用于核酸檢測的現(xiàn)場即時檢測裝置設計*

謝璐，吳義才，劉家宇，陳留曉，談鴻偉，汪圣舟，韋依珊，鄒任玲,2△，李丹，胡秀枋

(1.上海理工大學健康科學與工程學院，上海 200093;2.上海貝瑞電子科技有限公司，上海 201100)

引言

環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是體外診斷領域的一項關鍵技術，該技術的基本原理[1-2]是利用特異性核酸引物和具有鏈置換效應以及識別延伸效應的Bst DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)，在6～65℃恒溫條件下，經(jīng)過30～60 min，即可將樣本中包含目標片段基因的少量核酸分子擴增至千百萬份，進而實現(xiàn)從樣本中檢測出特定病原體的核酸分子的目的。

相比較體外診斷領域中的其他檢測技術，LAMP技術具有高靈敏度、運行簡便、實驗裝置低廉、高特異性等優(yōu)勢[3]，更能滿足快速準確檢測病原微生物的需求，被廣泛應用于多種疾病的確診，包括新型冠狀病毒[4-5]、HPV病毒[6]、諾如病毒[7]、流感病毒[8]等，在病原微生物現(xiàn)場[9-10]、基層檢測[11]等即時檢測領域，該技術也獲得了越來越多的關注。

分子POCT(point of care testing)技術[12-13]，也被翻譯為“現(xiàn)場即時檢測技術”，是基于核酸檢測技術上發(fā)展起來的一個理念。該理念保留了核酸檢測流程中最為核心的內(nèi)容“采樣—分析—輸出”，以滿足在最短的時間內(nèi)得到準確檢驗結果的臨床要求。而環(huán)介導等溫擴增的技術特點可以很好地適配該技術理念。因此，本研究以LAMP技術為基礎，結合分子POCT的理念，設計了一款用于核酸檢測的POCT裝置。

在LAMP技術的實驗裝置中，包含核酸擴增和定量檢測兩個核心模塊。核酸擴增模塊的主要功能是提供60～65℃的恒溫條件。在傳統(tǒng)的核酸擴增系統(tǒng)中，通常使用帕爾貼元件或電阻絲作為熱源，通過熱傳導對目標物實現(xiàn)加熱[14]。帕爾貼的優(yōu)勢在于它集升降溫功能于一身，控制簡單；缺點在于價格較高，且難以定制。電阻絲相對而言價格低、適應范圍廣。因此，本研究采用內(nèi)含電阻絲的陶瓷加熱片作為熱源對溫度控制。

定量檢測模塊的主要任務是對擴增中的核酸分子進行檢測，目前檢測 LAMP 產(chǎn)物的主要方法有凝膠電泳法，嵌合染料法，濁度法，金屬離子指示劑法[15]和熒光探針法[16]等。不同的檢測方法決定了LAMP技術的檢測能力和精度，相比較其他檢測方法，熒光探針法具有分辨率高、檢測準確的優(yōu)點。因此，本研究依據(jù)熒光探針法設計定量檢測模塊。

傳統(tǒng)的熒光探針檢測裝置的光路結構為光纖光路[17-20]和共聚焦光路[21-22]，這兩類光路結構使用濾光片將熒光從發(fā)射光中分離，并采用透鏡系統(tǒng)將其傳遞到傳感器中。而濾光片和透鏡的成本較高，且裝配要求高，是核酸擴增與檢測裝置中最為昂貴的模塊。因此，采用新的光路結構設計降低成本十分有意義。

本研究依照聚合酶鏈式反應醫(yī)藥的行業(yè)標準[23]要求，對裝置的核酸擴增能力和熒光檢測能力進行設計，并進行相關的實驗驗證。

1 材料與方法

系統(tǒng)設計包括核酸擴增模塊與核酸檢測模塊兩個關鍵部分。核酸擴增模塊采用陶瓷加熱片與散熱風扇相結合的方式，創(chuàng)造一個65℃的恒溫環(huán)境，以實現(xiàn)樣本內(nèi)部核酸分子的擴增；核酸定量檢測模塊由光路系統(tǒng)、光電檢測電路與上位機數(shù)據(jù)處理軟件三部分組成，其對核酸擴增過程中產(chǎn)生的熒光進行實時檢測與記錄，幫助實驗人員對檢測結果進行分析。

