利用共振拉曼成像技術(shù)分析胡蘿卜與南瓜中的β-胡蘿卜素含量分布

申朝婷，劉賽余，張宇軒，吳楠楠，歐陽(yáng)順利,

(1. 內(nèi)蒙古科技大學(xué) 理學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2. 內(nèi)蒙古科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010；3. 內(nèi)蒙古科技大學(xué) 材料與冶金學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

胡蘿卜和南瓜是我們?nèi)粘Ｉ钪凶畛Ｒ姷氖卟?，它們含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，其中鈣、磷、胡蘿卜素及維生素C的含量均較高，尤其β-胡蘿卜素可作為食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑和醫(yī)藥制劑，具有抗氧化、抗癌和防治心血管疾病[1]等作用，是維護(hù)人體健康不可缺少的營(yíng)養(yǎng)素. β-胡蘿卜素是一種由9個(gè)共軛碳碳雙鍵組成的類胡蘿卜素，是一種抗氧化物. β-胡蘿卜素作為輔助捕獲光能，調(diào)節(jié)激發(fā)能的分配以及作為光保護(hù)劑使光合器官免受強(qiáng)光損傷的分子，在光合作用中起著重要作用[2]. 而且β-胡蘿卜素還具有解毒作用，食用富含β-胡蘿卜素中的食物可以防止身體接觸一種稱為自由基的破壞分子[3]，也可以防止老化和衰老引起的多種退化性疾病，因此在日常生活中β-胡蘿卜素的攝入量尤為關(guān)鍵.

近幾十年來，人們研究了β-胡蘿卜素在溫度、壓力、濃度以及在不同溶劑環(huán)境下的物理化學(xué)性質(zhì)，并已深入了解β-胡蘿卜素的光譜特性，我們?cè)诖嘶A(chǔ)上借助拉曼成像技術(shù)對(duì)β-胡蘿卜素在蔬菜中的分布情況進(jìn)行檢測(cè)分析，為蔬菜加工處理提供理論依據(jù)[1-3]. 拉曼光譜是基于光子激發(fā)振動(dòng)發(fā)生非彈性散射而建立起來的一種快速無損的光譜表征技術(shù)，能從分子水平獲得物質(zhì)的結(jié)構(gòu)及組成信息[4]. 所謂拉曼成像，就是在逐點(diǎn)采集樣品上一個(gè)區(qū)域內(nèi)拉曼光譜的基礎(chǔ)上，選取某些光譜特征，顯示其在每個(gè)采集點(diǎn)的強(qiáng)度，最后所形成的光譜特征圖像。利用這個(gè)技術(shù)可以直觀檢測(cè)和展現(xiàn)β-胡蘿卜素在蔬菜中的分布情況[5].

本文通過光譜成像的方式從空間分布的角度全面分析β-胡蘿卜素在胡蘿卜和南瓜中的分布. 其拉曼光譜主要為C=C鍵和C-C鍵伸縮振動(dòng)產(chǎn)生的，分別位于1 520 cm-1和1 150 cm-1處，此外還有CH3的面內(nèi)搖擺振動(dòng)產(chǎn)生的拉曼峰位于1 005 cm-1處. 通過采用激發(fā)波長(zhǎng)為532 nm的激光激發(fā)胡蘿卜與南瓜中β-胡蘿卜素，產(chǎn)生共振拉曼光譜的方式，對(duì)β-胡蘿卜素在胡蘿卜及南瓜中的分布進(jìn)行分析. 具體通過β-胡蘿卜素所產(chǎn)生的共振拉曼光譜進(jìn)行拉曼成像分析，得到β-胡蘿卜素在胡蘿卜的含量分布.

1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1 拉曼光譜

拉曼光譜，是一種散射光譜.當(dāng)光照射到物質(zhì)上發(fā)生彈性散射(99.999%)和非彈性散射(0.001%). 彈性散射(瑞利散射)的散射光是與激發(fā)光波長(zhǎng)相同，不會(huì)與物質(zhì)進(jìn)行能量交換. 非彈性散射的散射光的波長(zhǎng)會(huì)發(fā)生改變，光與物質(zhì)發(fā)生了能量交換. 發(fā)生非彈性散射時(shí)，入射光的電場(chǎng)導(dǎo)致分子的電子云畸變，電子躍遷至一個(gè)較高能量的“虛態(tài)”(不是分子的一個(gè)真實(shí)能級(jí)，壽命極短)，當(dāng)電子躍遷回能量能級(jí)分裂產(chǎn)生的基態(tài)時(shí)與原基態(tài)的能量差ΔE導(dǎo)致入射光子與入射光的波長(zhǎng)不同(如圖1所示).

