PLAG1與家畜脊椎數(shù)目體格形態(tài)相關(guān)性研究

文│劉紫雯 史曉淵 王天琦 王長(zhǎng)法*（聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院）

哺乳動(dòng)物的骨骼主要由中軸骨、附肢骨和帶骨3個(gè)部分組成，其中中軸骨又包括頭骨、脊柱、胸骨和肋骨。不同的骨骼形態(tài)大小功能各不相同，并且在胚胎發(fā)育早期，骨骼的形態(tài)、數(shù)目及功能屬性就已被確定，若此過(guò)程被擾亂則會(huì)導(dǎo)致骨骼發(fā)育障礙，造成先天性或后天性骨骼疾病。馬屬動(dòng)物多形性腺瘤1（Pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1）基因是一個(gè)鋅指蛋白編碼基因，含有3個(gè)外顯子，其所在的PLAG基因家族還有兩個(gè)成員：PLAGL1和PLAGL2，比對(duì)PLAG1、PLAGL1和PLAGL2三者所編碼產(chǎn)物的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)具有廣泛的相似性，但具有不同的表達(dá)時(shí)期、范圍、峰值等。在過(guò)去的研究中發(fā)現(xiàn)，PLAG1與各種腫瘤和青光眼的發(fā)病有關(guān)，但在最新的研究中發(fā)現(xiàn)，此基因還與脊椎動(dòng)物椎骨數(shù)量及體格形態(tài)有明顯的聯(lián)系。筆者闡述了PLAG1的研究進(jìn)展，以期為PLAG1在馬屬動(dòng)物分子育種研究中奠定基礎(chǔ)。

一、PLAG家族

1997年，Cas等在研究多形性腺瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)，在8q12處均有相同的斷裂點(diǎn)，經(jīng)熒光原位雜交等方法對(duì)其進(jìn)行深入分析，發(fā)現(xiàn)受染色體畸變影響的靶基因是PLAG1基因，它可編碼一種新的鋅指蛋白。目前研究結(jié)果認(rèn)為，t（3；8）染色體異位使位于3號(hào)染色體的β輔肌動(dòng)蛋白基因的啟動(dòng)子序列和位于8號(hào)染色體的PLAG1基因序列發(fā)生互換可能是導(dǎo)致PLAG1基因激活表達(dá)的主要原因。1998年Cas團(tuán)隊(duì)在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了更加深入的研究，再次證明了PLAG1是一種由于8q12染色體畸變，因?yàn)閱?dòng)子序列的替換而被激活的蛋白質(zhì)編碼基因。通過(guò)分離、鑒定、比較兩個(gè)新的編碼C2H2鋅指蛋白的DNA序列，發(fā)現(xiàn)了PLAG基因家族的另外兩個(gè)成員：PLAGL1和PLAGL2。并且這兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的PLAG家族成員編碼的蛋白質(zhì)，其一級(jí)結(jié)構(gòu)在氨基酸末端鋅指區(qū)，特別是在PLAG1和PLAGL2的最后30個(gè)氨基酸之間，顯示出很高的序列一致性。后來(lái)發(fā)現(xiàn)，PLAG家族的3個(gè)成員之間，N端的DNA結(jié)合域具有高度同源性，PLAG1和PLAGL1之間的同源性為73%，PLAG1和PLAGL2之間為79%，但C端的反式激活功能域同源性很低，PLAG1的C端與PLAGL1的同源性?xún)H為19%，與PLAGL2的同源性為35%。PLAGL1位于染色體6q24-25上的一個(gè)印跡區(qū)，與PLAG1的多向致癌潛能不同，它是一種抑癌基因。與PLAGL1相比，PLAGL2不僅在結(jié)構(gòu)上，在功能上與PLAG1也有更密切的聯(lián)系。PLAGL1的羧基末端在上皮細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞中表現(xiàn)出較強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄活性，但PLAG1和PLAGL2在間充質(zhì)細(xì)胞中只有在抑制區(qū)耗盡后才能激活。Declercq等研究PLAG基因家族如何影響細(xì)胞增殖和凋亡時(shí)發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)因子2（IGF-2）基因在唾液腺瘤中的表達(dá)高度上調(diào)，并且在IGF-2的啟動(dòng)子3中發(fā)現(xiàn)了潛在的PLAG1結(jié)合位點(diǎn)，提示PLAG1與細(xì)胞增殖相關(guān)生命活動(dòng)有一定的關(guān)系。Zheng等通過(guò)體內(nèi)蛋白質(zhì)翻譯后修飾實(shí)驗(yàn)證實(shí)PLAG1編碼的244、263和353位氨基酸是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的靶點(diǎn)，進(jìn)一步研究證實(shí)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾能抑制IGF-2的表達(dá)。PLAG1和PLAGL2接受乙?；恼{(diào)節(jié)，可被p300乙酰化和激活，可被NDAC7去乙酰化和抑制。小泛素相關(guān)修飾物（small ubiquitin—related modifier，SUMO）效應(yīng)是一條三步驟酶信號(hào)通路，代表靶基因的轉(zhuǎn)錄活性，Yang等證實(shí)，SUMO效應(yīng)在PLAG1和PLAGL2轉(zhuǎn)活中發(fā)揮相反作用。SUMO效應(yīng)的測(cè)定證實(shí)了PLAG1的244、263和353位氨基酸和PLAGL2的250、269和356位氨基酸為SUMO效應(yīng)位點(diǎn)，且SUMO效應(yīng)抑制PLAG1誘導(dǎo)的IGF-2表達(dá)。Alam等分析了PLAG基因家族在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)基因都在大腦皮層決定神經(jīng)元命運(yùn)的時(shí)候進(jìn)行表達(dá)，提示PLAG基因家族可以影響大腦皮層祖細(xì)胞做出細(xì)胞命運(yùn)選擇。Cas等還發(fā)現(xiàn)，小鼠ZAC-1和人類(lèi)PLAGL1之間的同源部分不包括ZAC-1中存在的34個(gè)PLE、PMQ和PML重復(fù)序列，也不包括這兩種蛋白質(zhì)的羧基末端，提出ZAC1可能是PLAG蛋白質(zhì)家族的第四成員。