1.1 核酸擴增模塊設計

在本裝置中，核酸擴增模塊由6061-T6鋁合金、陶瓷加熱片與散熱風扇三部分組成。其中6061-T6鋁合金加工性能好、導熱性佳，將其作為核酸擴增模塊中的導熱介質，通過控制其溫度來實現(xiàn)實驗過程中的恒溫效果。

將鋁合金加工為上下兩個部分，見圖1。下部分鋁合金作為底座承載樣本管，側面與陶瓷加熱片和散熱風扇連接，采用單片機控制陶瓷加熱片和散熱風扇的開關，用于維持底座溫度恒定，實現(xiàn)恒溫核酸檢測試劑所需的穩(wěn)定溫度環(huán)境；上部分鋁合金作為熱蓋通過與底座之間的熱傳導實現(xiàn)溫度控制，目的是確保樣本管上下部位溫度一致，避免在實驗過程中產(chǎn)生大量冷凝水，影響核酸擴增與熒光信號的采集。

圖1 恒溫溫控模塊結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of the thermostat temperature control module

1.2 核酸檢測模塊設計

熒光探針法[24]通過使用帶有6-羧基熒光素(FAM)熒光標記的Taqman探針，該熒光基團能夠在約490 nm波段的激發(fā)光源的激勵下產(chǎn)生520 nm波段的熒光。核酸擴增過程中，探針完整性被破壞，熒光基團脫落，在受到入射光激發(fā)后，產(chǎn)生微弱的熒光。

熒光強度隨著核酸分子濃度變化，實現(xiàn)核酸濃度定性與定量檢測的功能。熒光強度的檢測反映了擴增后核酸分子的濃度，因此，熒光檢測的光路設計直接影響了核酸分子的檢測精度。

1.2.1檢測光路設計 在核酸檢測裝置中，傳統(tǒng)的熒光檢測光路結構主要有光纖型光路和共聚焦型光路，其光路結構見圖2。

圖2 傳統(tǒng)熒光檢測光路結構原理圖Fig.2 Schematic diagram of traditional fluorescence detection optical path structure

光纖型光路的核心是采用光纖將光源發(fā)出的光傳導至樣本中，并利用另外一根光纖將熒光傳導至光電傳感器。通常光纖長度較大，光功率會出現(xiàn)明顯的損耗，因此，需要透鏡對光進行聚焦處理，以保證檢測效果，該光路結構的優(yōu)點是應用場景較為靈活。文獻[17-20]和上海宏石SLAN-96P熒光定量PCR儀均采用該光路結構。

共聚焦型光路的核心是利用二向色分光鏡對入射光和熒光信號進行分離處理，多用在只能從樣本上方采集熒光信號的設備中。文獻[21-22]和賽默飛ABI7500熒光定量PCR儀等產(chǎn)品采用該光路結構。

這兩種光路結構中均需要采用入射濾光片和檢測濾光片兩個帶通濾光片對光信號進行處理。其中,入射濾光片的功能是將光源的發(fā)射波長限制在熒光基團所能吸收的范圍內(nèi)。檢測濾光片的波長范圍是基團所發(fā)射熒光的波長范圍。

由于入射光與熒光的光功率相差極大，若入射濾光片與檢測濾光片的波長范圍存在交叉，則熒光信號將會被入射光淹沒，導致不能被光電傳感器檢測到。

為了保證檢測光路能夠實現(xiàn)其檢測功能，入射光濾光片與檢測濾光片是傳統(tǒng)熒光檢測光路結構中的必要元器件。但濾光片的存在會增加光路結構的成本，且濾光片屬于精密光學元器件，其安裝要求較高，不利于該技術向基層推廣。

針對以上問題，本研究依據(jù)PCR熒光檢測原理，采用正交型光路對傳統(tǒng)熒光檢測光路結構進行優(yōu)化。具體機理如下：

位于試管正下方的LED光源發(fā)射出的入射光經(jīng)過遮光板B內(nèi)部的光纖約束后，以較小直徑的光斑照射到試管內(nèi)的樣本中。由于LED光源位于試管的正下方，因此，入射光全部向上照射，并最終被吸光板所吸收，且不會被試管側面的光電傳感器檢測到。

