環(huán)境條件對Bacillus altitudinis LZP02生物膜形成的影響

黃東慧，鐘 鵬，王建麗，胡云龍，王志剛，*

(1.齊齊哈爾大學(xué) 生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)微生物制劑產(chǎn)業(yè)化技術(shù)創(chuàng)新中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005；4.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 草業(yè)研究所，黑龍江 哈爾濱 150086)

細菌生物膜是指細菌通過分泌胞外聚合物形成高度組織化、系統(tǒng)化的膜狀結(jié)構(gòu)，是細菌為適應(yīng)外界環(huán)境有利于存活的一種生命活動現(xiàn)象，其基質(zhì)由胞外多糖和蛋白質(zhì)組成，有助于黏附在根系表面。細菌生物膜形成主要分為黏附、積累、成熟、分散4個階段。細菌可以借助生物膜增強自身對環(huán)境中多種脅迫的抵抗能力，對于病原菌來說，生物膜形成可以增強其對抗生素的耐受性和宿主免疫系統(tǒng)攻擊抵抗能力。

細菌生物膜形成能力取決于營養(yǎng)(如二價陽離子)和環(huán)境條件(溫度、pH值、鹽脅迫)。較高濃度的Na或K顯著抑制了BF-17生物膜的形成，同時，Ca和Mn在低濃度時促進了其生物膜的形成，但在高濃度時表現(xiàn)出抑制作用。在不同溫度和pH值條件下，不同細菌的生物膜形成能力也不同。在對的研究中發(fā)現(xiàn)，ser.和的生物膜形成最適溫度分別為34.5 ℃和13.0 ℃。在32 ℃、pH值7.0時MS1生物膜形成能力最強，同時，Ca、Fe、K、Na促進其生物膜的形成，Cu、Mn抑制其生物膜的形成。

植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)具有促進植物生長和拮抗土傳病原菌的能力，其生物膜的形成可以保護植物根際免受土傳病菌的影響，促進植物生長。LZP02是一株從水稻根際分離出的有益菌，能夠定殖于根際，形成生物膜從而促進水稻生長。LZP02定殖于水稻根際時，會面臨復(fù)雜的土壤環(huán)境，如溫度、pH值、金屬離子等。因此，本研究主要研究環(huán)境條件對LZP02生物膜形成的影響，為進一步闡明LZP02對水稻的促生機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

LZP02菌株為本實驗室分離保存菌株。

LB培養(yǎng)基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，pH值7.0(固體培養(yǎng)基加瓊脂20.0 g)。

LBGM培養(yǎng)基(1 000 mL)：蛋白胨10.0 g，NaCl 8.0 g，酵母膏5.0 g，MnSO0.1 mmol·L，1%甘油，pH值7.0。

離子試劑：NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與培養(yǎng)

取-80 ℃保存的LZP02菌種在LB固體培養(yǎng)基上劃線，置于30 ℃培養(yǎng)24 h。將平板中的單菌落挑出，移入100 mL LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃、120 r·min振蕩培養(yǎng)12 h。

1.2.2 菌落形態(tài)與生物膜形成觀察

在4×電子顯微鏡下觀察LZP02在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d的菌落形態(tài)。移取1mL培養(yǎng)至=1.0的新鮮菌液，8 000×離心5 min，棄上清，用等體積LBGM培養(yǎng)基洗滌2次并重懸于等體積的LBGM培養(yǎng)基。采用96孔細胞培養(yǎng)板，每孔加200 μL液體，實驗組為190 μ LLBGM培養(yǎng)基加10 μL上述菌懸液，對照組加入200 μL LBGM培養(yǎng)基，每個樣品做3個重復(fù)。在四周培養(yǎng)孔加入無菌水作為保護層。置于30 ℃培養(yǎng)，觀察成膜情況。

1.2.3 生物膜形成定量分析

首先緩慢移除孔板中的培養(yǎng)液，然后用無菌水清洗2～3次，洗去未黏附的菌體，室溫干燥后加入體積質(zhì)量0.1%的結(jié)晶紫染液染色20 min，再用無菌水沖洗5次，室溫靜置干燥，除去多余水分，隨后加入丙酮-乙醇溶液(體積比80∶20)脫色15 min，混勻。最后用酶標儀測定在540 nm的吸光度，衡量生物膜的多少。