圖1 拉曼散射(左)及瑞利散射(右)電子躍遷能級(jí)圖[5]

1.2 共振拉曼光譜技術(shù)

拉曼散射中，當(dāng)入射的激發(fā)光處在樣品電子吸收譜帶內(nèi)時(shí)，由于電子躍遷和分子振動(dòng)的耦合，這一分子的某個(gè)或幾個(gè)特征拉曼譜帶強(qiáng)度陡然增加[6,7]，這種現(xiàn)象稱為共振拉曼效應(yīng). Andreas通過對(duì)拉曼散射強(qiáng)度的研究，得到分子某一振動(dòng)的拉曼光譜強(qiáng)度與極化率成正比[8]：

(1)

式(1)中，αρ,σ為散射光張量的ρ和σ分量，(αρ,σ)mn為m向n躍遷的極化張量的第ρ和σ矩陣元. 當(dāng)入射光頻率ν0趨近于νγm時(shí)，強(qiáng)度Imn會(huì)大幅度增加. 實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果也證明，共振拉曼效應(yīng)可以使拉曼強(qiáng)度提高106倍，因而，應(yīng)用該技術(shù)探測(cè)研究蔬菜中生物分子是簡(jiǎn)單有效的[4]. β-胡蘿卜素主吸收帶的吸收光譜的躍遷主要是 π-π*躍遷，β-胡蘿卜素吸收光譜的譜帶在 350～580 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)有很寬的電子吸收帶[3]. 用激發(fā)波長(zhǎng)532 nm恰好落在吸收光譜范圍內(nèi)，因此能夠產(chǎn)生嚴(yán)格共振拉曼效應(yīng).

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 拉曼光譜儀

本次實(shí)驗(yàn)使用的拉曼光譜儀為英國(guó)Renishaw inVia顯微鏡共焦激光拉曼光譜儀. 拉曼光譜儀分為3個(gè)部分：光源、光路與探測(cè)器. 光源采用的是532 nm的激光器，樣品臺(tái)處使用的是50倍物鏡并且樣品放在自動(dòng)xyz三維平臺(tái)上，最小步長(zhǎng)為0.1 μm，三維平臺(tái)能夠?qū)崿F(xiàn)100 mm×70 mm的拉曼光譜成像. 探測(cè)器部分使用的CCD型號(hào)是Renishaw Centrus 1C4A78-1040×256，采用1800 |/mm光柵. 拉曼光譜儀配有成像功能，通過樣品臺(tái)的移動(dòng)實(shí)現(xiàn)逐點(diǎn)掃描，掃描過程中樣品臺(tái)的移動(dòng)是Snake模式，在最初一行正向掃描，在下一行逆向掃描，以此循環(huán)，最終完成掃描.

2.2 實(shí)驗(yàn)樣品

胡蘿卜與南瓜都購(gòu)買于當(dāng)?shù)爻校}卜直徑35 mm，被切為厚度大約1 cm的薄片，南瓜被切為長(zhǎng)度25 mm，寬度20 mm，厚度為1cm的薄片，用來進(jìn)行實(shí)驗(yàn). 實(shí)驗(yàn)中先將胡蘿卜和南瓜用去離子水洗凈后，進(jìn)行切片處理，直到讓掃描一面平滑為止. 然后測(cè)量胡蘿卜切片的直徑以用來更好的確定步長(zhǎng)，接著將切片直接放在激光拉曼光譜儀的載物臺(tái)上測(cè)量.

2.3 拉曼光譜測(cè)試條件

胡蘿卜曝光時(shí)間為0.2 s，南瓜曝光時(shí)間0.5 s，激光功率分別為為26.6 mW和53.2 mW.本實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)室內(nèi)溫度為25 ℃，使用的是Snake模式，胡蘿卜切片的掃描范圍是24 450 μm×22 800 μm的區(qū)域，南瓜切片的掃描范圍是18 000 μm×18 000 μm的區(qū)域，通過沿x和y軸收集區(qū)域之間的光譜，拉曼成像步長(zhǎng)為150 μm，獲得拉曼圖像. 胡蘿卜切片在本次實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行了26 569個(gè)點(diǎn)的拉曼光譜采集，南瓜切片進(jìn)行了14 400個(gè)點(diǎn)的拉曼光譜采集.

