余思潔,李洪軍,李少博,張東,李敏涵,賀稚非
(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,重慶,400715)
狹義上的酵素是指生物體利用發(fā)酵原料所產(chǎn)生的具有催化作用的活性大分子物質(zhì),但目前市面上常見的酵素是廣義上的酵素,包含酶和其他生物活性成分的混合物[1]。目前國內(nèi)酵素市場還處于發(fā)展初期,市場上出現(xiàn)的酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,進(jìn)口的酵素產(chǎn)品在國內(nèi)售價普遍偏高,難以滿足市場需求[2]。
果蔬中碳水化合物、酚類物質(zhì)、維生素、膳食纖維及礦物質(zhì)[3]等含量較高,是微生物發(fā)酵的優(yōu)良基質(zhì),因此大量研究人員將果蔬作為發(fā)酵原料。從原料選擇到發(fā)酵時長、發(fā)酵溫度等各條件存在差異,生產(chǎn)過程中所發(fā)生的變化也有所不同,酵素生產(chǎn)的基本流程主要包括原料預(yù)處理、調(diào)整發(fā)酵液中的成分、發(fā)酵、后熟以及后處理等。在食用植物酵素生產(chǎn)中,常用到后熟陳釀這一工藝,專利CN105995684A公布了一種共生菌群酵素的制備方法,將所得的初酵素液靜置于25~30 ℃的環(huán)境中后熟1~2個月,最終所得產(chǎn)品中含有高質(zhì)量的酶以及益生菌分泌物。
植物酵素中的生物活性成分的差異會導(dǎo)致其功能活性的差異,市售酵素產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊,目前科學(xué)研究主要集中在開發(fā)不同原料酵素的發(fā)酵工藝方面,對植物酵素發(fā)酵、后熟過程中的變化情況,特別是對后熟過程中的變化情況研究較少。本試驗以復(fù)合蔬菜汁為原料,以植物乳桿菌PMO08為發(fā)酵菌種,采用儀器分析等研究方法,對植物酵素發(fā)酵和后熟期間的變化情況進(jìn)行研究,旨在對植物酵素在生產(chǎn)過程中的變化進(jìn)行初步探討,以期為該產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。
配料表見表1,復(fù)合蔬菜酵素配料種類及比例由前期試驗確定;植物乳桿菌PMO08、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%的低聚果糖溶液,韓國圃美多公司。
表1 復(fù)合蔬菜酵素配料表Table 1 Ingredients for compound vegetable Jiaosu
葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、NaH2PO4、Na2HPO4、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、乙酸標(biāo)準(zhǔn)品、磷酸、檸檬酸鈉、Na2CO3、Al(NO3)3、FeSO4,重慶躍翔化工有限公司;無水乙醇、三羥甲基氨基甲烷(trimethylol aminomethane,Tris)、FeCl3、NaOH、HCl,重慶市鈦新化工有限公司;ABTS,美國Sigma公司;福林酚,上海源葉生物科技有限公司;蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品,北京索萊寶科技有限公司;平板計數(shù)培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;水楊酸、NaNO2,上海易恩化學(xué)技術(shù)有限公司;甲醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;5-磺基水楊酸,北京華威銳科化工有限公司;鄰苯三酚,畢得醫(yī)藥公司。
UV-1780紫外可見分光光度計、GCMS-QP2010Plus氣質(zhì)聯(lián)用儀、LC-20AD高效液相色譜,日本島津公司;UltraSan PRO測色儀,美國Hunter Lab公司;L-8800全自動氨基酸分析儀,日本日立公司。
1.3.1 樣品預(yù)處理
將復(fù)合蔬菜汁(FQ)接種活化后的植物乳桿菌PMO08,接種量為0.01%(體積分?jǐn)?shù)),37 ℃發(fā)酵72 h后,當(dāng)總酸[(35.0±1.0) g/kg]、pH(3.3±0.5)、可溶性固形物[(13.0±1.0)%]時,停止發(fā)酵,得到復(fù)合蔬菜酵素(FH),將得到的樣品FH與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為55%的低聚果糖溶液按1∶1(體積比)混合后進(jìn)入后熟階段,后熟溫度25 ℃,每周定時攪拌10 min,定時取樣,所取樣品以“SC-天數(shù)”形式命名。
1.3.2 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中的感官評價
