谷糠多酚對酒精性胃黏膜損傷的保護(hù)作用

剌曉琴，劉一志，張立超，李漢卿,*，李卓玉

（1.山西大學(xué)生物醫(yī)學(xué)研究院，山西 太原 030006；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 太原 030006；3.山西大學(xué)生物技術(shù)研究所，山西 太原 030006）

隨著生活水平的不斷提高，全球?qū)凭南M(fèi)日益增加。然而，過量或長期飲酒會影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、心臟及胃腸等全身多處重要組織器官的正常結(jié)構(gòu)和功能，其中胃黏膜損傷便是飲酒導(dǎo)致的最直接的組織損傷。胃黏膜是胃組織中一道由上皮層、固有層及黏膜肌層構(gòu)成的屏障保護(hù)層，其中由胃黏膜上皮細(xì)胞構(gòu)成的上皮層完整性對于維持胃黏膜屏障以減輕乙醇（酒精）等外來攻擊因子對胃組織的破壞具有重要作用。研究表明，酒精的這種破壞作用主要是其進(jìn)入胃黏膜上皮細(xì)胞后促使細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆的生長抑制作用，甚至凋亡。若不及時(shí)對酒精的這種破壞作用進(jìn)行干預(yù)，正常胃黏膜組織就會由淺表性胃炎發(fā)展為胃潰瘍或胃糜爛，最終甚至形成癌變，嚴(yán)重威脅人體健康，同時(shí)也給全球經(jīng)濟(jì)、醫(yī)療帶來極大的負(fù)擔(dān)。目前對于胃黏膜損傷的臨床治療藥物主要有鋁制劑以及鉍劑等，它們可以在細(xì)胞表面形成保護(hù)層，阻止胃酸、胃蛋白酶對其進(jìn)行進(jìn)一步的損傷，但并不具備幫助受損組織修復(fù)的功能。因此，研究和開發(fā)天然資源中具備養(yǎng)胃、護(hù)胃功效的營養(yǎng)成分，對于降低飲酒導(dǎo)致的胃部相關(guān)疾病的發(fā)病率具有重要意義。

谷子（）又稱粟、小米，屬一年生禾本科植物，是山西地區(qū)的主要農(nóng)作物之一，營養(yǎng)價(jià)值豐富。谷子脫下來的皮殼稱谷糠，《黃帝內(nèi)經(jīng)》認(rèn)為谷糠“功同米而優(yōu)于米，補(bǔ)而不滯，溫而不燥”，對于脾胃具有諸多益處?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，以全谷物為主要原料的面食或發(fā)酵醋中摻入谷糠后，具有明顯的健胃功效，表明谷糠中可能含有健胃、護(hù)胃的功能成分，但目前對其具體發(fā)揮作用的成分、機(jī)制尚不清楚。植物多酚是存在于植物體內(nèi)的一種復(fù)雜的次生代謝產(chǎn)物，是以苯環(huán)的多羥基取代為特征的一類植物化學(xué)物質(zhì)的總稱。大量研究表明，植物多酚對胃黏膜具有重要的保護(hù)和修復(fù)作用，可以預(yù)防酒精對人胃黏膜上皮細(xì)胞株以及大鼠胃黏膜的損害。同時(shí)，植物多酚能夠通過減少活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成、抑制脂質(zhì)過氧化等作用緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡。近年來，國內(nèi)外學(xué)者對谷子中的多酚類化合物進(jìn)行了鑒定，發(fā)現(xiàn)谷子中富含多酚，且主要富集于谷子的皮殼——谷糠。因此推測，谷糠多酚很有可能具有養(yǎng)胃、護(hù)胃功能，而且主要是通過清除ROS來發(fā)揮功能。

