米糠不溶性膳食纖維對慢性鎘暴露小鼠的保護作用

劉浩，夏雨虹，劉業(yè)好，吳怡凡，王藝，王榮，姬艷麗

（安徽醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，安徽合肥 230032)

重金屬是指密度在4.5 g/cm3以上的金屬，主要包括汞、鎘、鉛、鉻以及類金屬砷等生物毒性顯著的重元素，其化學性質較為穩(wěn)定，無法降解[1]。隨著工業(yè)生產(chǎn)規(guī)模的擴大，礦山開采的加快，相關產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生的含重金屬的廢水、廢氣、廢渣等進入環(huán)境中，對水體及土壤造成污染，其中尤以土壤污染最為嚴重。據(jù)2014 年發(fā)布的《全國土壤污染狀況調(diào)查公報》顯示，我國土壤污染以鎘、汞、砷等重金屬污染為主，其中鎘污染最為嚴重[2]。作為一類致癌物，鎘是污染食品和水的最具代表性的有毒重金屬之一，其在人體內(nèi)的生物半衰期可達到15～30 年，且易在人體內(nèi)累積，特別是在腎臟中累積，從而導致毒性作用[3,4]。

研究表明，微量的鎘進入機體內(nèi)即可通過生物放大和累積，對肺、骨、腎、肝、免疫系統(tǒng)和生殖器官等產(chǎn)生一系列損傷[5]。目前，臨床上主要使用二巰基丁二酸和乙二胺四乙酸等螯合劑法治療急性鎘中毒，然而尚缺乏有效的治療措施用于慢性鎘中毒[6,7]。因此，目前亟需一種安全有效的方法降低鎘等重金屬在人體內(nèi)的累積。

米糠是稻谷加工后產(chǎn)生的副產(chǎn)品，富含脂質、蛋白質、膳食纖維和其它成分，其營養(yǎng)成分豐富、易獲得、成本低、抗氧化潛力大，對多種代謝疾病都有良好的治療效果[8,9]。用糖裂解酶在水中處理米糠膳食纖維，在70～90 ℃的溫度下加熱，米糠可分解為米糠可溶性膳食纖維和米糠不溶性膳食纖維。不溶性膳食纖維是一類不溶于水也不易被人體消化道消化吸收的纖維，常存在于植物的根、莖、葉、皮及果實中，其具有吸水膨脹的功能，可以增加糞便體積，促進腸道蠕動。并且不溶性膳食纖維在人體腸道中呈網(wǎng)狀結構，這種網(wǎng)狀結構對油脂、膽固醇、葡萄糖等具有物理吸附的作用[10]。有研究發(fā)現(xiàn)[11]，不溶性膳食纖維化學結構中的一些側鏈基團能夠結合陽離子，多項研究也證明[12,13]，不溶性膳食纖維對一些重金屬離子具有結合作用。米糠不溶性膳食纖維主要包含纖維素、半纖維素及木質素等纖維組分，任明非[14]發(fā)現(xiàn)纖維素、半纖維素及木質素都具有體外結合鎘離子的能力，研究表明，三種纖維組分表面的含氧官能團能夠與鎘離子發(fā)生靜電作用，形成沉淀。因此，本研究以米糠為原料，提取不溶性膳食纖維，檢測米糠不溶性膳食纖維在小鼠腸道內(nèi)對鎘的吸附能力，評價其在低劑量慢性鎘暴露下對小鼠的保護作用，并初步探索其保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡雌性ICR 小鼠30 只，購自常州卡文斯實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(蘇)2016-0010。實驗已獲得安徽醫(yī)科大學實驗動物倫理管理與使用委員會批準，倫理實驗許可證號為：安徽醫(yī)科大學LLSC20190356。

1.2 試劑

氯化鎘，阿拉丁生化試劑公司（中國上海）；土壤基因組DNA 快速抽提試劑盒、PCR 純化試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司；熒光定量PCR 試劑盒，北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