3 結(jié)果與討論

測(cè)量圖2所示的實(shí)物，得到胡蘿卜和南瓜切片在532 nm激光下的拉曼光譜圖. 如圖3所示，我們可以觀察到，1 000～1 600 cm-1為類胡蘿卜素的基頻拉曼峰[9]，胡蘿卜和南瓜的基頻拉曼峰值基本相同. 如圖4所示，1 522 cm-1屬于ν1(C=C)碳碳共軛雙鍵的伸縮振動(dòng)，1 155 cm-1屬于ν2(C-C)碳碳單鍵的伸縮振動(dòng)，1 009 cm-1屬于ν3(CH3)甲基的面內(nèi)搖擺振動(dòng)，而南瓜的拉曼光譜中，1 522 cm-1屬于ν1(C=C)碳碳共軛雙鍵的伸縮振動(dòng)，1 155 cm-1屬于ν2(C-C)碳碳單鍵的伸縮振動(dòng)，1 005 cm-1則屬于ν3(CH3)甲基的面內(nèi)搖擺振動(dòng).

胡蘿卜切片 南瓜切片

圖3 532 nm激光激發(fā)下測(cè)定的胡蘿卜和南瓜的拉曼光譜

圖4 β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)示意圖

我們將3個(gè)基頻峰ν1、ν2和ν3分別做拉曼成像分析，得到了圖5所示的通過軟件WiRE5.1繪制出來的圖形.

圖5 (a)、(c)、(e)為胡蘿卜和(b)、(d)、(f)為南瓜拉曼面掃圖像(其中強(qiáng)度拉曼成像： (a)、(b)為ν1(C=C)峰；(c)、(d)為ν2(C-C)峰；(e)、(f)為ν3(CH3)峰)

共振拉曼光譜的拉曼強(qiáng)度與樣品濃度關(guān)系，本文根據(jù)Gellermann等[10]研究濃度與拉曼峰強(qiáng)度關(guān)系得到下式：

I532～P532σ532N

(2)

其中I532為共振拉曼光譜強(qiáng)度，P532是532 nm激發(fā)激光的功率，N為β-胡蘿卜素的濃度，σ532為β-胡蘿卜素在532 nm波長(zhǎng)激發(fā)的共振拉曼散射截面. 從式(2)，顯然可以看出β-胡蘿卜素的濃度與拉曼峰強(qiáng)度成正比關(guān)系. 拉曼峰越強(qiáng)， 它的濃度越大[3].

如圖3實(shí)物，我們一般認(rèn)為顏色較淺的部位營(yíng)養(yǎng)成分低，而顏色較深的部位營(yíng)養(yǎng)成分高. 然而通過觀察圖5和式(2)可知，南瓜中果肉部分的β-胡蘿卜素的濃度較小，表皮部分β-胡蘿卜素濃度相對(duì)較大. 胡蘿卜的根芯中β-胡蘿卜素的濃度較小，而表皮層β-胡蘿卜素濃度相對(duì)較大，與肉眼所見不符. 由此可見，β-胡蘿卜素更多的分布在胡蘿卜和南瓜的表皮層. 因此，我們推測(cè)，富含β-胡蘿卜素的果蔬，β-胡蘿卜更多地分布在表皮層.

4 結(jié)論

用532 nm的激發(fā)光可以在體激發(fā)胡蘿卜和南瓜中β-胡蘿卜素的共振拉曼光譜，胡蘿卜的根芯含有的β-胡蘿卜素含量是非常少的，而表皮的β-胡蘿卜素含量相對(duì)較多，南瓜果肉部分的β-胡蘿卜素含量較少，表皮部分β-胡蘿卜素含量較多. 所以，我們認(rèn)為：胡蘿卜根芯的營(yíng)養(yǎng)沒有其他部分營(yíng)養(yǎng)成分高，南瓜的表皮部位營(yíng)養(yǎng)成分較其他部位高.