1.2.4 定殖分析

水稻種子用30% HO消毒30 min后，置于植物培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件：光周期16 h/8 h(L/D)，溫度28 ℃/18 ℃，相對濕度60%～70%。每3 d用無菌水澆灌1次，直至苗期。將培養(yǎng)至=1.0的LZP02培養(yǎng)液倒入無菌空平皿中。取長勢一致的水稻幼苗，用無菌水沖洗其根部，然后將幼苗放入LZP02培養(yǎng)液中孵育1 h。將處理過的水稻幼苗轉(zhuǎn)移到無菌MS液體培養(yǎng)基中，置于植物培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在第2天取長為1 cm的根系，分別在體積分數(shù)50%、60%、70%、80%、90%、100%的乙醇中脫水固定30 min。使用導(dǎo)電黏合劑將處理過的根黏附到樣品臺上，通過掃描電子顯微鏡觀察菌株在水稻根際的定殖。

1.2.5 環(huán)境因素對LZP02生物膜形成的影響

溫度：菌株按1.2.2節(jié)方法處理并分別置于25、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每個處理3個重復(fù)，按1.2.3節(jié)方法檢測所形成生物膜的。

pH值：將LBGM培養(yǎng)基pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10，按1.2.2節(jié)方法處理并置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，每個處理3個重復(fù)，按1.2.3節(jié)方法檢測所形成生物膜的。

金屬離子：在LBGM培養(yǎng)基中分別加入NaCl、KCl、Fe(SO)、FeSO、CaCO、MnSO、MgSO、CuSO、ZnSO。其中，Ca濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，F(xiàn)e濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，F(xiàn)e濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Mg濃度設(shè)置為0、1、2、3、4 mmol·L，K濃度設(shè)置為0、30、60、90、120、150 mmol·L，Na濃度設(shè)置為0、85、170、255、340 mmol·L，Mn濃度設(shè)置為0、1、2、3、4 mmol·L，Zn濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L，Cu濃度設(shè)置為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L。按1.2.2節(jié)方法處理并置于培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)48 h，每個處理做5個重復(fù)。按1.2.3節(jié)方法檢測所形成生物膜。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 22.0(IBM，Armonk，New York，USA)進行數(shù)據(jù)分析，使用Dunnett檢驗確定數(shù)值差異，<0.05表示具有統(tǒng)計學(xué)意義。用GraphPad Prism 6軟件對相關(guān)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 B. altitudinis LZP02生物膜的形成與根際定殖

在液-氣和固-氣表面可以觀察到LZP02的生物膜結(jié)構(gòu)。圖1-A為LZP02在LBGM液體培養(yǎng)基表面逐漸形成生物膜，再慢慢分散的過程，培養(yǎng)24 h后，在液體表面開始觀察到生物膜形成，此為生物膜形成的第一階段，細菌黏附于液體表面。隨后在36～72 h進入第二階段，細菌逐漸形成緊密的生物膜結(jié)構(gòu)。在84～96 h進入第三階段，出現(xiàn)復(fù)雜的生物膜結(jié)構(gòu)。在108 h后進入第四階段，生物膜結(jié)構(gòu)逐漸裂解。LZP02的菌落形態(tài)具有不同延展性的凸起褶皺結(jié)構(gòu)(圖1-B)，可以在水稻幼苗根際穩(wěn)定定殖(圖1-C)。

A，B. altitudinis LZP02生物膜形成的過程；B，B. altitudinis LZP02菌落形態(tài)；C，B. altitudinis LZP02定殖于水稻根際掃描電鏡圖。

2.2 溫度和pH值對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

溫度對LZP02生物膜形成的影響如圖2-A所示。由圖2-A可以看出，LZP02在25 ℃生物膜形成能力弱，其他溫度下均能形成生物膜。由圖2-B可以看出，在30 ℃，LZP02生物膜形成能力最強。由圖2-A和2-C可以看出，LZP02能夠在pH值為4～10時形成生物膜，pH值為3時沒有觀察到生物膜形成。由圖2-C可以看出，在pH值為7.0時，LZP02的生物膜形成能力最強。因此，在LBGM培養(yǎng)基中，LZP02生物膜形成最適溫度為30 ℃，最適pH值為7.0。

柱上無相同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同。

2.3 金屬離子對LZP02生物膜形成的影響

由圖3看出，金屬離子對LZP02生物膜形成有顯著影響。由圖4看出，0.5～1.5 mmol·LCa對LZP02生物膜形成沒有影響，而2.0 mmol·LCa對LZP02生物膜形成有抑制作用。