參考T/CBFIA 08003—2017《食用植物酵素》感官要求及邢慧雅[4]的方法,結(jié)合本試驗研究的復(fù)合蔬菜酵素產(chǎn)品的感官特點,由10位接受過感官評價培訓(xùn)的專業(yè)人員(5男5女)根據(jù)感官評價標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,感官評價標(biāo)準(zhǔn)見表2。
表2 復(fù)合蔬菜酵素感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory scoring standards for compound vegetable Jiaosu
1.3.3 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中的理化特性
1.3.3.1 理化指標(biāo)的測定
pH值測定參照GB 5009.237—2016《食品pH值的測定》。總酸含量(以乳酸計)測定參照GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》。還原糖含量(以葡萄糖計)測定參照GB 5009.7—2016《食品中還原糖的測定》??扇苄怨绦挝锖渴褂谜酃鈨x測定。
1.3.3.2 光學(xué)性質(zhì)的測定
使用測色儀測定色值。參考MEYDAV等[5]的方法測定褐變度。濁度:4 ℃,8 000 r/min離心10 min后取上清液,在660 nm處測定吸光度。
1.3.3.3 離心沉淀率的測定
取50 g樣品,5 000 r/min離心10 min,去除上清液,精確稱量剩余沉淀的質(zhì)量。
1.3.3.4 微生物指標(biāo)的測定
菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2—2016《食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》。霉菌數(shù)測定參照GB 4789.15—2016《食品微生物學(xué)檢驗霉菌和酵母計數(shù)》。
1.3.4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中生物活性成分的含量
1.3.4.1 總酚含量的測定
參考ADOM等[6]和CHU等[7]的方法,以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.021 3x+0.036 8(R2=0.994 9)。
1.3.4.2 總黃酮含量的測定
參考LIU等[8]的方法,以為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.013x-0.034(R2=0.996 6)。
1.3.4.3 有機(jī)酸含量的測定
參考GB 5009.157—2016《食品有機(jī)酸的測定》以及甘奕[9]的方法并稍作修改。色譜條件:LC-20AD型號高效液相色譜儀;紫外檢測器(檢測波長210 nm);色譜柱:Chromplus C18柱,250 mm×4.6 mm×5 μm;柱箱溫度30 ℃;進(jìn)樣量20 μL;流動相為0.1%(體積分?jǐn)?shù))的磷酸溶液和甲醇;流速0.5 mL/min。8種有機(jī)酸的回歸方程見表3。
表3 八種有機(jī)酸的回歸方程Table 3 Regression equations for the eight organic acids
1.3.4.4 游離氨基酸含量的測定
采用全自動氨基酸分析儀進(jìn)行測定。取1 mL樣品,加入1 mL 30 g/L的5-磺基水楊酸溶液,4 ℃靜置30 min取出,加入0.06 mol/L的HCl溶液0.5 mL、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的EDTA-2Na溶液0.5 mL,4 ℃,10 000 r/min離心10 min,取1 mL上清液,加入pH 3.0檸檬酸鈉緩沖溶液2 mL,4 ℃、10 000 r/min離心10 min,取上清液過0.22 μm濾膜得到待測樣品。
1.3.5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中抗氧化能力的變化
1.3.5.1 ·OH清除能力的測定
配制不同濃度的待測液,在1 mL待測液中加入1 mL 3 mmol/L的FeSO4溶液、1 mL 3 mmol/L的水楊酸-乙醇溶液和1 mL 3 mmol/L的H2O2溶液,37 ℃水浴30 min,510 nm處測定吸光度值。
1.3.5.2 ·O2-清除能力的測定
配制不同濃度待測液,參考MHATRE等[10]的方法取1 mL待測液進(jìn)行反應(yīng),加入0.5 mL 10 mmol/L的HCl溶液終止反應(yīng),325 nm處測定吸光度值。
1.3.5.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定
配制不同濃度待測液,參考EREL[11]的方法取待測液1 mL進(jìn)行試驗,反應(yīng)結(jié)束后在734 nm處測定吸光度值。