二、PLAG1的結(jié)構(gòu)、功能和分布

人類(lèi)PLAG1基因位于8號(hào)染色體長(zhǎng)臂q12處，cDNA全長(zhǎng)7317nt，包含5個(gè)外顯子，編碼框長(zhǎng)度為1503bp，其表達(dá)產(chǎn)物PLAG1鋅指蛋白由501個(gè)氨基酸構(gòu)成。雖然PLAG1基因有5個(gè)外顯子，但這5個(gè)外顯子并不都能參與編碼翻譯，PLAG1基因的前3個(gè)外顯子因缺少編碼相應(yīng)的啟動(dòng)子序列而不能參與翻譯，第4個(gè)外顯子包含編碼起始密AUG，第5個(gè)外顯子中有編碼終止密碼UAA，因此PLAG1是從第4外顯子的最后端和第5外顯子的起始端開(kāi)始編碼翻譯。豬的PLAG1基因位于4號(hào)染色體上，包含4個(gè)外顯子，全長(zhǎng)50134nt，mRNA轉(zhuǎn)錄體有3個(gè)亞型，但只編碼兩種蛋白質(zhì)，X1和X2亞型mRNA編碼Ⅰ型蛋白質(zhì)，由499個(gè)氨基酸構(gòu)成，CDS序列均長(zhǎng)為1500nt；X3型mRNA編碼Ⅱ型蛋白質(zhì)，由417個(gè)氨基酸構(gòu)成。牛的PLAG1基因位于14號(hào)染色體，含有4個(gè)外顯子，全長(zhǎng)51953nt，含有3種轉(zhuǎn)錄本亞型，X1型轉(zhuǎn)錄本編碼499個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)，X2和X3型轉(zhuǎn)錄本編碼完全相同的417個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。馬的PLAG1基因定位在9號(hào)染色體上，包含5個(gè)外顯子，全長(zhǎng)53146nt，mRNA轉(zhuǎn)錄體也有3種亞型，編碼蛋白質(zhì)情況與豬相同，都編碼由499和417個(gè)氨基酸組成的蛋白質(zhì)。羊的PLAG1基因位于9號(hào)染色體上，全長(zhǎng)12750nt，包含3個(gè)外顯子；驢的PLAG1基因定位于12號(hào)染色體（本課題組組裝版本，尚未公布），已知包含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，全長(zhǎng)6801nt（86316851-86323651），與豬和馬不同，驢的mRNA轉(zhuǎn)錄體只有兩種，X1型包含3個(gè)外顯子，2個(gè)內(nèi)含子；X2型包含2個(gè)外顯子，1個(gè)內(nèi)含子。X1型編碼蛋白含有499個(gè)氨基酸，X2型編碼蛋白含有417個(gè)氨基酸。圖1為多物種PLAG1基因的進(jìn)化樹(shù)分析及序列比對(duì)結(jié)果，可見(jiàn)在多個(gè)物種中序列相似性較高，說(shuō)明PLAG1基因具有較高的保守性。如圖2所示，在多個(gè)物種中，PLAG1基因與CNCND7和MOS基因連鎖性較強(qiáng)，總是同時(shí)出現(xiàn)。

