高效液相色譜法測定溫郁金藥材醋制前后5 種成分含量*

喬溪瑩，甕學(xué)智

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)附屬護(hù)國寺中醫(yī)醫(yī)院，北京 100035； 2.北京市豐臺(tái)區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100071）

溫郁金為姜科植物溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥塊根，具有活血止痛、行氣解郁功效，是中醫(yī)治療痛經(jīng)、乳房脹痛、胸腹刺痛的常用藥物［1］。溫郁金藥材中含有莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯等活性成分，可通過醋制、酒制等加工提純方式制成多種成品［2］。醋制是常用的加工炮制方式，會(huì)影響中藥成分含量［3］。目前，針對(duì)溫郁金藥材醋制前后有效成分含量的變化仍有爭議。因此，本研究中探討了溫郁金藥材醋制前后莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯5 種有效成分含量的變化情況，旨在明確該炮制方式對(duì)溫郁金藥材有效活性成分的影響，為后續(xù)溫郁金藥材的加工炮制及臨床應(yīng)用提供參考?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC ?20AT 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）；CP225D型分析天平（德國Sartorius公司，精度為十萬分之一）；KQ ?250E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FW100型萬能粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）；Millipore超純水處理系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.2 試藥

莪術(shù)二酮對(duì)照品（批號(hào)為111800 ?201302，含量99.8%），莪術(shù)醇對(duì)照品（批號(hào)為100185 ?201908，含量99.9%），吉馬酮對(duì)照品（批號(hào)為111665 ?201906，含量99.8%），β?欖香烯對(duì)照品（批號(hào)為100268 ?201903，含量99.4%），均購自中國食品藥品檢定研究院；莪術(shù)烯醇對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)為R21M9F61833，含量≥98%）；甲醇、乙腈均為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。溫郁金藥材樣品，2020 年2 月采集于浙江省溫州市的溫郁金種植示范基地，由北京市藥品檢定研究院中藥飲片檢驗(yàn)員杜小偉鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters Sunfire ?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）?0.5%冰醋酸水溶液（B），梯度 洗 脫（0～13 min 時(shí)42%A，13～20 min 時(shí)42%A→50%A，20～40 min 時(shí)50%A→80%A，40～42 min 時(shí)80%A→90%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：214 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

取莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯對(duì)照品各10 mg，精密稱定，置5 mL棕色容量瓶中，加甲醇充分溶解并定容，得質(zhì)量濃度分別為1.061，1.023，1.016，1.007，1.035 mg/mL 的單一對(duì)照品貯備液；分別吸取適量置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇定容，按2 倍稀釋法稀釋，獲得對(duì)應(yīng)的對(duì)照品溶液，加甲醇定容即得混合對(duì)照品溶液。取藥材樣品適量，制備溫郁金生片，以5∶1（m/V）比例混合溫郁金生片與米醋，密封2 h后蒸15 h，取出晾干并研磨成粉，取1 g（過40目篩），精密稱定，加入甲醇20 mL，密塞稱定質(zhì)量，超聲（功率200 W，頻率50 kHz）處理40 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

1.莪術(shù)烯醇 2.莪術(shù)二酮 3.莪術(shù)醇 4.吉馬酮 5.β ?欖香烯A.混合對(duì)照品溶液 B.供試品溶液圖1 高效液相色譜圖1.Curcumenol 2.Curdione 3.Curcumol 4.Germacrone 5.β ?elemeneA.Mixed reference solution B.Test solutionFig.1 HPLC chromatograms

系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。供試品溶液色譜中，在與混合對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有吸收峰，且分離度均大于1.5，基線分離良好；理論板數(shù)按莪術(shù)烯醇峰計(jì)應(yīng)大于3 000。詳見圖1。

線性關(guān)系考察：取2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，加甲醇稀釋，得莪術(shù)烯醇質(zhì)量濃度分別為31.830，15.915，7.957，3.979，1.989 μg/ mL，莪術(shù)二酮質(zhì)量濃度分別為204.60，102.30，51.15，25.58，12.79 μg/mL，莪術(shù)醇質(zhì)量濃度分別為30.480，15.240，7.620，3.810，1.905 μg/ mL，吉馬酮質(zhì)量濃度分別為100.700，50.350，25.180，12.590，6.294 μg/mL，β?欖香烯質(zhì)量濃度分別為103.500，51.750，25.880，12.940，6.469 μg/mL的系列混合對(duì)照品溶液。取適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以待測成分進(jìn)樣量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。

精密度試驗(yàn)：取醋制后飲片樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，平行測定6次，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明方法精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下供試品溶液，室溫下放置0，2，4，8，16，24 h時(shí)，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果見表1，表明供試品溶液室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表1 線性關(guān)系考察及精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Results of the linear relation，precision，stability and repeatability tests

重復(fù)性試驗(yàn)：取醋制后飲片樣品，按2.2 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算含量。結(jié)果見表1，表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取醋制后飲片樣品共6 份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入一定質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，再定容至20 mL，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of the recovery test（n=6）