本課題組前期從谷糠中提取并鑒定了谷糠內(nèi)殼結(jié)合態(tài)多酚類物質(zhì)（bound polyphenol of inner shell，BPIS）。本研究通過連續(xù)3 周對Wistar大鼠灌胃BPIS進(jìn)行干預(yù)，采用BPIS干預(yù)結(jié)束后灌胃75%（體積分?jǐn)?shù)，下同）乙醇溶液（劑量為10 mL/kg）構(gòu)建急性胃黏膜損傷模型，分析BPIS對胃黏膜損傷的預(yù)防作用，從組織形態(tài)及組織病理學(xué)水平分析胃黏膜損傷情況；同時(shí)采用1 000 mmol/L酒精處理人胃黏膜上皮細(xì)胞（GES-1）12 h的方式構(gòu)建酒精性GES-1細(xì)胞損傷模型，從細(xì)胞活力及形態(tài)方面觀察BPIS對GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用。最后以大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力、丙二醛（methane dicarboxylic aldehyde，MDA）、凋亡相關(guān)蛋白（Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白）相對表達(dá)水平及GES-1細(xì)胞中ROS水平為指標(biāo)，分析BPIS保護(hù)胃黏膜的分子機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)以谷糠多酚為試材，為改善酒精性胃黏膜損傷的研究提供參考，同時(shí)為開發(fā)具有養(yǎng)胃、護(hù)胃特性的功能食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

雄性Wistar大鼠由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，使用許可證號：SYXK（滬）2018-0027。

GES-1細(xì)胞購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

谷糠 山西省天下谷有限公司；將谷糠原材料破碎后過60 目篩，室溫下密封保存?zhèn)溆?。丙酮和乙酸乙酯（均為分析純?天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；青鏈霉素、福林-酚試劑、吐溫20、十二烷基硫酸鈉-聚凝膠電泳丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）試劑、抗熒光衰減封片劑索萊寶（北京）科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基中國BI公司；胎牛血清 中國四季青公司；免疫染色固定液、細(xì)胞裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；MDA和SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所；ROS測定試劑盒 江蘇凱基生物技術(shù)公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

二氧化碳培養(yǎng)箱 德國Eppendorf公司；倒置熒光顯微鏡 德國ZEISS公司；超純水機(jī) 四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司；精密電子天平 美國OHAUS儀器有限公司；恒溫箱 德國Memmert有限公司；低速離心機(jī)中國中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Delta Vision Elite活細(xì)胞工作站 美國General Electric公司。

1.3 方法

1.3.1 BPIS的提取制備與動(dòng)物分組

參考本課題組前期提取方法制得BPIS凍干粉。將BPIS凍干粉用一定體積的蒸餾水溶解后，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用福林-酚法檢測溶解后的樣品中多酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（2.6±0.4）%。

本課題組前期利用AOM/DSS構(gòu)建C57BL/6J結(jié)腸癌小鼠模型，同時(shí)通過隔天灌胃150 mg/kg谷糠多酚進(jìn)行干預(yù)，3個(gè)月后發(fā)現(xiàn)裸鼠腫瘤的質(zhì)量明顯降低，存活率明顯增加，且該劑量對裸鼠主要臟器心、肝、脾、肺、腎、胰腺?zèng)]有明顯的毒副作用。因此本研究中選用的劑量（每天灌胃50 mg/kgBPIS）是安全可行的。

30 只雄性Wistar大鼠（體質(zhì)量200～250 g）在相對濕度50%～60%、溫度23～25 ℃的動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，給予正常飲食。1 周后，將大鼠隨機(jī)分為對照組、模型組、BPIS干預(yù)組，每組10 只。每日上午9時(shí)進(jìn)行灌胃處理，其中對照組與模型組大鼠給予生理鹽水（1 mL/100 g），BPIS干預(yù)組給予50 mg/kg的BPIS，持續(xù)3 周。每隔1 d記錄各組Wistar大鼠體質(zhì)量，每隔4 d記錄大鼠攝食量。灌胃最后一天晚上大鼠禁食不禁水。次日早晨模型組與BPIS干預(yù)組均灌胃75%酒精（劑量為10 mL/kg），對照組給予相同劑量的生理鹽水。4 h后，采用10%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉后脫頸處死大鼠。將大鼠開腹取胃，沿胃大彎剪開，用預(yù)冷的生理鹽水將胃黏膜內(nèi)容物清洗干凈后用濾紙吸干，將胃內(nèi)壁翻出觀察胃黏膜的損傷情況并拍照記錄，然后將胃黏膜組織置于-80 ℃冷凍保存待用。

1.3.2 大鼠胃黏膜損傷指數(shù)測定

參考文獻(xiàn)[23]測定大鼠的胃黏膜損傷指數(shù)。利用電子卡尺測量大鼠胃黏膜損傷部位，按照文獻(xiàn)[23]對條狀損傷與片狀損傷進(jìn)行評分后計(jì)算每只大鼠的胃黏膜損傷指數(shù)（Guth標(biāo)準(zhǔn)）。