◎圖1 多物種PLAG1基因的序列比對(duì)結(jié)果

PLAG1是在染色體8q12異常（通過(guò)啟動(dòng)子交換或啟動(dòng)子替換）而被激活的一種鋅指蛋白編碼基因。在許多人類(lèi)腫瘤疾病中，PLAG1的激活是一個(gè)重要事件。微陣列分析表明，PLAG1的致癌能力可能是由IGF-2的有絲分裂信號(hào)通路介導(dǎo)的。PLAG1編碼產(chǎn)物以一種特定方式結(jié)合DNA，這種結(jié)合主要利用鋅指蛋白7根鋅指中的3根，鋅指6和7與核心相互作用，鋅指3與G-簇相互作用。PLAG1、PLAGL1和PLAGL2的羧基末端結(jié)構(gòu)域的亞區(qū)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中與特定的DNA結(jié)構(gòu)域連接時(shí)顯示出不同的轉(zhuǎn)錄激活能力，從而證明這些蛋白質(zhì)可以作為轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控因子發(fā)揮作用。分析表明，PLAG1（Asp-385-Gln-500）和PLAG-2（Pro-382-Gln-496）中羧基末端的第二部分含有必需的轉(zhuǎn)錄激活域。Braem等利用酵母雙雜交系統(tǒng)，鑒定出核外激素α2與PLAG1相互作用。體外谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶下拉試驗(yàn)證實(shí)了PLAG1與核外激素α2之間的物理相互作用。核外激素α2通過(guò)與由短鏈堿性氨基酸組成的核定位序列（NLS）相互作用，將蛋白質(zhì)護(hù)送到細(xì)胞核中。PLAG1的輸入受其鋅指結(jié)構(gòu)域和核苷α2識(shí)別位點(diǎn)NLS1的控制。Alam等重點(diǎn)分析了PLAG基因在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用，發(fā)現(xiàn)PLAG基因在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中以單獨(dú)和部分重疊相結(jié)合的表達(dá)模式進(jìn)行，雖然PLAG基因家族的3個(gè)成員在某些譜系中共同表達(dá)，但它們?cè)谄渌M織中也表現(xiàn)出獨(dú)特的、在時(shí)空上互補(bǔ)的表達(dá)模式。許多研究表明，PLAG家族編碼蛋白是核蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，調(diào)控體內(nèi)許多重要基因的表達(dá)。PLAG基因在祖細(xì)胞群和有絲分裂后的神經(jīng)元中都有表達(dá)，這表明它們?cè)谏窠?jīng)發(fā)育、控制細(xì)胞命運(yùn)或增殖決定中既發(fā)揮早期作用，還可能參與后期分化過(guò)程。圖3為多個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中PLAG1的功能性結(jié)構(gòu)區(qū)域展示圖。

◎圖2 PLAG1及其鄰近基因示意圖

三、PLAG1在生物發(fā)育過(guò)程中的作用

脊椎的發(fā)生發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，涉及多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路及基因家族，如Hox基因家族及其信號(hào)通路、Notch信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、FGF信號(hào)通路及RA信號(hào)通路等，這些信號(hào)通路及基因通過(guò)協(xié)同合作對(duì)動(dòng)物椎骨的形成進(jìn)行周期性調(diào)控，以確保其正常的形成及分化。自1997年發(fā)現(xiàn)PLAG家族成員以來(lái)，人們已經(jīng)逐步認(rèn)識(shí)到了PLAG家族的結(jié)構(gòu)和功能，大量數(shù)據(jù)表明，此基因家族在調(diào)控脊椎動(dòng)物椎骨數(shù)量方面發(fā)揮重要作用，但它們的信號(hào)途徑、在復(fù)雜過(guò)程中的潛在作用等方面還有待研究。