圖3 金屬離子對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

圖4 金屬離子對B. altitudinis LZP02生物膜形成的影響

0.5～2.0 mmol·LFe、0.5～2.0 mmol·LFe、1～4 mmol·LMg、30～150 mmol·LK、85～340 mmol·LNa抑制了LZP02生物膜的形成，表現(xiàn)為濃度越高，生物膜形成能力越弱。添加0.5～2.0 mmol·LZn和0.5～2.0 mmol·LCu，沒有觀察到生物膜結(jié)構(gòu)形成。1、4 mmol·LMn促進了LZP02生物膜的形成，而2、3 mmol·LMn對LZP02生物膜形成有抑制作用。

3 結(jié)論與討論

為了在競爭根系分泌的營養(yǎng)物質(zhì)時占優(yōu)勢，PGPRs首先要在植物根際穩(wěn)定存活，而PGPR能否在植物根際形成生物膜決定了其在植物根際的定殖能力。本研究發(fā)現(xiàn)，LZP02可以在液-氣和固-氣表面形成生物膜。在液-氣表面，24 h開始形成生物膜結(jié)構(gòu)，到48 h形成緊密的生物膜結(jié)構(gòu)。在固-氣表面，LZP02的菌落形態(tài)呈現(xiàn)出明顯的具有不同延展性的凸起的褶皺結(jié)構(gòu)。與液-氣和固-氣表面生物膜的形成一致，接種水稻根際2 d后，觀察到LZP02穩(wěn)定定殖于水稻根際。

sp.在低營養(yǎng)條件(1.0～1.5 g·L蛋白胨)下，生物膜形成最適溫度為30 ℃，最適pH值為6.0。HR10在37 ℃、pH值為7時其生物膜形成能力最強。本研究發(fā)現(xiàn)，LZP02在25～40 ℃均能形成生物膜，在30 ℃生物膜形成能力最強，在25 ℃生物膜形成能力最弱，說明低溫會抑制LZP02生物膜的形成。可能是因為低溫條件下，細菌的生長代謝速率下降。LZP02在pH值為7時生物膜形成能力最強，與文獻報道一致；生物膜結(jié)構(gòu)隨酸堿度而變化，酸性或堿性環(huán)境對細菌生物膜形成有顯著影響。LZP02在pH值為4～10時均能形成生物膜，表明LZP02對pH值的變化不敏感，為其在復(fù)雜的酸堿土壤環(huán)境中穩(wěn)定存活提供了良好的基礎(chǔ)。

金屬離子對不同細菌生物膜形成影響不同，枯草芽孢桿菌可以吸收金屬離子(Zn、Cu、Fe、Fe、Al)到生物膜基質(zhì)中，從而避免不同化學(xué)環(huán)境的侵蝕。NaCl通過滲透作用對生物膜形成產(chǎn)生負面影響，二價陽離子(Ca、Mg)對生物膜形成有促進作用，但高濃度Ca抑制其生長，原因可能是由于細菌生長的減少促使生物膜的形成，或者是高濃度二價陽離子的存在穩(wěn)定了生物膜中的胞外聚合物。也有研究表明，Ca、Mg提高了生物膜的黏附過程，進而促進生物膜形成。本研究中，K、Na對LZP02生物膜的形成表現(xiàn)出抑制作用，與前人研究結(jié)果一致；但是，Ca對LZP02生物膜形成沒有顯著影響，Mg甚至抑制LZP02生物膜的形成。細胞內(nèi)鐵濃度的增加可以促進SQR9生物膜基質(zhì)的產(chǎn)生。但本研究中，F(xiàn)e、Fe均抑制LZP02生物膜的形成，甚至在濃度為1.5～2.0 mmol·L時，沒有觀察到生物膜形成。Zn、Cu顯著抑制LZP02生物膜的形成，與文獻報道的高濃度的Zn、Cu影響細菌的生長相一致。Mn在4 mmol·L時促進了LZP02生物膜的形成，與文獻報道一致，Mn是部分生物膜培養(yǎng)基的組成部分，可以促進枯草芽孢桿菌生物膜的形成。

本研究表明，LZP02具有生物膜形成能力，其形成生物膜的最適培養(yǎng)條件為30 ℃、pH值7；LZP02對不同金屬離子的耐受性較低。