1.3.3 大鼠胃黏膜組織觀察

參考文獻(xiàn)[24]將各組大鼠胃黏膜組織用蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，置于倒置顯微鏡下觀察。以Mascuda標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算大鼠的胃黏膜病理學(xué)損傷指數(shù)，每一張石蠟切片的損傷累積評分不超過15 分。

1.3.4 GES-1細(xì)胞酒精損傷模型及BPIS干預(yù)模型的建立

GES-1細(xì)胞用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清與1%（體積分?jǐn)?shù)）青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基（即完全培養(yǎng)基）培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%（體積分?jǐn)?shù)）CO、37 ℃的培養(yǎng)箱。收集對數(shù)生長期的細(xì)胞，用1×胰蛋白酶溶液消化（25 cm培養(yǎng)瓶約加入0.5 mL胰蛋白酶溶液）后，加入等體積的完全培養(yǎng)基終止消化，800 r/min離心5 min后棄去上清液，用1 mL完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。用新鮮的完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/mL，按照每孔200 μL加入96 孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)12 h。待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含酒精（乙醇終濃度分別為0、100、200、400、800、1 000 mmol/L）的完全培養(yǎng)基，分別作用于GES-1細(xì)胞6、12 h后，吸棄培養(yǎng)液。參考文獻(xiàn)[21]采用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法測定細(xì)胞存活率。

按照上述方法利用含BPIS（終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、15、20 μg/mL）的完全培養(yǎng)基孵育GES-1細(xì)胞24、48、72 h，利用MTT法測定細(xì)胞存活率。

按照上述方法利用含BPIS（終質(zhì)量濃度分別為0、1、5、10、15 μg/mL）的完全培養(yǎng)基孵育GES-1細(xì)胞24 h，然后棄去培養(yǎng)液，加入含酒精（終濃度1 000 mmol/L）的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h，對照組添加等體積分完全培養(yǎng)基。處理結(jié)束后采用MTT法測定細(xì)胞存活率，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 GES-1細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的測定

將對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞按照500 μL/孔接種于24 孔板（細(xì)胞濃度為1×10個(gè)/孔）。BPIS干預(yù)組按照1.3.4節(jié)方法用500 μL含15 μg/mL BPIS的完全培養(yǎng)基孵育24 h后，吸棄培養(yǎng)液后，再加入500 μL酒精濃度為的1 000 mmol/L的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育12 h。對照組均添加等體積的完全培養(yǎng)基，模型組以等體積的完全培養(yǎng)基替代含15 μg/mL BPIS的完全培養(yǎng)基。孵育結(jié)束后吸棄培養(yǎng)液，每孔分別加入500 μL 5 μmol/L活性氧熒光探針2,7-二氯二氫熒光素-乙酰乙酸酯（2,7-dichlorodihydrofluor escein diacetate，DCFH-DA）試劑，37 ℃下共孵育進(jìn)行熒光探針裝載。按照ROS測定試劑盒說明書進(jìn)行制片觀察，利用Image J軟件計(jì)算DCFH-DA熒光強(qiáng)度以表征ROS水平。

1.3.6 GES-1細(xì)胞和大鼠胃黏膜組織生化指標(biāo)的測定

將對數(shù)生長期的GES-1細(xì)胞按照2 mL/孔接種于6 孔板，細(xì)胞濃度為4×10個(gè)/孔，按照1.3.5節(jié)方法處理細(xì)胞。收集各組處理結(jié)束后的細(xì)胞，加入適量1×磷酸緩沖液（pH 7.2）清洗，然后經(jīng)液氮反復(fù)凍融裂解細(xì)胞，12 000 r/min離心15 min收集上清液備用。相似的，將1.3.1節(jié)各組大鼠胃黏膜復(fù)溫后吸去水分，進(jìn)行研磨，用生理鹽水制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的組織勻漿液，3 000 r/min離心15 min，收集上清液備用。取上述樣品分別按照試劑盒說明書測定SOD活力及MDA含量。

1.3.7 蛋白相對表達(dá)量的測定

取1.3.6節(jié)中制備的上清液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn)[20]，采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測GES-1細(xì)胞及胃黏膜組織中調(diào)亡相關(guān)蛋白（Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白）相對表達(dá)量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

