季進(jìn)行的以機(jī)械悶黃為研究體系，固定悶黃時(shí)間，改變悶黃溫度（30、40、50 ℃）來(lái)比較GABA含量的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50 ℃下GABA 產(chǎn)生量最多，40 ℃下的黃茶品質(zhì)最佳?？赡苁沁m度的高溫增加了葉細(xì)胞的組織透性，為生成反應(yīng)創(chuàng)造了有利條件。故本實(shí)驗(yàn)悶黃溫度均采取50 ℃進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如表8 所示。

表8 不同悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)GABA 含量及黃茶感官品質(zhì)的影響Table 8 Effects of yellowing process facilities and conditions on GABA content and sensory quality

經(jīng)過悶黃處理的茶樣GABA 含量要比不悶的高，增幅在12.38%～23.59%之間，說明厭氧處理（悶黃）能有效提高茶葉中GABA 的含量。由表可知，GABA含量變化也與悶黃設(shè)施及悶黃條件有關(guān)。整體而言，烘籠悶黃和發(fā)酵機(jī)悶黃的GABA 產(chǎn)量顯著高于自然悶黃，兩種設(shè)施間的GABA 產(chǎn)量差異不大，但感官品質(zhì)以烘籠悶黃表現(xiàn)較佳。自然悶黃雖然感官品質(zhì)較好，但GABA 產(chǎn)量卻不高，可能厭氧環(huán)境及溫度未在其形成的適宜范圍。

就GABA 的產(chǎn)生效果而言，機(jī)械悶黃50 ℃，6 h的條件下，GABA 值達(dá)到了127.54 mg/100 g，顯著高于該設(shè)施條件下其他處理，且遠(yuǎn)高于其他設(shè)施樣品中的含量值，感官品質(zhì)得分89.63；烘籠悶黃50 ℃，3 h的條件下，GABA 的產(chǎn)量次高，為119.04 mg/100 g，且感官品質(zhì)達(dá)到90 分以上。此外，烘籠悶黃和機(jī)械悶黃在50 ℃，4 h 的條件下，GABA 含量均超過117.50 mg/100 g，感官品質(zhì)也超過90 分，這表明該條件下較有利于GABA 形成。綜合考慮黃茶的功能成分、感官品質(zhì)及生產(chǎn)效率，烘籠悶黃（50 ℃，3 h/4 h）、機(jī)械悶黃（50 ℃，4 h）的技術(shù)參數(shù)可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)。

值得注意的是，烘籠悶黃下GABA 的含量在2～7 h 內(nèi)整體呈現(xiàn)先增后減趨勢(shì)，在3 h 時(shí)達(dá)到峰值，而機(jī)械悶黃下GABA 的變化規(guī)律則表現(xiàn)為“雙峰型”，6 h時(shí)出現(xiàn)第二次峰值，且為最大值。在悶黃初期，蛋白質(zhì)發(fā)生水解和熱解作用使游離氨基酸含量增加，但隨著悶黃時(shí)間的延長(zhǎng)，氨基酸本身發(fā)生的一系列熱化學(xué)反應(yīng)逐漸加強(qiáng)導(dǎo)致含量下降，故GABA 出現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象[24]。殺青后氧化酶類雖然失去活性，但是機(jī)械悶黃的濕熱環(huán)境可能比烘籠更易使微生物繁衍分泌胞外酶，導(dǎo)致相關(guān)反應(yīng)基質(zhì)增加[25]，從而導(dǎo)致6 h 時(shí)GABA 含量再次增加，具體原因還有待設(shè)計(jì)機(jī)理性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

原料和加工工藝都會(huì)影響茶葉中GABA 的形成。春季原料含有更多的GABA 合成先質(zhì)，故成品茶中的GABA 含量水平比秋茶高出15.16 mg/100 g。悶黃工序給GABA 提供了天然的厭氧環(huán)境，能有效增加茶葉中GABA 的含量，未經(jīng)悶黃的茶樣與悶黃處理的茶樣相比，GABA 含量最高可提升34.29 mg/100 g，增幅12.38%～23.59%?；趷烖S工藝技術(shù)研究結(jié)果，悶黃方式、悶黃設(shè)施及悶黃條件對(duì)GABA 的含量均有影響。就GABA 提升效果而言，濕坯悶黃顯著優(yōu)于干坯悶黃和復(fù)合悶黃（平均水平最高超出29.63 mg/100 g）；烘籠悶黃、機(jī)械悶黃優(yōu)于自然悶黃（均值高出10.20 mg/100 g 以上）；50 ℃、4 h 的悶黃條件有利于GABA大量形成（生成量在106.95～117.60 mg/100 g 范圍內(nèi)）。

