粉葛與葛根多糖對脂多糖誘導RAW264.7 細胞的抗炎作用

張壯，李瓊，黃麗萍，崔玉順，劉榮華，馮育林*，歐陽輝*，朱衛(wèi)豐，楊世林

（1.江西中醫(yī)藥大學中藥固體制劑制造技術國家工程研究中心，江西南昌 330006）

（2.江西中醫(yī)藥大學藥學院，江西南昌 330004）

（3.江西中醫(yī)藥大學現(xiàn)代中藥制劑教育部重點實驗室，江西南昌 330004）

葛根屬豆科，學名Pueraria lobata（Willd.）Ohwi，入藥常用其干燥根，有豐富的食用以及藥用價值，為我國傳統(tǒng)的藥食兩用植物[1]。國內現(xiàn)有葛根品種多樣化，葛根的正品為1977～2000 版《中國藥典》記錄的Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 和甘葛藤P.thomsonii Benth.的干燥塊根。隨著近年來藥理研究的不斷發(fā)展，粉葛被單獨列為一個品種，野葛為正品葛根。有研究表明，葛根具有抗糖尿病[2]、降血壓[3]、抗氧化[4]、抗骨質疏松[5]和調節(jié)免疫系統(tǒng)的作用[6]。

對葛根生物活性的深入探索表明，葛根多糖具有抗氧化、免疫調節(jié)、降血糖的作用[7,8]。宋淑珍等[9]對不同純度葛根多糖進行了生物活性比較，結果表明不同提取過程會影響葛根多糖的抗氧化能力及其生物活性。蔡春沉等[10]對葛根多糖對2 型糖尿病大鼠的治療作用及機制進行了研究，發(fā)現(xiàn)葛根多糖可以有效改善2 型糖尿病大鼠的相關生化指標，具有降血糖和降血脂作用，具有一定的抗氧化能力。楊長友[11]采用平板打洞法研究了葛根多糖的抑菌活性，結果表明葛根多糖對供試菌種有明顯的抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌抑制作用最強。崔恒祥等[12]使用陰離子交換和凝膠滲透色譜法從野葛根水提取物中分離出一種水溶性葡聚糖并分析其化學結構，證明該多糖能顯著抑制過氧化氫所致的PC12 細胞損傷。Kim 等[13]發(fā)現(xiàn)葛根多糖通過TLR4 膜受體傳導信號誘導小鼠脊髓中樹突細胞（DC 細胞）成熟。

巨噬細胞是參與炎癥反應啟動的重要炎癥細胞，通過分泌大量促炎介質和促炎細胞因子，在眾多炎癥疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮關鍵作用。巨噬細胞表面的模式識別受體可以識別并與多糖結合，經各種信號傳導通路將信號傳入細胞內，使細胞內產生一系列的信號級聯(lián)反應，從而調控免疫相關基因的表達。植物多糖對巨噬細胞的免疫調節(jié)作用主要通過改變其形態(tài)、吞噬活性、細胞因子表達量等來實現(xiàn)。現(xiàn)代免疫學認為，天然活性物質具有代替抗生素來提高機體免疫應答的潛能。脂多糖在誘導炎癥反應和導致各種炎癥疾病中發(fā)揮著重要作用，是革蘭氏陰性菌細胞壁的化合物[14]。本文從對粉葛、葛根粗多糖以及粉葛均一多糖研究較少的抗炎活性入手，以小鼠RAW264.7 巨噬細胞為研究對象，以探究其抗炎活性的不同及其可能的機制。首先測定了三種不同多糖對RAW264.7 細胞的毒性，后面通過脂多糖（LPS）誘導炎癥，在三種不同多糖作用后檢測炎癥因子NO、IL-6 和TNF-α釋放的變化，根據(jù)其活性的不同最后對葛根粗多糖發(fā)揮抗炎作用的機制進行了探究，為葛根在藥用開發(fā)領域奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原料

1.1.1 細胞、藥物與試劑

RAW264.7 細胞，ATCC 細胞庫；粉葛粗多糖（FGC）、葛根粗多糖（GGC）、粉葛均一多糖（FGJ），江西中醫(yī)藥大學課題組自制；胎牛血清，Gibco 公司；DMEM、PBS，北京索萊寶科技有限公司；脂多糖，美國Sigma 公司；BCA 蛋白定量試劑盒，上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司；ELISA 試劑盒，北京四正柏生物科技有限公司；iNOS、COX-2，Proteintech 公司、p-p65、p65、IκBα、p-IκBα、β-actin 抗體，美國CST公司；逆轉錄試劑盒、Syber Green，翌圣生物科技股份有限公司；AnnexinV-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒，大連美侖生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