結(jié)果中的數(shù)據(jù)均為3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析，采用最小顯著差異檢驗(yàn)（least significant difference，LSD檢驗(yàn)）進(jìn)行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 BPIS對飼養(yǎng)過程中Wistar大鼠體質(zhì)量及攝食量的影響

隨著飼養(yǎng)時(shí)間的延長，各組別大鼠體質(zhì)量逐漸增加，但組間無顯著差異（＞0.05）（圖1A）；在各組別中，平均每只大鼠每日攝食量雖有所變化，但其數(shù)值上不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（＞0.05）（圖1B）。

圖1 BPIS對Wistar大鼠體質(zhì)量（A）及攝食量（B）的影響Fig. 1 Effect of foxtail millet bran polyphenols on body mass (A) and food intake (B) of Wistar rats

2.2 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷的影響

干預(yù)結(jié)束后，對照組大鼠的胃黏膜組織顏色淡紅，表面光滑有彈性，褶皺完整且走向規(guī)則（圖2A）；與對照組相比，模型組大鼠的胃黏膜出血嚴(yán)重，部分皺襞減少甚至消失（圖2B）；與模型組相比，BPIS干預(yù)組黏膜皺襞完整，出血性損傷明顯較少（圖2C）。參照Guth標(biāo)準(zhǔn)對胃黏膜損傷指數(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果顯示：對照組、模型組、BPIS干預(yù)組的胃黏膜損傷指數(shù)平均值分別為0、104.8、30.9（圖2D）。以上結(jié)果表明，BPIS明顯改善了酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷。

圖2 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃組織形態(tài)的影響Fig. 2 Effect of foxtail millet bran polyphenols on rat gastric morphology induced by ethanol in mice

2.3 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜損傷的組織病理學(xué)分析結(jié)果

Wistar大鼠胃部組織HE染色結(jié)果顯示：對照組大鼠胃黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，黏膜層、黏膜下層和肌肉層結(jié)構(gòu)完整、層次清晰，未見明顯水腫及炎癥細(xì)胞浸潤（圖3A）。模型組大鼠胃黏膜組織正常結(jié)構(gòu)消失，上皮細(xì)胞排列無序且大量死亡，有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，黏膜下層水腫，但損傷未累及黏膜肌層（圖3B）。與模型組相比，BPIS干預(yù)組的大鼠胃黏膜組織結(jié)構(gòu)完整，腺體細(xì)胞排列較為整齊，偶見細(xì)胞脫落，但黏膜下層沒有明顯的水腫，與正常的胃組織結(jié)構(gòu)較為接近（圖3C）。隨后利用Mascuda評分標(biāo)準(zhǔn)對各組胃黏膜損傷指數(shù)進(jìn)行評價(jià)，結(jié)果顯示：對照組，模型組，BPIS干預(yù)組的胃黏膜損傷指數(shù)平均值分別為0、8.8、2.0（圖3D）。以上結(jié)果進(jìn)一步表明提前攝入BPIS對酒精引起的胃黏膜損傷有明顯的預(yù)防作用。

圖3 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜組織病理學(xué)的影響Fig. 3 Effect of foxtail millet bran polyphenols on rat gastric mucosa histopathology induced by ethanol in mice

2.4 BPIS對酒精誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞活性的影響

首先通過MTT實(shí)驗(yàn)確定GES-1細(xì)胞的酒精造模濃度、時(shí)間及BPIS作用質(zhì)量濃度，如圖4A所示，當(dāng)1 000 mmol/L酒精作用12 h時(shí)，GES-1細(xì)胞存活率低于50%，故選用此條件作為細(xì)胞造模條件；隨后利用不同質(zhì)量濃度的BPIS分別孵育GES-1細(xì)胞24、48、72 h，發(fā)現(xiàn)BPIS在72 h內(nèi)對細(xì)胞沒有明顯的毒副作用（圖4B）。進(jìn)一步選擇1、5、10、15 μg/mL BPIS預(yù)處理細(xì)胞24 h后，1 000 mmol/L酒精繼續(xù)作用12 h，觀察BPIS對GES-1細(xì)胞活力的影響，結(jié)果表明，BPIS能夠明顯改善酒精引起的GES-1細(xì)胞存活率降低的現(xiàn)象且呈劑量依賴性（圖4C）。因此，選擇15 μg/mL BPIS孵育GES-1細(xì)胞24 h作為后續(xù)BPIS干預(yù)組的處理?xiàng)l件。