試驗平行進(jìn)行3次,采用Origin 8.1繪制圖表,采用SPSS 21.0、Excel 2007等進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
如圖1所示,經(jīng)過植物乳桿菌PMO08發(fā)酵后,復(fù)合蔬菜酵素的總體可接受度略有提升,但總體評分仍然偏低,后熟過程對復(fù)合蔬菜酵素的感官評分有顯著影響,可見其對提高復(fù)合蔬菜酵素的感官品質(zhì)十分必要。這可能是未經(jīng)發(fā)酵的復(fù)合蔬菜汁帶有較強(qiáng)青草氣味,風(fēng)味不協(xié)調(diào),導(dǎo)致香味、滋味得分較低,發(fā)酵后,復(fù)合蔬菜酵素中含有豐富的微生物代謝產(chǎn)物,豐富了滋味,但發(fā)酵后酸味過濃,影響了感官評分,后熟過程中,酵素內(nèi)部發(fā)生復(fù)雜的反應(yīng),香氣更協(xié)調(diào),總體評分上升。
圖1 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中感官評價雷達(dá)圖Fig.1 Radar chart for sensory evaluation of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening
2.2.1 理化指標(biāo)的變化
由表4可知,F(xiàn)Q中的總酸含量低,pH值相對較高,發(fā)酵后,F(xiàn)H總酸含量大幅上升,pH值降至3.40,這是由于植物乳桿菌的代謝過程產(chǎn)生了酸類物質(zhì),使總酸含量增加,pH值降低。后熟過程中,總酸含量先上升后下降,pH值總體來說變化范圍不大(3.37~3.43),與高慶超[12]的研究一致,可能是因為剛進(jìn)入后熟階段時,剩余的植物乳桿菌繼續(xù)利用糖類發(fā)酵產(chǎn)生酸類物質(zhì),后熟14 d后,剩余的菌利用、消耗有機(jī)酸,使總酸含量減少后熟過程中,還原糖和可溶性固形物含量均先升高后降低,最后趨于穩(wěn)定,可能是因為在后熟初期,剩余活菌數(shù)較少,對糖類的代謝較慢,而植物乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生了胞外多糖,消耗速率比產(chǎn)生速率慢,使發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量有所上升,而在后熟后期,糖類消耗速率增加,或胞外多糖產(chǎn)生速率降低,使發(fā)酵液中還原糖和可溶性固形物含量有所下降。[13]。
表4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中理化指標(biāo)的變化Table 4 Changes in physio-chemical indexes of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening
2.2.2 光學(xué)性質(zhì)的變化
由表5可知,在發(fā)酵、后熟過程中L*、a*、b*值發(fā)生顯著變化,F(xiàn)H與FQ相比,L*值顯著上升,a*值顯著下降,b*值顯著上升。在后熟過程中,紅度逐漸減小,體系越來越偏綠。經(jīng)過發(fā)酵后,樣品褐變程度顯著降低,色澤更鮮亮,與L*值反應(yīng)情況一致,樣品濁度顯著降低,隨著后熟的進(jìn)行,褐變程度顯著下降后趨于穩(wěn)定,濁度先降低后上升,這可能與多酚物質(zhì)和蛋白質(zhì)的相互作用相關(guān)[14]。
表5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中光學(xué)性質(zhì)的變化Table 5 Changes in the optical properties of compound vegetable Jiaosu during fermentation and post-ripening
2.2.3 離心沉淀率的變化
如圖2所示,發(fā)酵、后熟過程中離心沉淀率顯著下降,可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酶類,使原料中的大分子物質(zhì)降解為小分子,體系穩(wěn)定性提高。徐萌萌[15]研究發(fā)現(xiàn)果蔬汁的離心沉淀率均較高,多在7%~10%,發(fā)酵果蔬汁中可溶性固形物含量較高容易使產(chǎn)品出現(xiàn)沉淀或分層的現(xiàn)象,而本試驗中的復(fù)合蔬菜酵素后熟90 d后的離心沉淀率為3.3%,說明植物乳桿菌PMO08發(fā)酵復(fù)合蔬菜汁能顯著提高體系的穩(wěn)定性。
圖2 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中離心沉淀率的變化Fig.2 Change of centrifugal sedimentation rate during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu注:不同字母表示差異顯著(P<0.05)(下同)