SW-CJ-1FD 超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；JW-3401CO2 培養(yǎng)箱，江西省立康科技有限公司；TS2 顯微鏡，Nikon 公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；HC-3018R 低溫高速離心機，安徽中科中佳科學儀器有限公司；TD5Z 離心機，北京市華瑞科學器材有限公司；HX-20G2 恒溫金屬浴，上海滬析實業(yè)有限公司；Bio-Rad 蛋白電泳儀和轉膜儀、Bio-Rad 高靈敏度化學發(fā)光成像儀，伯樂生命醫(yī)學產品有限公司；Prism 7500 熒光定量PCR 儀，美國ABI公司；NanoDrop 微量分光光度計，Thermo Fisher 科技公司；InfiniteM200PRO 酶標儀，瑞士TECAN 公司；Gallios 流式細胞儀，美國Beckman 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗多糖的制備

稱取30.0 g 粉葛（或葛根）于1000 mL 三頸瓶中，加入600 mL 純凈水，在恒溫電熱套中進行回流提取，溫度升至100 ℃開始計時，提取時間為120 min，120 min 后倒出提取液，加入600 mL 純凈水，進行第二次的提取，將兩次提取液合并，用旋轉蒸發(fā)儀加壓濃縮至掛壁，冷卻至室溫加入1:2 體積比的95%乙醇進行醇沉，靜置過夜，過濾后將沉淀用純凈水復溶，離心后上清液進行干燥，記錄粗多糖質量，粉葛粗多糖含量經苯酚-硫酸法測定為76.35%，野葛粗多糖含量經苯酚-硫酸法測定為70.97%。

1.2.2 粉葛均一多糖的制備稱取適量粉葛粗多糖用蒸餾水充分溶解后，用HP-20 大孔樹脂柱進行脫色除蛋白，吸附12 h 后，用蒸餾水洗脫至多糖全部流出（苯酚-硫酸法監(jiān)測），冷凍干燥即得脫色和除蛋白后的粗多糖。稱取純化后的粉葛粗多糖3 g，加適量蒸餾水使其充分溶解，離心取上清后上樣到葡聚糖凝膠G-200 中，用超純水洗脫至沒有顏色，取中間段進行含量測定，得到含量為94.64%。

1.2.3 細胞培養(yǎng)

在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)RAW264.7 細胞。細胞密度達到80%時，傳代細胞。之后取處于對數(shù)生長期的細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.4 FGC、GGC 以及FGJ 的細胞毒性檢測

收集細胞沉淀，稀釋細胞使密度為 1×105cells/mL，各取100 μL 細胞懸液加入96 孔板中過夜使其完全貼壁。分為對照組、加藥組。加藥組分別加入FGC、GGC 以及FGJ（10、20、40 μg/mL）預處理24 h，每組重復6 孔。棄上清，每孔加100 μL 10% CCK8，37 ℃孵育2 h，酶標儀在450 nm 處檢測其OD 值。求得細胞存活率。

存活率/%=(OD給藥-OD空白)/(OD對照-OD空白)

1.2.5 FGC、GGC 以及FGJ 對NO 釋放的影響

收集細胞沉淀，稀釋細胞使密度為 4.0×105cells/mL，各取500 μL 細胞懸液加入24 孔板中過夜使其完全貼壁。分為對照組、模型組、加藥組。加藥組分別加入FGC、GGC 以及FGJ（10、20、40 μg/mL）預給藥4 h，加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h。最后，每組各吸取50 μL 上清轉移至96 孔板中，然后每孔加入50 μL 的Griess 試劑A 和B，酶標儀于540 nm 處檢測其OD 值。

1.2.6 FGC、GGC 以及FGJ 對TNF-α、IL-6炎癥因子釋放的影響

將1.2.3 中各組細胞剩余上清液稀釋2 倍，通過ELISA 試劑盒檢測FGC、GGC 以及FGJ 對TNF-α、IL-6 產生量的影響。

1.2.7 GGC 對iNOS/COX-2 蛋白表達的影響

收集細胞沉淀，稀釋細胞使密度為 4.0×105cells/mL，各取2 mL 細胞懸液加入6 孔板中過夜使其完全貼壁。分為對照組、模型組、加藥組。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度，通過標準曲線計算蛋白上樣量用于后續(xù)實驗。通過Western blotting 法對iNOS、COX-2、β-actin 進行檢測。