研究發(fā)現(xiàn)，牛14號(hào)染色體上的PLAG1基因與牛的身高有關(guān)。PLAG1在垂體中大量表達(dá)，雖然下丘腦也含有表達(dá)PLAG1的細(xì)胞，但PLAG1的基因敲除并沒(méi)有使下丘腦合成產(chǎn)物的表達(dá)水平發(fā)生顯著改變，因此Juma等認(rèn)為，PLAG1缺乏會(huì)降低小鼠生殖能力，但對(duì)雄性小鼠下丘腦-垂體系統(tǒng)的生殖控制并沒(méi)有發(fā)揮主要影響。除了調(diào)控轉(zhuǎn)錄、控制代謝外，染色質(zhì)包裝可能是鋅指蛋白發(fā)揮其調(diào)控作用的重要途徑。PLAG1和NCAPGLCORL，兩者都被稱(chēng)為成人身高基因座，在牛、馬、狗和豬的體重/身高選擇性掃描中都被檢測(cè)到，研究表明，這些基因座對(duì)哺乳動(dòng)物的生長(zhǎng)過(guò)程和體型大小有顯著影響。牛的進(jìn)化以體型變化最為明顯，Utsunomiya等對(duì)自新石器時(shí)代以來(lái)的牛體尺數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)PLAG1基因在牛體尺變化中起重要作用。遺傳多態(tài)性對(duì)牛的性狀改良具有重要影響，家族的多態(tài)性將極大地改變牛的生長(zhǎng)性狀，徐偉等對(duì)566頭牛混合DNA樣本進(jìn)行測(cè)序以檢驗(yàn)PLAG1多態(tài)性與生長(zhǎng)性狀之間的關(guān)系，在PLAG1基因內(nèi)部檢測(cè)到一個(gè)19bp的Indel突變，PCR結(jié)果顯示3個(gè)基因型和2個(gè)等位基因：142bp（W）和123bp（D），其中WW基因型和W等位基因型在研究群體中占優(yōu)勢(shì)。趙拴平等以安徽大別山牛為試驗(yàn)群體，采用PCR和直接測(cè)序技術(shù)檢測(cè)PLAG1基因的多態(tài)性，在PLAG1基因第1內(nèi)含子區(qū)檢測(cè)到了上述徐偉等檢測(cè)到的19-bp Indel位點(diǎn)，3’UTR區(qū)檢測(cè)到1個(gè)變異位點(diǎn)g.48316C＞T，二者均屬于中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50），其中19-bp Indel位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)，推測(cè)這個(gè)19bp的Indel位點(diǎn)可能是普遍存在于各牛品種中。除了上述19-bp Indel位點(diǎn)，吳慧等選取5個(gè)品種的744只綿羊，DNA混池測(cè)序后發(fā)現(xiàn)PLAG1基因中存在兩個(gè)Indel位點(diǎn)（均位于內(nèi)含子1中），對(duì)這兩個(gè)Indel位點(diǎn)進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果顯示具有較高的遺傳多態(tài)性，并且與成年羊的體重及體格大小顯著相關(guān)（P＜0.05）；徐洪偉等選取了來(lái)自7個(gè)綿羊品種的2350只綿羊，全基因組分析顯示，在CHCHD7基因下游2758bp的位置有一個(gè)8bp的缺失，將此indel位點(diǎn)與上述吳慧等的研究結(jié)果進(jìn)行連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，這兩個(gè)基因的缺失變異雖然不存在強(qiáng)連鎖，但是與灘羊的生長(zhǎng)性狀存在顯著相關(guān)性（P＜0.05）。An等對(duì)463頭日本和牛的體尺性狀進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，分別檢測(cè)到18個(gè)、5個(gè)和1個(gè)與尻高、體高和體長(zhǎng)性狀相關(guān)的SNP，其中與尻高有關(guān)的SNP位點(diǎn)就定位于PLAG1基因內(nèi)。另有研究表明，中國(guó)牛品種如秦川牛、品安牛、咸安牛和嘉縣紅牛的部分位點(diǎn)具有多態(tài)性，相關(guān)分析表明，該多態(tài)性與這些牛品種的身高有關(guān)。Zhang等在研究中國(guó)桐城大白豬NR6A1、PLAG1和VRTN基因多態(tài)性與椎骨數(shù)量的關(guān)系時(shí)，應(yīng)用全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，NR6A1、PLAG1和VRTN與豬的椎骨數(shù)量顯著相關(guān)（P＜0.05）。