Nanodrop1000 微量紫外可見分光光度計，賽默世爾科技有限公司；MiSeq PE300 高通量測序平臺，美國Illumina 公司；羅氏LightCycler96 熒光定量PCR儀，美國Roche 公司；TAS-990G 石墨爐原子吸收分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組

在8 周的實驗期間，對小鼠進行12 h 的光/暗循環(huán)，動物舍中溫度維持在22 ℃，并提供顆粒飼料和水。小鼠隨機分為三組，每組10 只。三組情況如下：陰性對照組：不添加鎘的飲用水+正常飼料；陽性對照組：添加100 mg/L 鎘的飲用水+正常飼料；RBIDF 處理組：添加100 mg/L 鎘的飲用水+含有10% RBIDF 的飼料。

1.4.2 米糠提取RBIDF

根據(jù)相關文獻提取制備RBIDF[15]，方法如下：1.5 kg 粗米糠通過24 目不銹鋼篩得到篩粉，篩粉按料液比1:20（g/mL）加水后混勻，按照篩粉質量加入1%的淀粉酶和0.4%的糖化酶，60 ℃酶解2 h 后，置于沸水浴中滅活10 min。冷卻至室溫后，加入1%的木瓜蛋白酶酶解2 h，再置于沸水浴中滅活10 min。冷卻至室溫后加入1%的纖維素酶，60 ℃酶解1 h，后置于沸水浴中滅活10 min，離心后棄上清，沉淀分別用蒸餾水和95%乙醇清洗，最后置于60 ℃烘箱干燥。RBIDF 提取率為32.68%（提取RBIDF 重量/米糠重量），用國標法對提取的RBIDF 進行測定分析[16]，其純度為79.82%（RBIDF 實際含量/提取RBIDF 重量）。

1.4.3 大腸埃希菌體外培養(yǎng)

腸道菌群構成復雜，種類豐富，腸道中大部分細菌無法進行體外培養(yǎng)，因此無法用計數(shù)法評估鎘對腸道菌群生長的影響。我們以腸道菌群中最常見的可培養(yǎng)大腸埃希菌（ATCC-25922）作為研究對象，通過體外培養(yǎng)該細菌并制作生長曲線，觀察鎘對細菌生長的影響以及RBIDF 對鎘的吸附作用。按照Liu 等[17]的方法構建生長曲線，主要步驟為：制備三種培養(yǎng)基，分別為：LB 液體培養(yǎng)基（陰性對照組）、含100 mg/L鎘的LB 液體培養(yǎng)基（陽性對照組）、含10% RBIDF（重量體積比）及100 mg/L 鎘的LB 液體培養(yǎng)基（RBIDF 處理組），在三種培養(yǎng)基中接種大腸埃希菌，將培養(yǎng)基置于37 ℃、225 r/min 條件下震蕩培養(yǎng)，分別在培養(yǎng)3、5、7、9、24 h 后吸取1 mL 菌種，通過梯度稀釋法計數(shù)細菌數(shù)目。以培養(yǎng)時間為X 軸，細菌數(shù)量為Y 軸，根據(jù)細菌數(shù)量與培養(yǎng)時間的關系來構建生長曲線，同時在實驗結束后測定RBIDF 處理組及陽性對照組培養(yǎng)基中游離鎘離子的濃度。

1.4.4 小鼠組織、血液和糞便中鎘含量的測定

實驗結束后處死小鼠，收集血液、組織樣本（肝臟、腎臟和小腸），測定小鼠組織、血液和糞便中的鎘含量。檢測步驟如下：稱取適量待測樣品置于微波消解罐，加入HNO3:H2O2=2:1 混合消化液，使用微波消解系統(tǒng)進行消解。消解完畢后使用石墨爐原子吸收光譜法測定樣品中鎘的含量，儀器工作條件：波長：228.8 nm；燈電流：2 mA；光譜通帶：0.4 nm；測量方式：氘燈背景校正；信號方式：峰高；積分時間：6 s；氬氣流量：250 mL/min；進樣體積：10 μL。