1.2.8 GGC 對核轉錄因子-κB（NF-κB）通路的影響

按1.2.5 方法接種細胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育2 h，吸凈上清，裂解細胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度，通過標準曲線計算蛋白上樣量用于后續(xù)實驗。通過Western blotting 法對p65、p-p65、IκBα、p-IκBα、β-actin 進行檢測。

1.2.9 GGC 對IL-6、TNF-α的mRNA 表達的影響

按1.2.5 方法接種細胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預給藥4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細胞后用Trizol 提取得到RNA，紫外分光檢測RNA 濃度用于后續(xù)實驗。按反轉錄試劑盒說明得到cDNA。最后擴增cDNA。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列表Table 1 Sequences of primers

1.2.10 GGC 對ROS 產生的影響

收集細胞沉淀，稀釋細胞使密度為3×105cells/mL，各取2 mL 細胞懸液加入6 孔板中過夜使其完全貼壁。分為對照組、模型組、加藥組。加藥組加入GGC（10、20、400 μg/mL）預給藥4 h，加LPS（1 μg/mL）孵育24 h。24 h 后，用探針DCFH2-DA（1 μg/mL）孵育40 min。吸凈上清，各孔用冷的PBS 清洗2 遍，各孔加入100 μL胰蛋白酶消化2 min，之后用500 μL 完全培養(yǎng)基停止消化，收集細胞，通過流式細胞儀檢測ROS 含量。

1.2.11 GGC 對Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響

按1.2.5 方法接種細胞。加藥組加入GGC（10、20、40 μg/mL）預處理4 h，然后加入LPS（1 μg/mL）孵育24 h，吸凈上清，裂解細胞后分離得到總蛋白，用BCA 試劑盒測定各組蛋白濃度，通過標準曲線計算蛋白上樣量用于后續(xù)實驗。通過Western blotting 法對Nrf2、HO-1 進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)通過GraphPad Prism 8.0 進行統(tǒng)計學分析，組間比較通過單因素方差分析的方法進行，p＜0.05 認為有顯著性差異，p＞0.05 則無顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 FGC、GGC 以及FGJ 對RAW264.7 細胞活性的影響

使用CCK8 試劑盒檢測FGC、GGC 以及FGJ 對細胞活力的作用效果，各組分別加入濃度為10、20、40 μg/mL 的FGC、GGC 以及FGJ 作用24 h（圖1），檢測該濃度范圍內的細胞存活率，結果顯示各組細胞的存活率均與對照組基本一致，對細胞沒有明顯的毒性作用，且表現(xiàn)出一定的促增殖作用。各組之間沒有顯著性差異（p＞0.05）。說明該濃度范圍內不會大幅度改變細胞的增殖，也說明后續(xù)實驗不會因細胞增殖受到影響。

2.2 FGC、GGC 以及FGJ 對LPS 誘導的RAW264.7 釋放NO 的影響

NO 是多種生物功能的重要中介物[15]，在炎癥細胞模型中，可以通過NO 釋放量減少來判斷炎癥反應是否得到改善[16]。由圖2 可知，模型組NO 產生量與對照組相比均有大幅的提升（p＜0.0001），已成功誘導炎癥模型；在FGC 實驗組內，在濃度為40 μg/mL 時與模型組相比出現(xiàn)顯著性差異（p＜0.05），其余兩組無顯著性差異（p＞0.05）。在FGJ 實驗組內，隨著多糖含量的增加，各濃度下NO 的釋放量均顯著降低，但當FGJ 濃度升高時，NO 的釋放量呈上升趨勢，無濃度依賴性。只有在GGC 實驗組內，隨著濃度的增加，各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，抑制率分別為15.55%、26.45%、38.46%，說明GGC 具有明顯的降低NO 分泌的作用。

2.3 FGC、GGC 以及FGJ 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞TNF-α、IL-6 炎癥因子釋放的影響

IL-6 作為一種重要的炎癥介質，可以通過其促炎作用誘發(fā)各種炎癥反應[17,18]。從圖3 中可知，模型組與對照組的 IL-6 產生量相比存在顯著性差異（p＜0.0001），已成功構建炎癥模型；在FGC、FGJ實驗組內，加藥組IL-6 的分泌量與模型組相比均無顯著性差異（p＞0.05），表明對IL-6 的分泌無抑制效果。而在GGC 實驗組內，隨著多糖濃度的增加，各濃度下IL-6 的釋放量均顯著減少，抑制率分別為23.78%、39.00%、55.87%，說明GGC 具有明顯的降低IL-6 分泌的作用。

