佛手益生菌軟糖的制備及其體外消化耐受性分析

唐瑩，鄒波，余元善，李璐，徐玉娟，肖更生*，吳繼軍

（1.華中農(nóng)業(yè)大學食品科學技術學院，湖北武漢 430000）

（2.廣東省農(nóng)業(yè)科學院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點實驗室，廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東廣州 510610）

隨著我國健康戰(zhàn)略的實施，人們對健康的需求日益強烈。傳統(tǒng)糖果已無法滿足人們對健康的需求，功能性糖果將是糖果發(fā)展的一個重要方向，將水果和益生菌應用到糖果中，可提高糖果的功能。大量研究表明，益生菌是一類對人體健康有益的微生物，具有維持腸道屏障完整性，改善因腸道微生物失衡引起的胃腸道功能紊亂、炎癥、免疫力下降以及老年癡呆等[1,2]。目前，益生菌市場發(fā)展迅速，各類益生菌產(chǎn)品琳瑯滿目，層出不窮。但現(xiàn)有益生菌產(chǎn)品主要以凍干粉以及酸奶等發(fā)酵制品為主。糖果在加工過程中溫度高，常用的干酪乳桿菌、雙歧桿菌、植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌等乳酸菌無法存活。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）既能像乳酸菌和雙歧桿菌一樣，具有促消化、促排便、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、免疫調(diào)節(jié)等作用，又具有芽孢菌的抗逆性強、耐高溫高壓、較好的胃腸道耐受能力和易貯藏等優(yōu)點[3-6]。2016 年，凝結(jié)芽孢桿菌被我國列入《可用于食品的菌種名單》，受到研究者和生產(chǎn)商的關注。

佛手富含多酚、多糖和黃酮類化合物等功效成分[7]，眾多研究表明佛手及其化合物具有抗寄生蟲[8]、抗癌[9]、抗消化不良[10]、抗炎[11,12]、抗氧化[13,14]和預防脂肪肝等作用，在我國傳統(tǒng)中草藥中加入佛手干果作為佐劑，可用于治療各種慢性疾病，如呼吸道感染、哮喘和高血壓[15]。將佛手、益生菌和糖果相結(jié)合，可以兼具糖果的美味以及佛手和益生菌的功能。

本文通過單因素和響應面優(yōu)化確定軟糖的工藝參數(shù)，并探究軟糖中凝結(jié)芽孢桿菌在胃腸道環(huán)境下的耐受能力，可為佛手益生菌軟糖的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

佛手，購買于廣東省廣州市。

凝結(jié)芽孢桿菌菌粉（Bacillus coagulans），薩賓莎（南京）生物科技有限公司。

LB 肉湯培養(yǎng)基、LB 瓊脂培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；胃白酶（酶活力3200 U/mg）、豬胰蛋白酶（酶活力4～6 U/mg）、豬膽鹽，上海源葉生物科技有限公司；明膠，永信食品配料有限公司。

1.2 儀器與設備

立式蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；HWS-26 型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學儀器公司；PB-10 pH 計，德國Sartorius 公司；超凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 佛手益生菌軟糖的制備

軟糖制作工藝流程圖見圖1。冷凍佛手室溫下解凍，置于破壁料理機中，加入2 倍質(zhì)量的純水打漿，于高壓滅菌鍋中100 ℃滅菌4 min 備用；明膠用1 倍質(zhì)量的純水溶脹1～2 h，70 ℃水浴溶解，備用。將果葡糖漿與蔗糖1:1 混合，加熱完全融化，加入明膠溶液，攪拌均勻，調(diào)節(jié)溫度，加入佛手漿和凝結(jié)芽孢桿菌菌粉，攪拌，在超凈工作臺上趁熱注入軟糖模具內(nèi)，放置3～4 h 后得到軟糖樣品。

1.3.2 單因素實驗

按原料總質(zhì)量為100%計，以明膠50%，混合糖漿30%，凝結(jié)芽孢桿菌菌粉為總質(zhì)量的0.2%，選取佛手漿添加量、調(diào)和時間、調(diào)和溫度三個因素進行單因素實驗。

1.3.2.1 佛手漿添加量

在調(diào)和溫度為70 ℃，調(diào)和時間為6 min 的條件下，探究不同佛手漿添加量（10%、12.5%、15%、17.5%、20%）對軟糖活菌數(shù)、質(zhì)構和感官評定的影響。