1.4.5 小鼠糞便中SCFAs 含量測定

收集小鼠糞便，對糞便中SCFAs 的含量進行氣相色譜分析。具體方法為：稱取單粒糞便，在0.1 mL 去離子水中均質化3 min，并使用5 mol/L HCl 將溶液pH調(diào)整為2～3 左右，然后3000 r/min 離心20 min，取上清液，加入2-乙基丁酸作為內(nèi)標物，使其終濃度為1 mmol/L。樣品制備完成后，用氣相色譜儀進行色譜分析，分析條件如下：載氣：高純氮氣，流速14.4 mL/min；進樣口溫度：200 ℃；升溫程序：80 ℃保持30 s，然后以8 ℃/min 升溫至180 ℃，保持60 s，再以20 ℃/min 升溫至200 ℃，保持5 min；進樣量：1 μL；檢測時間：32 min。

1.4.6 DNA 提取、熒光定量PCR 擴增和腸道菌群分析

使用DNA 提取試劑盒從小鼠糞便中提取腸道菌群基因組DNA，然后使用Nanodrop1000 對提取的總DNA 進行定量?；蚪MDNA 提取和定量后，進行熒光定量PCR 擴增，樣品使用341F/518R 通用引物、用熒光定量PCR 試劑盒在PCR 儀上進行菌落總數(shù)的檢測。取1 ng 純化后的糞便DNA 用于細菌16S rRNA基因V3 區(qū)的擴增，擴增引物為27F/338R。用PCR 純化試劑盒對PCR 產(chǎn)物進行純化，然后通過測序平臺進行MiSeq 高通量測序分析，測序結果使用QIIME 平臺進行生物信息學分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

2 結果與討論

2.1 不同培養(yǎng)基中大腸埃希菌生長變化

細菌培養(yǎng)結束后，對RBIDF 處理組及陽性對照組培養(yǎng)基中游離鎘離子濃度的測定發(fā)現(xiàn)，與陽性對照組相比，RBIDF 處理組培養(yǎng)基中游離鎘離子的濃度下降了84.97%，這表明RBIDF 能與溶液中的鎘離子結合從而降低游離鎘離子的濃度。由大腸埃希菌24 h 生長曲線可以看出，RBIDF 處理組大腸埃希菌生長速度明顯提高，細菌數(shù)量達到了對照水平。而在未添加RBIDF 處理的陽性對照組，大腸埃希菌生長非常緩慢，細菌數(shù)量顯著低于對照。這些結果表明，RBIDF可通過結合效應顯著降低培養(yǎng)基中游離鎘離子的濃度，減輕鎘對大腸埃希菌生長的抑制。吳玨等[18]研究了米糠不溶性膳食纖維對鉛離子的吸附作用，發(fā)現(xiàn)米糠不溶性膳食纖維可以通過物理吸附作用結合鉛離子，提示米糠不溶性膳食纖維可以通過吸附作用與重金屬離子結合，與我們的研究結果一致。

