正交試驗(yàn)優(yōu)選多花黃精酒制工藝*

林 漫，劉雅璇，李海剛，胡曬平，吳 柱△

（1.長沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，湖南 長沙 410219； 2.湖南師范大學(xué)藥學(xué)院，湖南 長沙 410081）

多花黃精Polygonatum cyrtonemaHua 為百合科黃精屬植物［1］，收載于2020年版《中國藥典（一部）》，其主要化學(xué)成分為多糖、甾體皂苷、生物堿和黃酮等［2］，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾、益腎、潤肺、降血糖、調(diào)血脂、抗衰老等功效［3］。生黃精食之有麻舌感，并對咽喉部有刺激作用，不能直接藥用，臨床應(yīng)用其炮制品。炮制后，其部分化學(xué)成分發(fā)生氧化與分解，咽喉刺激性成分含量減少，藥效隨之增強(qiáng)［4?5］。《本草綱目》記載，黃精“單服九蒸九曝食之，駐顏斷谷……補(bǔ)諸虛，止寒熱，填精髓”［6］。多花黃精的炮制，按炮制方法分主要有蒸制、燉制，按炮制輔料分主要有酒制、蜜制、黑豆制及多輔料制［7?9］。黃精酒制后，可助其藥勢，使其滋而不膩，同時增強(qiáng)補(bǔ)脾、潤肺、益腎功效［10］。目前，鮮有對黃精酒制工藝的研究。本研究中采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選多花黃精的酒制工藝，為其規(guī)范化炮制提供參考。現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

AL240 型電子天平（梅特勒?托利多儀器＜上海＞有限公司）；HG ?4 型熱風(fēng)循環(huán)烘箱（中南制藥機(jī)械廠）；754型紫外?可見分光光度計(jì)（上海光譜儀器有限公司）；YRE ?52C 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；AS 型系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽斯儀器有限公司）。

1.2 試藥

D?無水葡萄糖對照品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20180506，含量＞99%）；黃酒（紹興女兒紅釀酒有限公司，批號20180125）；蒽酮（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20190305），其余試劑均為分析純，水為重蒸水。多花黃精藥材（湖南銀鴻農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，批號20191202），產(chǎn)自湖南安化，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院潘清平教授鑒定為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 酒黃精制備

采用“九蒸九烘”炮制工藝。取凈多花黃精100 g、黃酒20 g，精密稱定，將多花黃精與黃酒2 g 拌勻，并燜潤至黃酒吸盡，置蒸籠中，密閉，隔水加熱，一定時間后取出烘干，重復(fù)燜、蒸、烘8 次，第9 次將剩余黃酒及回收的黃精汁液一起拌入，重復(fù)燜、蒸、烘，切2～4 mm 厚片，烘干，得酒黃精炮制品。

2.2 浸出物測定

采用2020年版《中國藥典（四部）》（通則2201）醇溶性浸出物測定法項(xiàng)下的熱浸法測定，以稀乙醇為溶劑［11］。

2.3 多糖含量測定

2.3.1 檢測波長選擇

取對照品溶液適量，進(jìn)行全光譜掃描，結(jié)果多糖在582 nm 波長處的吸光度（OD）值最大，故選擇檢測波長582 nm。

2.3.2 溶液制備

取于105 ℃干燥至恒重的D?無水葡萄糖對照品16.5 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得每1 mL 含0.33 mgD?無水葡萄糖的對照品溶液。取于60 ℃干燥至恒重的酒制黃精細(xì)粉0.25 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加80%乙醇150 mL，水浴回流1 h，趁熱濾過；殘?jiān)脽岬?0%乙醇溶液洗3 次，每次10 mL。殘?jiān)蜑V紙置燒瓶，加水150 mL，水浴回流1 h，趁熱濾過；燒瓶和殘?jiān)脽崴礈?次，每次10 mL，濾過，合并濾液，冷卻后置250 mL容量瓶中，加水定容，搖勻［12］，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密量取對照品溶液0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL，置10 mL 具塞試管中，分別加水至2.0 mL，搖勻，在冰水浴中緩慢加入0.2%蒽酮?硫酸溶液定容，搖勻，冷卻。在沸水浴中放置10 min，取出，立即放入冰水浴中冷卻10 min，取出，以0.2%蒽酮?硫酸溶液作為空白對照。采用紫外?可見分光光度法測定582 nm 波長處的OD值［13］。以O(shè)D值（Y）為縱坐標(biāo)、葡萄糖的質(zhì)量濃度（X，mg/ mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y= 2.258 6X+ 0.010 9（R2= 0.999 8，n=6）。結(jié)果表明，葡萄糖質(zhì)量濃度在3.30～19.80 μg/mL范圍內(nèi)與OD值線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密量取同一對照品溶液1.0 mL，置10 mL具塞試管中，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法在1 d內(nèi)重復(fù)測定6次，以及連續(xù)5 d同一時間測定，得日內(nèi)精密度和日間精密度。結(jié)果日內(nèi)精密度的RSD為0.44%（n=6），日間精密度的RSD為1.02%（n= 5），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密量取供試品溶液1 mL，置10 mL試管中，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法，從“加水至2.0 mL”開始，在室溫下分別于0，20，40，60，80 和100 min 時測定OD值。結(jié)果的RSD為0.99%（n= 6），表明供試品溶液在室溫下放置100 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：精確稱取同一批樣品粉末，共6份，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法測定OD值。結(jié)果的RSD為3.11%（n= 6），表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量樣品適量，精密稱定，共6 份，分別精密加入D?無水葡萄糖對照品適量，按2.3.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法測定OD值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果平均加樣回收率為97.45%，RSD為3.12%（n=6）。