在與炎癥相關的多種疾病中，TNF-α水平過高能引發(fā)巨噬細胞浸潤、釋放多種炎癥因子、引起氧化應激[19]。從圖4 中可以看出，各實驗組內LPS 誘導RAW264.7 細胞分泌TNF-α的結果與誘導分泌IL-6 的結果一致，均只在GGC 實驗組內，隨著多糖濃度的增加，各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，抑制率分別為28.44%、46.69%、52.90%，說明GGC 具有明顯的降低TNF-α分泌的作用。

本文中所用粉葛與葛根粗多糖針對其特征本課題組已發(fā)表一項專利[20]，證明多糖的質量百分含量在70%以上，小分子化合物的質量百分含量為0.0005%～2.0%，剩余為淀粉、水分、灰分等物質。且本研究已表明粉葛粗多糖無抗炎活性，因此認為葛根粗多糖中作為主要成分的多糖在發(fā)揮抗炎作用，其發(fā)揮作用的機制將繼續(xù)深入研究。

2.4 GGC 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞iNOS、COX-2 蛋白表達的影響

iNOS 在受到炎癥刺激時，會產生過量的NO 與超氧陰離子，超氧陰離子與NO 反應會產生有害的氧化劑損傷機體，導致各種炎癥發(fā)生[21]。COX 有COX-1、COX-2、COX-3 共3 種，其中COX-2 為誘導酶，是可以催化炎癥介質的關鍵酶[22]。從圖5 中可知，在LPS作用后，顯著提高了iNOS、COX-2 蛋白的表達量，已成功誘導炎癥模型。與模型組比較，不同濃度GGC抑制iNOS、COX-2 的表達，對COX-2 蛋白的抑制率分別為43.50%、77.46%、95.05%，對iNOS 蛋白的抑制率分別為44.37%、28.68%、29.28%，與2.2 的研究結果基本一致。說明GGC 能夠降低iNOS、COX-2蛋白的表達。

2.5 GGC 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞中NF-κB 信號通路的影響

轉錄因子NF-κB 是調節(jié)參與不同炎癥反應過程的多種基因的關鍵因子之一，它通過一系列炎癥細胞因子和趨化因子的mRNA 表達控制最終免疫反應[23]，從圖6 中知，LPS 作用后，顯著提高p-p65、p-IκBα蛋白的表達量，不同濃度的GGC 對p-p65 蛋白的抑制率分別為31.22%、62.67%、27.18%，對p-IκBα蛋白的抑制率分別為11.98%、16.37%、28.45%。說明GGC能降低NF-κB 信號通路磷酸化蛋白的水平，而且能夠抑制IκBα的降解，證明GGC 是通過作用于NF-κB 信號通路來發(fā)揮抗炎的作用。

2.6 GGC 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞中IL-6、TNF-α的mRNA 表達的影響

如圖7 所示，與模型組相比，細胞中TNF-α、IL-6 mRNA 的表達呈降低趨勢（p＜0.01），各濃度下NO 的釋放量與模型組相比均顯著減少，IL-6 抑制率分別為39.37%、52.60%、57.70%，TNF-α抑制率分別為72.94%、73.65%、81.68%。與2.3 的研究結果一致，說明GGC 具有明顯的降低IL-6、TNF-α的mRNA 表達的作用。

2.7 GGC 對LPS 誘導的RAW264.7細胞Nrf2、HO-1 蛋白表達的影響

HO-1 是Nrf2 下游基因，氧化應激狀態(tài)下Nrf2 被激活進入核后將啟動HO-1 轉錄表達而催化降解血紅素、一氧化碳等，抑制氧化應激損傷[24]。Keap1-Nrf2 -ARE可以分為兩部分，一部分在細胞質，一部分在細胞核。通常情況下Keap1 與Nrf2 在細胞質中結合，這時是處于未激活狀態(tài)，如果一直未激活，Nrf2 會被降解；如果受到某種刺激，Keap1-Nrf2 的結合就不穩(wěn)定，Nrf2 被釋放出來，被轉移到細胞核，并與ARE 結合，激活下游基因的轉錄，進而翻譯出一系列相關蛋白，發(fā)揮生理功能。氧化應激是炎癥反應的一個組成部分，體內氧化與抗氧化作用失衡，傾向于氧化，導致中性粒細胞炎性浸潤，蛋白酶分泌增加，產生大量氧化中間產物，這些中間產物如白三烯(LT)、血栓素A2（TXA2）等都是促炎介質。從圖8 中可知，1 μg/mL 的LPS 作用后，Nrf2、HO-1 蛋白表達量減少，已構建炎癥模型。與模型組比較，GGC 促進Nrf2、HO-1 蛋白的表達，說明GGC 通過Nrf2/HO-1 通路發(fā)揮抗炎作用。