1.3.2.2 調(diào)和溫度

在調(diào)和時間為6 min，佛手漿添加量為15%的條件下，探究不同調(diào)和溫度（60、70、80、90 ℃）對軟糖活菌數(shù)、質(zhì)構和感官評定的影響。

1.3.2.3 調(diào)和時間

在調(diào)和溫度為70 ℃、佛手漿添加量為15%的條件下，探究不同調(diào)和時間（2、4、6、8、10 min）對軟糖活菌數(shù)、質(zhì)構和感官評定的影響。

1.3.3 響應面優(yōu)化

在單因素的基礎上，分別以軟糖的凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)，硬度、彈性、咀嚼性和膠著性，感官評定為指標，選取佛手漿添加量（12.5%）、調(diào)和溫度（70 ℃）、調(diào)和時間（4 min）進行響應面設計，見表1。

表1 響應面試驗設計Table 1 Response surface test design

1.3.4 凝結(jié)芽孢桿菌菌落數(shù)的測定

活菌總數(shù)測定：采用傾注法，將樣品用0.9%生理鹽水逐級稀釋到10-5、10-6，分別取1 mL 稀釋液于平板上，傾注培養(yǎng)基，凝固后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后觀察計數(shù)[16]，活菌數(shù)以log CFU/g 表示。

1.3.5 質(zhì)構分析

將軟糖用于TPA 質(zhì)構分析，測定軟糖的硬度、彈性、膠著性和咀嚼性四個質(zhì)構參數(shù)。測試條件如下：采用P10 圓柱型探頭，參考，樣品高度為1 cm，測前速率為1 mm/s，測試及測后速率均為0.5 mm/s，壓縮形變率為50%，測試重復次數(shù)為2 次。每組樣品3 個平行，取平均值，保留2 位小數(shù)[17]。

1.3.6 感官評價

篩選10 名食品專業(yè)人員作為感官評價員，組成評定小組，按照GB/T 16860-1997 的方法進行感官評價。

1.3.7 模擬體外消化體系

模擬胃腸消化試驗參考Zhuang 等[18]和Jiao 等[19]的方法。

1.3.7.1 模擬胃液消化試驗

配置PBS 緩沖液（pH 6.8），裝瓶到錐形中用稀鹽酸分別調(diào)節(jié)pH 到1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5。121 ℃滅菌21 min 后，加入10 g/L 的胃蛋白酶，溶解后用0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。將軟糖與生理鹽水1:1 用搗碎機搗碎成漿后，以10%（g/g）的添加量添加至人工胃液中，置于37 ℃ 100 r/min，恒溫搖床進行消化，于0、1、2、3 h 后取樣檢測凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)。

1.3.7.2 模擬腸液消化試驗

制備PBS 緩沖溶液，用NaOH 調(diào)節(jié)pH 至7.5。121 ℃高壓滅菌15 min 后添加10.0 g/L 胰蛋白酶，充分溶解，用無菌0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。將軟糖漿以10%（g/g）的添加量加至人工腸液中，放置37 ℃、100 r/min，恒溫搖床進行消化，于0、1、2、3、4 h后取樣檢測凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)。

1.3.7.3 模擬膽鹽消化試驗

取LB 肉湯培養(yǎng)基，分別以0、1、2、3、4 g/L 添加至LB 肉湯培養(yǎng)基中，121 ℃滅菌。將軟糖漿以10%（g/g）的添加量加至模擬膽液中，放置37 ℃、100 r/min，恒溫搖床進行消化，于0、24 h 后取樣檢測凝結(jié)芽孢桿菌活菌數(shù)。

1.3.7.4 模擬胃腸道體系試驗

配置pH 為3.0 的人工胃液，配置加有3 g/L 膽鹽的人工腸液，用無菌0.22 μm 微孔濾膜過濾除菌。將軟糖漿以10%（g/g）的添加量添加至人工胃液中，放置37 ℃、100 r/min 恒溫搖床消化2 h。然后，從上述已消化2 h 的人工含菌胃液取1 mL，加入到已加如、入3 g/L 膽鹽的人工腸液中，在37 ℃、100 r/min 的恒溫搖床中繼續(xù)培養(yǎng)。在第0、2、4、6、8、10 h 時間點進行取樣，檢測凝結(jié)芽孢桿菌菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用Origin 2017、Design 11 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，并采用SPSS 17.0 軟件的ANOVA 方法對結(jié)果進行單因素方差分析，p＜0.05 表示樣品間具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 佛手漿添加量對軟糖質(zhì)構和感官品質(zhì)的影響