2.4 樣品含量測定

取醋制前后的樣品粉末各1 g，分別按2.2 項(xiàng)下方法平行制備3 份供試品溶液，再按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，結(jié)果見表3?？梢姡字坪蟮娘嬈瑯悠分休g(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯的含量均較醋制前低。

表3 溫郁金藥材醋制前后的5種成分含量變化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

表3 溫郁金藥材醋制前后的5種成分含量變化（±s，μg/g，n=3）Tab.3 Content changes of five components in Curcuma wenyujin before and after processing with vinegar（±s，μg/g，n=3）

時(shí)間醋制前醋制后莪術(shù)烯醇0.055 1±0.000 7 0.045 8±0.001 1莪術(shù)二酮2.077 0±0.012 1.995 0±0.014莪術(shù)醇0.092 8±0.001 8 0.084 1±0.002 2吉馬酮0.615 4±0.001 4 0.586 0±0.002 1 β ?欖香烯0.433 1±0.002 1 0.405 7±0.001 5

3 討論

莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯是溫郁金中的主要有效成分，均為倍半萜類化合物，主要分布于揮發(fā)油成分中并可以發(fā)揮抗腫瘤、抗血栓、抗炎功效，5 種成分分離度均大于1.5，且5 種有效成分進(jìn)樣量與峰面積間均存在良好的線性關(guān)系。因此，本研究中選此5 種成分為溫郁金藥材醋制前后成分變化的檢測指標(biāo)。

吉馬酮、莪術(shù)醇等具有1，5 ?二烯結(jié)構(gòu)化合物若采用常用的氣相色譜法、氣相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用法檢測，在色譜柱高溫條件下會(huì)造成揮發(fā)油活性成分重排、轉(zhuǎn)化并產(chǎn)生數(shù)據(jù)偏差，影響數(shù)據(jù)的真實(shí)性與可參考價(jià)值［4］。HPLC 法是檢測有效成分的常用技術(shù)之一，具有準(zhǔn)確度高、檢測速度快等多項(xiàng)優(yōu)勢［5］。本研究結(jié)果顯示，采用HPLC法檢測溫郁金飲片中5種有效成分，其精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均較好，且具有較高的適用性。因此，本研究中選用HPLC 法檢測溫郁金藥材/ 飲片有效活性成分的變化情況。

酯類物質(zhì)是醋中的主要成分，酯類、醇類物質(zhì)在醋制加熱條件下與溫郁金藥材/飲片中的活性成分相互作用，進(jìn)而導(dǎo)致溫郁金中成分含量的升高或降低［6］。溫郁金藥材醋制前后的藥效功能各有所倚重，生溫郁金長于行氣解郁、清心涼血，醋制后主入肝經(jīng)，尤善于散瘀止痛。本研究中醋制后溫郁金飲片的莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯含量均降低，其中莪術(shù)二酮降低最顯著。童黃錦［7］的研究表明，溫郁金藥材醋制后能增強(qiáng)其對(duì)血小板聚集、疼痛因子、改善血液循環(huán)等藥效學(xué)指標(biāo)的調(diào)節(jié)控制作用。溫郁金藥材醋制前后β?欖香烯、吉馬酮等成分含量減少而其療效反而增強(qiáng)，其原因?yàn)橹兴幣谥萍庸ぜ拜o料會(huì)影響各成分在體內(nèi)的轉(zhuǎn)化過程，進(jìn)而導(dǎo)致藥效學(xué)存在差異，因此溫郁金藥材醋制后可增強(qiáng)散瘀止痛療效［8?10］。但本研究的結(jié)果與部分文獻(xiàn)結(jié)果存在一定差異，其原因可能是選取的溫郁金藥材產(chǎn)地不同，其受到土壤養(yǎng)分、水質(zhì)、光照等地域因素影響導(dǎo)致活性成分含量不同，因此醋制前后的成分變化情況存在差異，后續(xù)可針對(duì)不同產(chǎn)地的溫郁金醋制前后成分變化情況進(jìn)行深入研究。本研究中莪術(shù)烯醇、莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、吉馬酮、β?欖香烯含量降低，可能是由于加工工藝不完善，導(dǎo)致有效成分流失，后續(xù)應(yīng)將溫郁金藥材醋制工藝優(yōu)化作為重點(diǎn)發(fā)展方向之一。

綜上所述，本研究中建立的檢測溫郁金藥材醋制加工前后莪術(shù)二酮、莪術(shù)醇、莪術(shù)烯醇、吉馬酮、β?欖香烯含量變化的HPLC 法，具有檢測速度快、重復(fù)性良好和穩(wěn)定性高等優(yōu)勢，可對(duì)溫郁金藥材醋制加工進(jìn)行質(zhì)量控制。醋制是提升溫郁金飲片有效成分的良好方案，可作為溫郁金藥材產(chǎn)地規(guī)范化加工發(fā)展的參考方向，但應(yīng)進(jìn)一步優(yōu)化此工藝，同時(shí)避免加工過程中溫郁金飲片有效成分的流失。