圖4 BPIS對酒精誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞存活率的影響Fig. 4 Effect of foxtail millet bran polyphenols on survival rate of gastric epithelial cells induced by ethanol

進(jìn)一步對GES-1細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，對照組細(xì)胞狀態(tài)良好，呈上皮細(xì)胞樣，結(jié)構(gòu)邊緣清晰，貼壁牢固（圖5A）；模型組細(xì)胞形態(tài)明顯變小變圓，部分細(xì)胞呈現(xiàn)漂浮狀態(tài)（圖5B）；BPIS干預(yù)組細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，趨于上皮細(xì)胞樣，基本完全貼壁（圖5C）。說明BPIS對酒精誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞有明顯的保護(hù)作用。

圖5 BPIS對酒精誘導(dǎo)的GES-1細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 5 Effect of foxtail millet bran polyphenols on morphology of gastric epithelial cells induced by ethanol

2.5 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

ROS包括氧自由基、羥自由基、HO等，細(xì)胞ROS水平是衡量細(xì)胞氧化程度的重要標(biāo)志。如圖6所示，GES-1細(xì)胞經(jīng)酒精處理后，細(xì)胞內(nèi)ROS水平極顯著升高（＜0.01），約為對照組的1.7 倍；與模型組相比，經(jīng)BPIS預(yù)處理的細(xì)胞ROS水平極顯著降低（＜0.01），表明BPIS能夠明顯緩解酒精引起的細(xì)胞氧化損傷程度。

圖6 BPIS對酒精誘導(dǎo)GES-1細(xì)胞ROS水平的影響Fig. 6 Effect of foxtail millet bran polyphenols on ROS level of gastric epithelial cells induced by ethanol

MDA是ROS在機(jī)體生物膜發(fā)生的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)物，其含量能夠反映脂質(zhì)過氧化的程度。SOD是與機(jī)體氧化應(yīng)激水平相關(guān)物質(zhì)，其活力能夠反映機(jī)體清除自由基的能力，是細(xì)胞抵抗氧化損傷的重要防線。如圖7A、B所示，與對照組相比，灌胃酒精后的模型組大鼠胃黏膜組織中MDA含量極顯著增加（＜0.01），SOD活力極顯著降低（＜0.01）；而與模型組相比，BPIS干預(yù)組大鼠胃黏膜中MDA含量極顯著降低（＜0.01），SOD活力極顯著增加（＜0.01）。如圖7C、D所示，與對照組相比，GES-1細(xì)胞經(jīng)酒精處理后，MDA含量極顯著升高（＜0.01），SOD活力極顯著下降（＜0.01）；與模型組相比，經(jīng)BPIS處理的GES-1細(xì)胞氧化應(yīng)激水平有所改善，MDA含量極顯著降低（＜0.01），SOD活力極顯著升高（＜0.01）。

圖7 BPIS對酒精誘導(dǎo)大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞的MDA含量和SOD活力的影響Fig. 7 Effect of foxtail millet bran polyphenols on MDA content and SOD activity of rat gastric mucosa and gastric epithelial cells induced by ethanol

2.6 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞中調(diào)亡相關(guān)蛋白的影響

如圖8所示，與對照組相比，模型組大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞中Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白相對表達(dá)水平明顯上調(diào)；與模型組相比，BPIS處理可以明顯抑制Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9蛋白的活化。

圖8 BPIS對酒精誘導(dǎo)的大鼠胃黏膜和GES-1細(xì)胞中Cleaved Caspase 3、Cleaved Caspase 8、Cleaved Caspase 9蛋白表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of foxtail millet bran polyphenols on cleaved caspase-3,cleaved caspase-8 and cleaved caspase-9 expression levels in rat gastric mucosa and gastric epithelial cells induced by ethanol