2.2.4 微生物指標(biāo)的變化
如表6所示,菌落總數(shù)在發(fā)酵后略微降低,但不顯著(P>0.05),在后熟階段,菌落總數(shù)增至6.95 lg CFU/mL,這可能是發(fā)酵后,原料中的營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足微生物生長的需求,加入糖原后在短時間大量繁殖,隨著后熟的進(jìn)行,過多的糖原以及總酸的增加抑制微生物的生長繁殖,導(dǎo)致菌落總數(shù)不斷下降,也可能是因為酚類物質(zhì)的增多,在后熟期間抑制了微生物的生長繁殖。在整個發(fā)酵、后熟過程中,霉菌均未檢出。
表6 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中微生物指標(biāo)的變化Table 6 Changes in microbial indicators during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
2.3.1 總酚含量的測定
如圖3所示,發(fā)酵后總酚含量顯著增加了71%,這與KAYATH等[16]的研究結(jié)果一致,由于植物乳桿菌發(fā)酵能夠從植物細(xì)胞壁中釋放出酚類化合物[17]。同時植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵會使pH值降低,從而激活能參與復(fù)雜酚類物質(zhì)水解的各種酶,有助于簡單酚類物質(zhì)的轉(zhuǎn)化和高分子質(zhì)量酚類化合物的解聚[18],研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌產(chǎn)生的有機(jī)酸也能使原料中的酚類物質(zhì)呈游離態(tài),進(jìn)而增加總酚含量[19]。在后熟60 d后,總酚顯著下降的原因可能是酚類物質(zhì)濃度上升到一定程度后抑制了某些微生物的生長,而這些微生物為了正常繁殖會產(chǎn)生酶類,從而達(dá)到降解酚類物質(zhì)的目的[20]。但總體來說發(fā)酵和后熟均能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的總酚含量。
圖3 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中總酚含量的變化Fig.3 Changes in total phenolic content during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
2.3.2 總黃酮含量的測定
如圖4所示,發(fā)酵后總黃酮含量顯著增加。在植物內(nèi),黃酮類物質(zhì)主要以與糖結(jié)合的形式存在,經(jīng)過發(fā)酵后,糖類被消耗,黃酮類物質(zhì)析出,使發(fā)酵體系內(nèi)總黃酮含量增加,此外,與酚類類似,黃酮類物質(zhì)能在微生物發(fā)酵過程中從植物細(xì)胞內(nèi)釋放出來,從而使其含量增加。在后熟45 d達(dá)到最大值,隨后顯著下降,發(fā)酵和后熟均能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的總黃酮含量。
圖4 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中總黃酮含量的變化Fig.4 Changes in total flavonoid content during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
2.3.3 有機(jī)酸含量的測定
如表7所示,本試驗中的復(fù)合蔬菜酵素中含有酒石酸、乳酸、抗壞血酸、甲酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸7種有機(jī)酸,其中乳酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他有機(jī)酸,在發(fā)酵后樣品中乳酸含量顯著上升,達(dá)到12.98 mg/mL。在后熟期間乳酸含量略有波動,總體顯著上升,后熟90 d時乳酸質(zhì)量濃度為12.28 mg/mL。酒石酸、抗壞血酸、乙酸含量均在發(fā)酵后和后熟期間顯著上升。甲酸、檸檬酸、琥珀酸的含量在發(fā)酵后顯著降低,尤其是檸檬酸,含量由0.25 mg/mL下降到0.02 mg/mL,與YU等[21]的研究一致,在后熟過程中甲酸、檸檬酸、琥珀酸的含量不斷波動,但含量與后熟0 d相比顯著上升。
2.3.4 游離氨基酸含量的測定