2.8 GGC 對LPS 誘導的RAW264.7 細胞釋放ROS 的影響

Nrf2 是一種轉錄因子，能協(xié)調大量細胞保護基因的基礎和應激誘導激活，它可以調節(jié)下游的抗氧化還原酶等蛋白的活性來調節(jié)機體內ROS 的失衡，防止ROS 在機體內累積，抑制機體氧化應激[25]。從圖9 中可知，通過流式細胞分析，對照組ROS 的釋放量低，用1 μg/mL 的LPS 作用后，ROS 釋放量顯著提高，已構建炎癥模型。GGC 均可抑制ROS 的增加，抑制率分別為37.29%、41.05%、54.09%，說明GGC 能夠減少細胞內ROS 的產生，與2.7 的研究結果基本一致，說明GGC 有明顯的抗炎作用。

多糖的抗炎作用作為其多種藥理活性之一，眾多學者已經通過體外和體內實驗對多糖的抗炎效果進行了評價。體外炎癥主要采用LPS 誘導的RAW264.7 細胞建立模型，動物實驗大部分集中于潰瘍性結腸炎模型。研究表明，多糖可以從抗氧化應激、調節(jié)細胞因子分泌、調控中性粒細胞、改善腸道菌群和腸黏膜屏障等方面發(fā)揮抗炎作用。

正北芪多糖[26]可顯著提高UC 小鼠結腸組織的抗氧化能力，升高模型小鼠體內SOD 活力，降低NOS、MDA 和NO 水平，緩解UC 的炎癥；枸杞多糖[27]可顯著降低細胞上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6 的含量；黃芪多糖[28]可通過改善巨噬細胞形態(tài)，恢復巨噬細胞增殖能力，從而改善腸黏膜的損傷及抑制腸道炎癥反應；木棗多糖[29]通過增加小鼠糞便中SCFAs 的濃度以及雙歧桿菌、擬桿菌、乳酸桿菌等益生菌菌群的數(shù)量來發(fā)揮抗炎抑菌的作用。

本文通過研究葛根多糖下調NF-κB 中相關蛋白的磷酸化水平與上調Nrf2/HO-1 蛋白的表達量，調控炎癥因子基因轉錄，降低促炎因子分泌以及降低蛋白iNOS 和COX-2 的表達量從而發(fā)揮治療炎癥的作用，與之前的研究結果相互印證。但是，多糖的抗炎機制往往是通過多途徑、多靶點等方式來實現(xiàn)，與機體免疫調節(jié)和腸道菌群方面密不可分。因此，進一步研究揭示葛根多糖在治療潰瘍性結腸炎結腸炎及調節(jié)腸道菌群方面的作用機制具有十分重要的意義。

3 結論

3.1 本研究以LPS所誘導的RAW264.7炎癥細胞模型來研究粉葛粗多糖（FGC）、葛根粗多糖（GGC）以及粉葛均一多糖（FGJ）對細胞炎癥反應的作用。由結果可知，F(xiàn)GC、FGJ不能抑制模型組中NO及TNF-α、IL-6 的產生，而GGC 具有與之相反的效果，在濃度為10～40 μg/mL 的濃度范圍內，可以有效的抑制炎癥的發(fā)生。從作用機制來看，GGC 能夠有效的抑制iNOS和COX-2 的表達，且能降低NF-кB 磷酸化蛋白的表達水平，提高Nrf2、HO-1 蛋白的表達水平，降低ROS的產生，并對TNF-α、IL-6 的mRNA 表達有抑制作用。

3.2 本文在前期完成了對粉葛均一多糖與粉葛粗多糖的抗炎活性研究，發(fā)現(xiàn)純化后的多糖并未表現(xiàn)出更好的抗炎活性，因此首先對葛根粗多糖的活性進行研究，證明其有抗炎活性后下一步將對其進行純化并研究其活性及作用機制。