2.4 黃精性狀評分及綜合評分方法

參照2020年版《中國藥典（一部）》黃精性狀項(xiàng)下規(guī)定［11］，黑色有光澤計(jì)40分，棕黑色有光澤計(jì)30分，棕色略有光澤計(jì)20 分，黃色無光澤計(jì)10 分；味甜無刺激性計(jì)20分，微甜無刺激性計(jì)15分，微甜有刺激性計(jì)10分；質(zhì)柔軟計(jì)40分，質(zhì)較柔軟計(jì)30分，質(zhì)稍軟計(jì)20分，質(zhì)較硬計(jì)10分。滿分100分，統(tǒng)計(jì)總分。綜合評分=30 ×（多糖含量÷5.61）+ 30 ×（醇浸物含量÷75.28）+ 40 ×（性狀評分÷100）。

2.5 單因素試驗(yàn)

蒸制時間：取藥材樣品100 g，共5份，按2.1項(xiàng)下酒黃精制備工藝操作，保持干燥溫度100 ℃、干燥時間2 h不變，分別蒸制0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，考察蒸制時間對酒黃精綜合評分的影響。結(jié)果見圖1 A?？梢姡糁茣r間為1.5或2.0 h時，綜合評分較高。

干燥溫度：保持蒸制時間、干燥時間均為2 h 不變，干燥溫度分別為40，60，80，100，120 ℃，考察干燥溫度對酒黃精綜合評分的影響。結(jié)果見圖1 B。可見，干燥溫度為40 ℃或80 ℃時，綜合評分較高。

A.蒸制時間 B.干燥溫度 C.干燥時間圖1 不同因素對綜合評分的影響A.Steaming time B.Drying temperature C.Drying timeFig.1 Influence of different factors on the comprehensive score

干燥時間：保持蒸制時間2 h、干燥溫度100 ℃不變，干燥時間分別為1，2，3，4，5 h，考察干燥時間對酒黃精綜合評分的影響。結(jié)果見圖1 C。可見，干燥時間為2 h或3 h時，綜合評分較高。

2.6 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)考察結(jié)果，以蒸制時間（A）、干燥溫度（B）及干燥時間（C）為考察因素，以酒黃精的多糖含量、醇浸物含量和性狀評分的綜合評分為評價指標(biāo)，進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。因素與水平見表1，試驗(yàn)結(jié)果見表2 和表3。由表3 可知，“九蒸九烘”酒制工藝影響因素的影響強(qiáng)度為A ＞B ＞C，且僅因素A對多花黃精酒制工藝有顯著影響（P＜0.05）。結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，確定最佳工藝為A2B3C1，即每次酒蒸制1.5 h，80 ℃下干燥2 h。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and their levels

表2 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of the L9（34）orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Tab.3 Results of ANOVA

2.7 驗(yàn)證試驗(yàn)

分別稱取3 份藥材樣品適量，按最佳工藝進(jìn)行酒制，進(jìn)行綜合評分。結(jié)果分別為98.14 分、96.54 分、97.33分，平均97.34分（n=3），表明該方法穩(wěn)定、可靠，合理可行。

3 討論

多花黃精通過酒制，減少多糖含量的同時增加了單糖含量，有效成分更易釋放，從而提高其藥效，同時部分化學(xué)成分發(fā)生氧化與分解，減少了咽喉刺激性成分，更有利于臨床應(yīng)用。本研究中采用綜合評分法評價酒黃精的質(zhì)量，選取的外觀性狀指標(biāo)可較直觀鑒別傳統(tǒng)飲片質(zhì)量，同時結(jié)合化學(xué)指標(biāo)定量，從而可更全面地對多花黃精質(zhì)量進(jìn)行判斷。

本研究結(jié)果顯示，各因素對炮制效果影響強(qiáng)度最大的為蒸制時間，且僅該指標(biāo)對結(jié)果有顯著影響，并結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際篩選出最佳酒制方案。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果表明，該酒制工藝穩(wěn)定，酒黃精質(zhì)量較高，可為規(guī)范多花黃精酒制工藝提供參考。