佛手漿添加量對感官品質(zhì)的影響見圖2a，當添加量為10%時，佛手香味較淡，且?guī)в忻髂z的腥味；佛手漿添加量為15%及以上時，軟糖呈現(xiàn)出佛手的苦味；當佛手漿添加量為12.5%時，軟糖香甜可口，佛手香味濃郁，感官品質(zhì)最佳；由圖2b 可知，軟糖的活菌數(shù)隨著佛手漿添加量的增加而增加，可能是佛手漿中的果膠、多糖等些物質(zhì)對凝結(jié)芽孢桿菌有一定的保護作用；由圖2c 和2d 可知，佛手漿含量對軟糖質(zhì)構的影響，軟糖的硬度、咀嚼性、膠著性隨著佛手漿添加量的增大而增大，而其彈性隨著佛手漿含量的增加而降低。

2.1.2 調(diào)和溫度對軟糖質(zhì)構和感官品質(zhì)的影響

由圖3 可知，調(diào)和溫度為70 ℃時軟糖的口感最佳。凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)隨著調(diào)和溫度的增加而逐漸減少，溫度過高不僅會影響益生菌的存活率，還會破壞明膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構，導致軟糖的硬度、彈性、咀嚼性降低，影響軟糖的感官評價。

2.1.3 調(diào)和時間對軟糖質(zhì)構和感官品質(zhì)的影響

由圖4 可以看出，調(diào)和4 min 時，軟糖感官品質(zhì)最好；活菌數(shù)則隨著調(diào)和時間的延長，存活率逐漸下降；同時調(diào)和時間的延長也會對明膠網(wǎng)狀結(jié)構造成一定的破壞，導致軟糖的硬度、彈性、咀嚼性降低，影響軟糖的品質(zhì)。

2.2 響應面實驗結(jié)果與分析

2.2.1 響應面試驗結(jié)果

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇佛手漿添加量（A）、調(diào)和溫度（B）、調(diào)和時間（C）為因變量，感官評分（Y）為響應值，設計三因素三水平的響應面試驗，得到的響應面試驗結(jié)果見表3。

表3 響應面試驗設計及結(jié)果Table 3 Response surface test design and results

對模型顯著性分析見表4。回歸方差分析顯著性檢驗表明，該回歸模型F=7.26，p＜0.05，顯示模型顯著回歸，同時，該回歸模型的總決定系數(shù)R2=0.9032，可以看出該模型的擬合程度較為準確?？梢岳迷撃Ｐ蛯浱堑母泄僭u分進行分析和優(yōu)化。

由表4 可知，佛手漿添加量、調(diào)和溫度、調(diào)和時間對感官品質(zhì)的都有極顯著的影響。同時，除AB 項之外的各個因素的交互作用對感官評分都有非常顯著的影響。失擬項p=0.3152＞0.05 模型不顯著，表示模型成立，模型預測值與實際值擬合程度高。A、B、C三因素的交互作用對感官評分的影響是顯著的，對軟糖感官評價的影響為佛手漿添加量＞調(diào)和溫度＞調(diào)和時間，即A＞B＞C，與方差分析結(jié)果相同。通過回歸方程并結(jié)合3D 曲面圖分析得到益生菌軟糖的最佳工藝條件為佛手漿添加量12%、調(diào)和溫度70 ℃、調(diào)和時間4 min，該工藝條件下佛手益生菌軟糖的活菌數(shù)為7.6 log CFU/g，感官評分為89.9。

表4 方差分析結(jié)果Table 4 Results of variance analysis

2.2.2 益生菌軟糖中凝結(jié)芽孢桿菌的體外消化耐受能力分析

在通過胃腸道的過程中存活率是益生菌能夠使宿主受益的重要標準[20]，因此腸道益生菌須有較高的胃腸耐受能力，如在較低pH 的胃液、較高濃度的膽鹽液及較長時間的腸液中能否有較好的存活率，是判斷該益生菌能否成為腸道優(yōu)勢菌的重要標準[21]。