隨著實驗的進行，樣本內(nèi)的核酸分子開始擴增，濃度提高，對應的熒光物質的濃度也不斷提高[25]，熒光將被入射光激發(fā)出來。并以漫反射的形式出現(xiàn)。部分被激發(fā)出的熒光會向試管側面照射，經(jīng)過遮光板A內(nèi)部的光纖約束后，進入到試管側面的光電傳感器中。光電傳感器在受到熒光照射后產(chǎn)生對應的電信號，并通過光電檢測電路實現(xiàn)對該電信號的放大濾波和模數(shù)轉換。其光路結構原理見圖3。

圖3 正交光路結構原理圖Fig.3 Schematic diagram of orthogonal optical path structure

本研究中的光路結構可以在不使用濾光片和透鏡的情況下，減少入射光對熒光采集的影響，降低核酸檢測裝置中的光學檢測部分的成本與技術難度。同時，光路結構設計緊湊，使各元器件之間不存在相對位移，保證了光路結構的穩(wěn)定性，并且該光路擴展性強，可以選用多色LED配合多種熒光探針實現(xiàn)單樣本管內(nèi)多種核酸靶標的檢測。由于本研究只驗證該光路結構的可行性，因此，只采用單色LED進行試驗驗證。

1.2.2光電檢測電路設計 POCT裝置的電路系統(tǒng)框架見圖4。光電檢測模塊采集樣本被激發(fā)出的熒光信號通過MCU進行數(shù)據(jù)接收，并處理發(fā)送至上位機用于顯示和保存。同時，MCU控制加熱片和散熱風扇用于保持實驗環(huán)境的恒溫。

圖4 裝置電路系統(tǒng)整體框圖Fig.4 Overall frame diagram of the device circuit system

目前熒光檢測中通常采用的光電傳感器共有三類，分別是工業(yè)相機[18](CCD),光電倍增管[17,21](PMT)和硅光電二極管[19](PD)。三者的優(yōu)缺點見表1。

表1 常用光電傳感器優(yōu)缺點Table 1 Advantages and disadvantages of common photoelectric sensors

本研究要實現(xiàn)用于核酸檢測的POCT裝置設計，因此，不采用功耗大、成本高的PMT和體積較大的CCD，而采用體積小、技術成熟的PD作為光電傳感器對熒光信號進行檢測。

由于熒光信號的光功率為亞nW量級，極為微弱。PD是通過將光信號(光功率值)轉化為電流信號進行工作，在熒光的照射下，其產(chǎn)生的電流也極為微弱，極易受到背景噪聲和電路熱噪聲的影響。因此，在設計放大電路之前必須嚴格控制PD和運算放大器的參數(shù)，選擇最適合的型號。

經(jīng)過多次選型與測試，最終本研究光電檢測模塊中使用濱松光子型號為S1133-01的硅光電二極管作為光電傳感器，使用靜電級運算放大器ADA4530進行運算放大，二者的關鍵參數(shù)見表2、表3。

表2 硅光電二極管S1133-01關鍵參數(shù)表Table 2 Key parameters of silicon photodiode S1133-01

表3 運算放大器ADA4530關鍵參數(shù)表Table 3 Key parameters of operational amplifier ADA4530

其中，暗電流表示在無入射光的情況下，PD仍存在的電流輸出，該型號PD的暗電流最大為10 pA，不影響微弱熒光的檢測。結電容越大，放大電路的噪聲越大，因此，盡量選擇較小的結電容，該PD的結電容低于1 nF，可以進行低噪聲電路設計。較大的結電阻可以保證PD產(chǎn)生的光電流全部流向放大電路，該PD結電阻最小為10 GΩ，可以滿足電路需求。

開環(huán)直流增益和增益帶寬積兩個參數(shù)直接影響運放的放大能力，在本研究中這兩個參數(shù)應盡量大；而輸入偏置電流、輸入失調(diào)電流和輸入失調(diào)電壓會產(chǎn)生噪音，使信號的轉化產(chǎn)生誤差，因此，這三者的值應盡可能的小。