3 討 論

動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是研究酒精性胃黏膜損傷的常用方法，本研究采用了75%酒精灌胃雄性Wistar大鼠的方式構(gòu)建急性胃黏膜損傷模型，觀察BPIS連續(xù)灌胃3 周對大鼠胃黏膜損傷的預(yù)防作用，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠的胃黏膜出血嚴(yán)重，這與Zhang Jing、Chen Yi等的研究結(jié)果一致；與模型組相比，BPIS干預(yù)組黏膜皺襞完整，出血性損傷明顯較少，損傷指數(shù)均極顯著低于模型組（＜0.01），說明BPIS可以明顯改善酒精引起的胃黏膜出血、水腫和腺體受損等病理損傷情況。胃黏膜上皮細(xì)胞是酒精損傷的直接靶點(diǎn)，本研究利用1 000 mmol/L酒精處理GES-1細(xì)胞的方式構(gòu)建酒精性GES-1細(xì)胞損傷模型，以細(xì)胞活力與形態(tài)結(jié)構(gòu)變化作為指標(biāo)，檢測BPIS對GES-1細(xì)胞的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)BPIS能夠明顯改善酒精引起的GES-1細(xì)胞存活率降低的現(xiàn)象，同時(shí)能夠有效緩解酒精引起的GES-1細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化。ROS在胃黏膜損傷的發(fā)病機(jī)制中扮演著至關(guān)重要的角色。酒精的攝入可刺激ROS的大量產(chǎn)生，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化，進(jìn)而對胃黏膜造成嚴(yán)重的損傷；不飽和脂肪酸在生物膜系統(tǒng)中被ROS攻擊，并通過脂質(zhì)過氧化轉(zhuǎn)化為MDA，因此，MDA可以用來表征和量化脂質(zhì)過氧化；SOD是一種重要的胞內(nèi)酶抗氧化劑，是抵抗ROS的第一道防線，SOD可以保護(hù)細(xì)胞免受ROS的損傷。本研究發(fā)現(xiàn)酒精會大幅降低大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞中SOD活力，增加MDA水平，增加GES-1細(xì)胞中ROS水平；而BPIS處理可以極顯著增加大鼠胃黏膜組織和GES-1細(xì)胞SOD的活力（＜0.01），抑制MDA的產(chǎn)生。由此可知，谷糠多酚是谷子中發(fā)揮干預(yù)酒精性胃黏膜損傷的重要有效成分，其潛在機(jī)理在于能夠緩解酒精引起的ROS水平升高從而減輕GES-1細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

由于谷糠口感粗糙，在糧食精細(xì)加工的過程中往往被丟棄，目前谷糠主要用于畜禽飼料，產(chǎn)品附加值很低。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，谷糠雖僅占谷子質(zhì)量的5%～7%，卻集中了谷子中絕大部分的營養(yǎng)素。尤其是對人體健康有益的多酚類物質(zhì)主要富集于谷糠，占小米總酚酸的近70%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。谷子的主要食用部位——小米，由于富含糖類、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，傾向于為人類提供基本營養(yǎng)；而谷糠中的次級代謝產(chǎn)物則更傾向于發(fā)揮保健和醫(yī)藥功能。本課題組前期研究表明，谷糠多酚中包含12種主要活性成分，分別為阿魏酸、異阿魏酸、對-香豆酸、4-羥基苯甲酸、香草酸、丁香酸、二聚體阿魏酸衍生物、二聚體肉桂酸衍生物、葡萄糖基丁香酸、阿魏酸4----吡喃糖苷、香草酸4----吡喃糖苷和牡荊素，本實(shí)驗(yàn)并沒有分析BPIS中具有改善酒精性胃黏膜損傷的具體活性成分，因此后期可圍繞此問題展開相關(guān)研究。

綜上，谷糠多酚具有明顯改善酒精性胃黏膜損傷的作用，其潛在的作用機(jī)制是通過提高胃黏膜的抗氧化能力（包括提高SOD活力，降低MDA和ROS水平），增加胃黏膜上皮細(xì)胞的活性，抑制其凋亡，從而達(dá)到保護(hù)胃黏膜的作用。胃腸健康是衡量個(gè)體健康的主要指標(biāo)，本研究關(guān)于BPIS對酒精性胃黏膜損傷的保護(hù)作用機(jī)制還停留在較為基礎(chǔ)的研究階段，以后還需在現(xiàn)有基礎(chǔ)上繼續(xù)深入挖掘，以期為BPIS在保護(hù)胃腸健康、緩解酒精性胃黏膜損傷功能食品的開發(fā)應(yīng)用中提供更多的理論依據(jù)。