研究最終得出一套利于GABA 含量提升的悶黃工藝參數(shù)：以春季鮮葉為原料，采用濕坯悶黃，在發(fā)酵機(jī)50 ℃下悶黃6 h 條件下，GABA 含量可達(dá)到127.54 mg/100 g。而烘籠50 ℃下悶黃3 h，GABA 含量達(dá)119.04 mg/100 g，且感官得分超過90 分，該項(xiàng)悶黃工藝技術(shù)兼顧功能成分含量及品質(zhì)提升效果，且時(shí)間較短，可用于指導(dǎo)生產(chǎn)實(shí)踐。

3.2 討論

多數(shù)研究表明厭氧處理能有效提高茶葉中GABA的含量，故前人多采用此法對(duì)離體鮮葉進(jìn)行厭氧處理以獲得GABA 茶[26]。但該種方法通常需要額外的厭氧設(shè)備及后續(xù)的加工處理，且通常會(huì)帶來(lái)“水悶味”的品質(zhì)問題。本研究利用悶黃工藝本身的厭氧富集優(yōu)勢(shì)，能有效解決這一問題，而且將其他茶類“葉片發(fā)黃”的品質(zhì)劣勢(shì)轉(zhuǎn)變?yōu)辄S茶的品質(zhì)優(yōu)勢(shì)。

雖然春季原料能有效提升GABA 含量（均值：春季75.45 mg/100 g＞秋季60.29 mg/100 g），但由于該實(shí)驗(yàn)中采用的是自然悶黃方式，仍有一定供氧量，并且處于常溫和低含水率的悶黃狀態(tài)，其含量反而不及濕坯悶黃實(shí)驗(yàn)中對(duì)照處理（93.25 mg/100 g）。由此推測(cè)，除了含氧量，悶黃溫度、茶坯水分（干坯/濕坯悶黃方式）等因素對(duì)悶黃工序中GABA 的產(chǎn)生也有影響。悶黃溫度可能會(huì)影響谷氨酸脫羧酶的反應(yīng)活性，茶坯含水率可能會(huì)影響殺青后微生物分泌胞外酶的環(huán)境條件，通過影響酶的產(chǎn)生而影響GABA 的形成，這些都有待機(jī)理性實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。再結(jié)合濕坯悶黃方式下不同設(shè)施處理的GABA 產(chǎn)生效果分析，自然悶黃（部分隔絕氧氣、干坯狀態(tài)）＜不悶黃（完全接觸氧氣、濕坯狀態(tài)）＜自然悶黃（部分隔絕氧氣、濕坯狀態(tài)）＜烘籠悶黃（部分隔絕氧氣、高溫、濕坯狀態(tài)）、機(jī)械悶黃（隔絕氧氣、高溫、濕坯狀態(tài)）。這進(jìn)一步表明除了鮮葉原料，悶黃環(huán)境、悶黃工藝及茶坯狀態(tài)對(duì)GABA 的產(chǎn)生均有重要影響。值得說明的是：本研究中GABA的含量提升效果還達(dá)不到GABA茶的標(biāo)準(zhǔn)，但卻比正常鮮葉含量高出3 倍之多，為GABA 黃茶加工開拓了一種新的思路。

本研究?jī)H為初探性實(shí)驗(yàn)，全面但不夠細(xì)致，有待后續(xù)設(shè)計(jì)系統(tǒng)性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行深入研究。比如基于現(xiàn)有的悶黃工藝及因子研究結(jié)果，加設(shè)外源處理因子（充不同的惰性氣體、紅外燈照射燈）來(lái)協(xié)同GABA 的形成反應(yīng)，將更有效地提高黃茶中GABA 的含量；細(xì)化干燥工藝研究，可探究初干、復(fù)干溫度的高低組合形式對(duì)GABA 保留率的影響；選取同一季節(jié)不同品種的鮮葉，對(duì)比其本身L-谷氨酸含量與經(jīng)過悶黃處理后提升情況，可以找出GABA 茶葉的優(yōu)勢(shì)品種等。此外，目前有關(guān)GABA 在茶樹中的形成機(jī)理尚不夠清晰，基于悶黃工序噴施谷氨酸、谷氨酸鈉溶液等有助于挖掘其形成機(jī)理?？傊狙芯繉?duì)后續(xù)GABA 機(jī)理系列研究、GABA 黃茶工藝研究等奠定了重要基礎(chǔ)，對(duì)黃茶生產(chǎn)實(shí)踐也有實(shí)際應(yīng)用和參考價(jià)值。