在選定元器件以后，將ADA4530配置為跨阻放大器，與以光伏模式工作的S1133-01相連接，其電路圖見圖5。

圖5 帶光電二極管的跨阻放大器電路圖Fig.5 Circuit diagram of transresistance amplifier with photodiode

在采樣電路中，采用精度為24位的AD7799芯片將模擬信號轉化為數(shù)字信號；為保證精準性，選擇AD680作為電壓基準芯片，并且在輸入端接入LC濾波，在輸出端接入雙電容減少紋波，使其提供的電壓更加精準(見圖6)。

圖6 AD模數(shù)轉換電路圖Fig.6 Circuit diagram of Analog-to-Digital conversion

ADA4530通常需要±5 V電源供電，因此，電源模塊由DC/DC芯片和LDO芯片構成。DC/DC芯片選用LM2664，將USB接口接入的5 V電壓轉變?yōu)?5 V電壓。LDO芯片選用SPX3819，在此電路中它將5 V電壓轉化為3.3 V電壓，用于給微控制器供電(見圖7)。

圖7 光電檢測電路電源部分原理圖Fig.7 Schematic diagram of power supply part of photoelectric detection circuit

1.2.3軟件設計 基于QT為本裝置設計了一款上位機用于對數(shù)據(jù)進行處理與展示，通過USB接口傳輸至計算機，根據(jù)串口的通訊參數(shù)，對通訊協(xié)議、采樣頻率、波特率和數(shù)據(jù)校驗位等進行了設置，以實現(xiàn)數(shù)據(jù)的采集和導出功能(見圖8)。

圖8 上位機與數(shù)據(jù)存儲Fig.8 Host computer and data storage

1.3 裝置性能測試實驗設計

圖9為本研究所設計核酸檢測POCT裝置的實物圖。為了驗證該裝置的溫控與熒光檢測能力，參考行業(yè)標準設計了熒光強度重復性實驗、熒光濃度梯度線性實驗、環(huán)境光強變化實驗和溫度控制精度實驗。

圖9 核酸檢測POCT裝置實物圖Fig.9 Picture of POCT device for nucleic acid detection

1.3.1熒光檢測能力測試實驗 熒光檢測能力測試實驗采用上海吉至(ACMEC)公司的6-羧基熒光素(FAM)作為熒光染料配置熒光標準品。調(diào)制熒光標準品采用的移液槍品牌為大龍生物(DLAB)，其允許最大系統(tǒng)誤差為0.006～0.18 uL。

以熒光染料溶于水的飽和液作為母液標定為1，進行梯度稀釋，分別為：1/16濃度、1/32濃度、1/64濃度、1/128濃度、1/256濃度、1/512濃度與去離子水。用以上7個液體作為檢測樣本進行檢測。

1.3.2溫度控制精度檢測實驗 溫度控制精度檢測實驗采用FLIRA615紅外熱像儀實時對加熱裝置進行溫度監(jiān)測，溫度檢測靈敏度小于0.05℃。

2 結果與討論

2.1 熒光檢測能力測試實驗結果

2.1.1熒光強度重復性實驗 光強度檢測重復性應保證用高、中、低濃度校準染料重復檢測，其變異系數(shù)CV不大于3%。

圖10為各濃度梯度的10次重復性實驗，由圖可知，每一濃度的重復性檢測結果偏差極小，接近一條直線。

圖10 各濃度熒光染劑的熒光強度值Fig.10 The fluorescence intensity of each concentration of fluorescent dye

圖11為不同濃度梯度10次檢測后的CV值與行業(yè)標準CV值的對比，可以看出，本研究求得CV值遠低于行業(yè)標準規(guī)定的CV值。因此，表明本裝置光路結構對熒光強度檢測具有良好的重復性與穩(wěn)定性。

圖11 檢測熒光CV值與規(guī)定CV值對照圖Fig.11 Comparison diagram of detected fluorescence CV value and specified CV value

其中，CV為變異系數(shù)；SD為標準差；M為測量結果平均值。

2.1.2熒光濃度梯度線性實驗 熒光濃度梯度線性實驗用于驗證熒光強度變化與核酸分子濃度變化的相關性，該項指標直接反映了光路結構對核酸分子濃度檢測的靈敏度與真實性。