◎圖3 驢PLAG1基因功能性結(jié)構(gòu)展示圖

四、PLAG1的突變及其生物學(xué)功能

研究發(fā)現(xiàn)，超過(guò)一半的腫瘤顯示出反復(fù)的染色體異常，其中8號(hào)染色體的重排最為頻繁（超過(guò)50%），通常涉及8q12帶，最常見(jiàn)的畸變是t（3；8）（p21；q12），3p21為優(yōu)先異位伙伴。β-連環(huán)蛋白是黏附連接和WG/WNT信號(hào)通路中作用的一種界面蛋白，t（3；8）（p21；q12）導(dǎo)致PLAG1和β-連環(huán)蛋白（CTNNB1）組成性表達(dá)基因之間的啟動(dòng)子交換。Voz等為了評(píng)估異位伙伴對(duì)PLAG的重要性，他們將另一個(gè)異位：t（5；8）（p13；q12）融合在兩個(gè)基因的5’非編碼區(qū)，在保留編碼序列的同時(shí)交換調(diào)控元件，該異位突變導(dǎo)致了白血病抑制因子受體的廣泛表達(dá)。Li等在研究PLAG1基因在不同組織不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)時(shí)發(fā)現(xiàn)，其在所有組織中均有表達(dá)，但在5月齡和36月齡的成年牛中表達(dá)量差異極顯著（P＜0.01），且存在兩種變異體，相關(guān)性分析表明，這兩個(gè)變異體與生長(zhǎng)性狀相關(guān)聯(lián)。Song等采用全基因組關(guān)聯(lián)分析來(lái)鑒定與胴體性狀相關(guān)的遺傳變異，利用壓縮混合線性模型對(duì)1141頭中國(guó)西門(mén)塔爾牛的770K基因型單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)進(jìn)行了全基因組關(guān)聯(lián)分析，共發(fā)現(xiàn)17個(gè)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)，在PLAG1-CHCHD7基因區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)一個(gè)多效的數(shù)量性狀核苷酸（QTN），命名為BovineHD1400007259（p＜10-8），它控制著關(guān)節(jié)、二頭肌和小腿性狀的變異。

據(jù)筆者所知，PLAG1基因在馬屬動(dòng)物身上至今還沒(méi)有深入的研究。本課題組進(jìn)行驢的屠宰試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，德州驢的胸椎（thoracic vertebra）數(shù)一般為17～19根，腰椎(Lumbar vertebra)數(shù)一般為5～6根，并且胸腰椎數(shù)的組合主要存在5種類(lèi)型：L5T17（2.8%）、L5T18（76.5%）、L5T19（0.9%）、L6T17（10.4%）、L6T18（9.5%），其中L5T18占比最高。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，德州驢多一根胸椎體長(zhǎng)增加4.3厘米，多一根腰椎體長(zhǎng)增加2.4厘米，多一根椎骨凈肉重增加7.2千克，皮重增加0.65千克，由此可見(jiàn)選育多胸腰椎數(shù)的親代驢對(duì)驢產(chǎn)業(yè)具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。胸腰椎數(shù)目變異與驢的經(jīng)濟(jì)效益相關(guān)，因此在驢的分子育種領(lǐng)域?qū)εc胸腰椎數(shù)有關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行更加深入的研究意義重大，基于PLAG1在其他動(dòng)物身上已經(jīng)獲得的研究結(jié)果我們推測(cè)，此基因可作為研究驢胸腰椎數(shù)有關(guān)的候選基因。

綜上所述，PLAG1基因不僅與各種腫瘤、癌癥、青光眼有關(guān)，還與多種動(dòng)物的椎骨數(shù)量、骨密度、體高、體長(zhǎng)等生長(zhǎng)性狀密切相關(guān)，雖然單獨(dú)PLAG1基因內(nèi)部的突變并不能直接帶來(lái)動(dòng)物表型的改變，但研究其突變對(duì)于探索基因如何調(diào)控動(dòng)物的生長(zhǎng)性狀具有不可忽視的作用，它與不同基因的協(xié)同作用也許就是未來(lái)分子育種的一大助力。