2.2 RBIDF 攝入對小鼠主要組織器官中鎘含量的影響

鎘極易在人和動物的組織器官中累積，進而危害機體健康，檢測小鼠組織器官中的鎘含量，觀察RBIDF 攝入能否降低小鼠主要組織和器官中的鎘濃度。結果如表1 所示，與陽性對照組相比，RBIDF 處理組小鼠的血液、肝臟和小腸樣本中的鎘含量顯著下降，其中血液中的鎘含量下降了66.67%，肝臟中下降了57.67%，小腸中下降了27.15%。同時，RBIDF 處理組糞便樣品中鎘含量增加了60.64%，但腎臟樣本中鎘含量沒有顯著下降。小鼠組織和器官中的鎘來自小鼠的腸道，RBIDF 在小鼠腸道中通過吸附作用與鎘結合，進入機體的鎘含量減少，從而降低小鼠組織和器官中的鎘濃度。鎘經(jīng)消化道攝入進入小鼠體內(nèi)，經(jīng)血液運輸至肝臟、腎臟等器官，腎臟是鎘中毒的靶器官，可蓄積大量的鎘，同時，腎臟也是鎘的排泄器官，鎘能夠通過腎臟隨尿排出。兩組腎臟樣本中鎘含量沒有顯著差異可能是因為低劑量慢性鎘暴露沒有超過腎臟排泄功能的最大負荷。任明非[14]通過動物實驗研究米糠不可溶膳食纖維預防鎘離子毒性損害的效果，結果發(fā)現(xiàn)，米糠不可溶膳食纖維能夠促進鎘的排出，減少機體中的鎘蓄積，緩解鎘暴露對小鼠組織器官的損傷，這與我們的研究結果是一致的。

表1 小鼠組織器官中鎘含量Table 1 Cadmium content in mice tissues and organs (,n=10)

表1 小鼠組織器官中鎘含量Table 1 Cadmium content in mice tissues and organs (,n=10)

注：*p＜0.05，與陽性對照組相比。

2.3 RBIDF 攝入對小鼠腸道中SCFAs 生成的影響

SCFAs 主要由乙酸、丙酸和丁酸組成，三者含量占腸道中SCFAs 總量的90%～95%。如圖2 所示，與陰性對照組相比，陽性對照組小鼠腸道中的SCFAs含量顯著下降，其中乙酸含量下降22.22%，丙酸含量下降60.00%，丁酸含量下降69.23%。相比于陽性對照組，RBIDF 處理組乙酸、丙酸和丁酸含量分別達到了陽性對照組的1.30、2.25、2.75 倍。鎘能減少碳水化合物代謝生成SCFAs 過程中關鍵酶基因的拷貝數(shù)，從而導致腸道中SCFAs 的含量顯著降低。SCFAs 對于調(diào)節(jié)腸道菌群平衡及維持腸道環(huán)境穩(wěn)定至關重要，腸道內(nèi)SCFAs 含量的調(diào)控與機體的腸道健康緊密相關，SCFAs 含量下降會導致腸道菌群功能紊亂。結果表明RBIDF 可以通過吸附鎘降低腸道中的鎘濃度，從而緩解鎘暴露小鼠腸道中SCFAs 含量的下降。并且，膳食纖維可代謝產(chǎn)生SCFAs，RBIDF 攝入可能對小鼠腸道中SCFAs 的生成具有促進作用。王津等[19]對茶葉膳食纖維進行了研究，發(fā)現(xiàn)腸道菌群在茶葉膳食纖維發(fā)酵液中會產(chǎn)生各種有機酸，發(fā)酵液中的短鏈脂肪酸含量隨著發(fā)酵時間的增長顯著增加，說明腸道菌群可以發(fā)酵膳食纖維產(chǎn)生短鏈脂肪酸。

2.4 RBIDF 攝入對小鼠腸道細菌總量的影響

如圖3 所示，與陰性對照組相比，陽性對照組的腸道細菌數(shù)量明顯下降，僅為陰性對照組的68.00%。與陽性對照組相比，RBIDF 處理組腸道細菌數(shù)量大大提升，達到了陽性對照組的1.40 倍。腸道中細菌種類豐富，腸道微生物的平衡對機體的健康與發(fā)育至關重要。鎘具有誘導氧化應激的能力，對腸道菌群的生長具有抑制作用，結果表明，雖然慢性鎘暴露導致小鼠腸道細菌的數(shù)量下降，但是RBIDF 攝入可以促進小鼠腸道細菌數(shù)量恢復。魏國華[20]研究了香蕉果肉中的膳食纖維對高脂喂養(yǎng)小鼠腸道菌群的影響，結果顯示，高脂喂養(yǎng)小鼠的腸道菌群豐富度與多樣性降低，腸道菌群發(fā)生紊亂，經(jīng)膳食纖維飲食干預后，小鼠腸道菌群的改變有所逆轉，這與本研究結果是一致的，說明膳食纖維的攝入對腸道菌群具有保護作用，可以恢復腸道菌群的正常結構與功能。