如表8所示,F(xiàn)Q中含有17種游離氨基酸,發(fā)酵后,游離氨基酸含量顯著減少,蛋氨酸未檢出,這與KHAN等[22]的研究結(jié)果一致,這有可能是原料中的氨基酸為植物乳桿菌PMO08提供了氮源,這些氨基酸為其他代謝產(chǎn)物的合成提供了前體物質(zhì),或者由于復(fù)雜反應(yīng)的進(jìn)行,導(dǎo)致游離氨基酸含量顯著降低,如美拉德反應(yīng)和酶轉(zhuǎn)化等[23]。在后熟期間,半胱氨酸在后熟30 d后沒有檢出,谷氨酸含量顯著降低,其余游離氨基酸含量均顯著上升,原因可能是后熟階段剩余的植物乳桿菌利用蛋白質(zhì),將其分解產(chǎn)生氨基酸,使其含量升高。
2.4.1 ·OH清除能力的測定
如圖5所示,濃度為400 μL/mL時,所有樣品的·OH清除率均在97.85%~99.98%,F(xiàn)Q的IC50值顯著高于其他樣品(P<0.05),說明植物乳桿菌PMO08發(fā)酵能顯著增強(qiáng)復(fù)合蔬菜酵素對·OH抑制能力,在后熟期間,后熟0 d時,IC50值最大,說明后熟過程有利于增強(qiáng)復(fù)合蔬菜酵素的·OH抑制能力。
a-·OH清除率;b-·OH的半抑制濃度IC50圖5 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中·OH清除能力的變化Fig.5 Changes in hydroxyl radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
2.4.2 ·O2-清除能力的測定
如圖6所示,濃度為800 μL/mL時,·O2-清除率均在60%以上,經(jīng)發(fā)酵后·O2-清除能力減弱,隨著后熟的進(jìn)行,IC50值不斷降低,最終趨于穩(wěn)定,后熟90 d的IC50值為273.30 μL/mL,顯著低于FQ,說明后熟過程能提高復(fù)合蔬菜酵素對·O2-的抑制能力。
a-·O2-清除率;b-·O2-的半抑制濃度IC50圖6 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中·O2-清除能力的變化Fig.6 Changes in superoxide anion radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
2.4.3 ABTS陽離子自由基清除能力的測定
如圖7所示,濃度為50 μL/mL時,所有樣品的ABTS陽離子自由基清除率在93.51%~99.95%,F(xiàn)Q的清除率最低,為93.51%,其余均在98.65%以上。FQ的IC50值為12.28 μL/mL,F(xiàn)H為10.63 μL/mL,發(fā)酵后ABTS陽離子自由基清除能力增強(qiáng),后熟0 d的IC50值為8.05 μL/mL,隨著后熟的進(jìn)行,IC50值不斷降低,最終趨于穩(wěn)定,說明后熟過程能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素對ABTS陽離子自由基清除的抑制能力(P<0.05)。
a-ABTS陽離子自由基清除率;b-ABTS陽離子自由基的半抑制濃度IC50圖7 復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中ABTS陽離子自由基清除能力的變化Fig.7 Changes in ABTS free radical scavenging capacity during fermentation and post-ripening of compound vegetable Jiaosu
本研究采用茄子、奶白菜、水白菜等作為原料,用植物乳桿菌PMO08發(fā)酵,探究復(fù)合蔬菜酵素發(fā)酵、后熟過程中感官評價、理化特性、生物活性成分以及抗氧化活性的變化情況。研究發(fā)現(xiàn),植物乳桿菌PMO08發(fā)酵及后熟過程均能提高產(chǎn)品的品質(zhì),在后熟后期產(chǎn)品品質(zhì)趨于穩(wěn)定,這可能是發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量酶類,使原料中的大分子物質(zhì)降解為小分子,使產(chǎn)品更穩(wěn)定。發(fā)酵和后熟2個過程對產(chǎn)品的生物活性成分含量以及抗氧化活性有顯著影響,發(fā)酵過程能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素的·OH、ABTS陽離子自由基清除能力,后熟過程中,7種有機(jī)酸含量均顯著上升,·O2-、ABTS陽離子自由基清除能力顯著提升,這可能是發(fā)酵使多酚等生物活性成分從植物細(xì)胞壁中釋放出來,從而影響了復(fù)合蔬菜酵素的生物活性成分及其抗氧化活性。在復(fù)合蔬菜酵素生產(chǎn)過程中,不同時期的產(chǎn)品中各類物質(zhì)的含量及抗氧化活性變化顯著。綜上所述,發(fā)酵能顯著提高復(fù)合蔬菜酵素生物活性成分含量及抗氧化活性,后熟過程能使產(chǎn)品更加穩(wěn)定并進(jìn)一步提高其抗氧化活性。本文研究結(jié)果為酵素后熟過程的研究提供參考,為提高該酵素的市場競爭力提供了一定的理論基礎(chǔ),為消費者了解產(chǎn)品品質(zhì)提供了參考,促進(jìn)酵素行業(yè)健康發(fā)展。