根據(jù)行業(yè)要求規(guī)定，對系列稀釋熒光染料的樣本(至少5個梯度)進行檢測，各濃度熒光測定值與稀釋比例的線性相關系數(shù)r應不低于0.990。表4為各濃度梯度的熒光強度平均值與標準差，以及計算所得相關系數(shù)。由表4可知，檢測所得相關系數(shù)為0.997，高于行業(yè)標準0.990，可知本研究光路結構檢測所得熒光信號與DNA濃度變化有著極好的相關性，可真實反應DNA濃度的變化。

表4 熒光染劑濃度與檢測熒光光功率相關系數(shù)Table 4 Correlation coefficient between fluorescence dye concentration and detection fluorescence light power

其中，Cov(X,Y)為協(xié)方差，Var[X]Var[Y]分別為X、Y的方差。

2.1.3環(huán)境光強變化實驗 通過對比在不同環(huán)境下裝置對同一樣本的檢測結果，驗證其光密封性與不同環(huán)境檢測的適應能力。

采用t檢驗對比光強為92.5～94.3 Lux的自然光環(huán)境與光強為0.2～0.9 Lux的暗室中裝置的熒光檢測能力。圖12為暗室環(huán)境與自然光環(huán)境下，重復測試10次所得平均值。表5為不同環(huán)境、不同濃度梯度下，求得t檢驗結果。本次實驗t檢驗結果P=0.99897，當t檢驗P>0.05時，無顯著差異，所以在不同環(huán)境光強下，該裝置的檢測能力不受影響。

圖12 暗室與自然光狀態(tài)下熒光強度對照圖Fig.12 Comparison of fluorescence intensity between darkroom and natural light

表5 暗室與自然光狀態(tài)下熒光強度t檢驗結果Fig 5 Fluorescence intensity t test results in dark room and natural light

2.2 溫度控制精度實驗

為驗證本研究裝置溫度控制的精度，使用紅外熱像儀對鋁塊加熱的過程進行實時監(jiān)測，實驗參數(shù)設置為室溫28℃，6061鋁合金輻射率為0.95，相對濕度50%。行業(yè)標準要求，溫度控制精度應不大于±0.5℃。

在10 min內(nèi)，平均每分鐘對6061鋁合金塊進行采樣，其溫度浮動范圍小于0.5℃，計算其標準差為0.143，滿足行業(yè)標準要求。實驗結果見圖13。

圖13 紅外熱像儀溫度檢測結果Fig.13 Thermal imaging camera temperature test table

3 結論

本研究研制了一種基于環(huán)介導等溫擴增技術的用于核酸檢測的POCT裝置，使用時只需將調(diào)制好的樣本放置入核酸檢測裝置中，即可進行核酸擴增和檢測實驗。

依照核酸檢測領域相關行業(yè)標準，本研究對所設計的裝置性能進行測試。結果表明，溫度控制精度小于±0.5℃；熒光強度檢測結果變異系數(shù)小于行業(yè)標準所要求的3%；線性實驗相關系數(shù)為0.997，大于行業(yè)標準0.990；不同環(huán)境光強變化實驗的t檢驗分布結果證明了在不同環(huán)境下，檢測結果無顯著性差異。證明該裝置能夠實現(xiàn)核酸擴增與檢測的功能，具有可靠性與穩(wěn)定性。

相比較傳統(tǒng)的核酸檢測裝置，本研究裝置體積小、成本低、能耗小、操作簡單、適配性強，且滿足行業(yè)標準所給定的核酸擴增與熒光檢測的要求，因此，可以滿足多種核酸自提取試劑的檢測需求。

本研究裝置可以克服傳統(tǒng)檢測過程需要實驗室、大型實驗設備與專業(yè)操作人員的缺點，實現(xiàn)了“現(xiàn)場即時檢測”理念中的分析與輸出目標。后續(xù)可以推進的工作包括在核酸自提取試劑的基礎上設計核酸采樣模塊 ，熒光檢測模塊實現(xiàn)多種熒光的同時檢測，核酸擴增模塊實現(xiàn)不同溫度循環(huán)控制并進行實際生物樣本檢測等，以實現(xiàn)單一樣本多種病原體的檢測功能，適配更多類型的核酸檢測試劑。