2.5 RBIDF 攝入對小鼠腸道菌群結構的影響

通過對16S rRNA 基因V3 區(qū)進行MiSeq 測序來分析腸道菌群的整體結構變化，檢測RBIDF 是否在慢性鎘暴露時對腸道菌群起到保護作用。結果發(fā)現(xiàn)RBIDF 處理組與陽性對照組在腸道菌群結構上有著顯著的差異，如圖4 所示，陽性對照組中以擬桿菌門（55.71%）、厚壁菌門（33.25%）和疣微菌門（5.62%）為主，陰性對照組以擬桿菌門（69.31%）、厚壁菌門（17.80%）和變形菌門（8.91%）為主，RBIDF 處理組與陰性對照組結構相似，以擬桿菌門（68.75%）、厚壁菌門（23.67%）和變形菌門（6.82%）為主。陰性對照組和RBIDF 處理組都以厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢菌門，其細菌群落結構相似，兩者的特征都是擬桿菌門的豐度較高，厚壁菌門的豐度較低。疣微菌門在陽性對照組中富集程度較高，在陰性對照組與RBIDF 處理組中較少見。使用加權UniFrac 距離對各組小鼠腸道菌群進行主坐標分析，主坐標分析是一種通過數(shù)據(jù)降維來進行分析的方法，常用來研究樣本群落組成的相似性或差異性。通過加權UniFrac 距離測量細菌群落之間的相似度，評估各組小鼠腸道菌群的差異大小。結果如圖5 所示，RBIDF 組小鼠樣本與陰性對照組之間距離較小，與陽性對照組樣本距離較大，陽性對照組與陰性對照組及RBIDF 組在PC1 和PC2方向上出現(xiàn)了明顯的分離，且PC1 可以解釋47.95%的差異，PC2 可以解釋35.32%的差異，表明在Cd 暴露條件下，RBIDF 的加入導致陽性對照組和RBIDF處理組在小鼠腸道菌群結構上出現(xiàn)了顯著的差異；RBIDF 組與陰性對照組樣本之間有一定的距離，提示兩組小鼠腸道菌群結構不完全相同，存在一定的差異。李少艇[21]研究了高膳食纖維飲食對大鼠腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)高膳食纖維飲食會增加正常大鼠腸道菌群的多樣性，并且促進擬桿菌的生長，說明膳食纖維的攝入可以調(diào)控腸道菌群的變化，對于促進腸道菌群健康是有益的。

3 結論

本研究探討了RBIDF 對慢性鎘暴露小鼠的保護機制，研究發(fā)現(xiàn)RBIDF 對鎘具有吸附作用，可以減少組織器官中鎘的累積，并恢復正常腸道菌群結構。鎘毒性強且易在機體內(nèi)蓄積，排放到環(huán)境中的鎘污染物可以通過食物鏈富集然后進入機體，從而造成機體慢性鎘中毒。目前，臨床上經(jīng)常使用螯合劑法來治療急性鎘中毒，然而尚缺乏有效的治療措施用于慢性鎘中毒。RBIDF 攝入可以增加鎘的吸附并促進鎘隨糞便排出，對于預防和緩解慢性鎘中毒具有重要意義。此外，RBIDF 是米糠提取物，米糠是稻谷加工后產(chǎn)生的副產(chǎn)品，其年產(chǎn)量達到上千萬t，作為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品，米糠資源并沒有被充分開發(fā)利用，加大對米糠不溶性膳食纖維的研究開發(fā)，不僅能夠提升米糠資源的綜合利用率，推動產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟發(fā)展，同時可以為農(nóng)業(yè)副產(chǎn)品的開發(fā)利用提供新的思路。