凝結(jié)芽孢桿菌在不同pH 值胃液中的存活率對益生菌軟糖能否產(chǎn)生益生效果具有重要意義。食物攝入后，在人體胃液中停留時間為1～3 h[22]，且pH 值會上升，人空腹時的胃液pH 值可達1.0[23]，因此，選取胃液pH 1.0～3.5，消化時間為3 h 的條件進行試驗。由圖5a 可知，軟糖中凝結(jié)芽孢桿菌的存活率與胃液pH 呈正相關，軟糖中的凝結(jié)芽孢桿菌在不同pH 值的胃液環(huán)境中的存活率不相同，其中在pH 1.0 消化3 h 后，菌群數(shù)由7.28 log CFU/g 下降到3.86 log CFU/g，但是在pH 1.5～3.5 的環(huán)境中，消化3 h 后，凝結(jié)芽孢桿菌菌群數(shù)仍較高，均達6.01 log CFU/g 以上。關小鶯等[24]對干酪乳桿菌發(fā)酵荔枝汁在pH 1.5的胃液進行模擬消化2 h 后，存活率不到50%，于金慧等[25]對鮑芹根際乳酸菌進行胃酸耐受性研究，發(fā)現(xiàn)其在pH 1.5 不能存活。以上結(jié)果表明，凝結(jié)芽孢桿菌相比于乳酸菌和其他腸道益生菌，具有更好的胃酸和胃蛋白酶耐受能力。

佛手益生菌軟糖在腸液中消化4 h 后，凝結(jié)芽孢桿菌的菌群數(shù)僅下降0.27 log CFU/g，鞠葛金悅等[26]發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌腸液消化4 h 后菌群數(shù)分別下降1.05 log CFU/g 和1.06 log CFU/g，表明與植物乳桿菌和發(fā)酵乳桿菌相比，凝結(jié)芽孢桿菌具有較高的腸道耐受能力。

凝結(jié)芽孢桿菌在不同膽鹽濃度培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，測得存活率見圖5c，其活菌數(shù)與膽鹽濃度呈負相關，膽鹽濃度越高，活菌數(shù)越低，凝結(jié)芽孢桿菌在4 g/L濃度的膽鹽條件下菌群數(shù)僅下降1.13 log CFU/g，表明凝結(jié)芽孢桿菌具有較好的膽鹽耐受能力。金迅等[27]和王金果等[28]對凝結(jié)芽孢桿菌進行體外消化，凝結(jié)芽孢桿菌在0.3%膽鹽液中的均達80%以上，與本文研究結(jié)果一致。郭蕓等[29]發(fā)現(xiàn)當膽鹽濃度達到0.25%時，所有乳酸菌菌株均不能生長。

消化一小時后小腸中的膽鹽濃度約為0.3%[20]，因此胃腸消化試驗中取3 g/L 的濃度、胃液pH 3.0 進行試驗。凝結(jié)芽孢桿菌在胃腸消化體系中消化12 h 后仍有較高的菌群數(shù)，從7.34 log CFU/g 僅下降到7.06 log CFU/g，凝結(jié)芽孢桿菌數(shù)在從胃液體系轉(zhuǎn)移至腸液體系中，有顯著性降低，在腸液中的存活率與消化時間沒有明顯變化，消化10 h 后，仍可較好的適應胃腸道環(huán)境，表明凝結(jié)芽孢桿菌有較好的胃腸道耐受能力。

3 結(jié)論

本實驗以佛手益生菌軟糖為研究對象，采用單因素結(jié)合響應面優(yōu)化，探究佛手漿添加量、調(diào)和溫度、調(diào)和時間等因素對軟糖感官、質(zhì)構和活菌數(shù)的影響，確定軟糖的工藝條件為：佛手漿添加量12%、調(diào)和溫度70 ℃、調(diào)和時間4 min，此時軟糖活菌數(shù)7.6 log CFU/g，具有佛手的清香，感官評價最好。同時，探究了軟糖中凝結(jié)芽孢桿菌的胃腸道耐受能力，發(fā)現(xiàn)其對pH 1.5 以上的人工胃液，腸液及膽鹽具有較好的耐受性。以上研究可為佛手益生菌軟糖的開發(fā)提供理論依據(jù)。