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      具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選及抑菌物質(zhì)特性的研究

      2022-07-25 08:49:28翟佳琳趙景娜王丹丹扎木蘇陳永福
      食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年13期
      關(guān)鍵詞:排酸清液蛋白酶

      翟佳琳,趙景娜,王丹丹,扎木蘇,陳永福

      (內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特,010018)

      食品安全問(wèn)題一直影響著世界各國(guó)的公共衛(wèi)生,制約著食品工業(yè)的發(fā)展,其中食源性致病菌的污染是食品安全主要挑戰(zhàn)之一。大腸桿菌O157:H7是世界上最常見(jiàn)的食源性致病菌之一,它通過(guò)污染食物感染人體,感染劑量極低(約50 CFU),具有耐熱性、耐酸性和高度的傳染性,導(dǎo)致感染者出現(xiàn)出血性腹瀉、腸炎甚至溶血性尿毒綜合征[1]。這種致病菌存在于恒溫動(dòng)物的消化道中,通常隨糞便排泄到環(huán)境中,對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏、極端pH值和低溫等環(huán)境脅迫具有很強(qiáng)的耐受性[2]。因此,大腸桿菌O157:H7廣泛分布于水和土壤中,大多數(shù)食品易受其污染,目前,防控食品中大腸桿菌生長(zhǎng)最常見(jiàn)的方法是使用合成和天然的抗生素[3]。

      但是,根據(jù)歐洲抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(European Antimicrobial Resistance Surveilance Network,EARS-Net)報(bào)告顯示,在2013~2016年,大腸桿菌對(duì)頭孢菌素的耐藥性以及對(duì)頭孢菌素、氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物的聯(lián)合耐藥性大幅增加[4]。因此許多常見(jiàn)的感染正在變得嚴(yán)重甚至無(wú)法控制,從而導(dǎo)致更長(zhǎng)時(shí)間的疾病和更高的死亡率[5]。鑒于消費(fèi)者對(duì)感染大腸桿菌和抗生素耐藥性負(fù)面影響的認(rèn)識(shí)日益增強(qiáng),人們對(duì)開(kāi)發(fā)可用于食品工業(yè)的天然抗菌劑的興趣與日俱增。

      因此,尋找具有廣譜抑菌活性和較高穩(wěn)定性的新型天然抗菌劑對(duì)開(kāi)發(fā)抗生素替代品至關(guān)重要。泡菜作為一種常見(jiàn)的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品,是具有抑菌活性的植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)的重要來(lái)源。近年來(lái),研究者們篩選出了一些抑菌活性較強(qiáng)的植物乳桿菌,如植物乳桿菌A2和其他菌株共培養(yǎng)可以抑制白色念珠菌[6],植物乳桿菌D1和D2對(duì)腸沙門(mén)氏菌有明顯的抑制作用[7]。還有一些研究者發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì),抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附和定植來(lái)拮抗病原體[8]。根據(jù)植物乳桿菌安全無(wú)害的特性,有潛力成為天然抗菌劑的合適候選者[9]。

      本文從源于四川泡菜的114株植物乳桿菌中篩選對(duì)大腸桿菌O157:H7具有較高拮抗活性的菌株,并研究其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌特性,為其進(jìn)一步分離純化和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      實(shí)驗(yàn)所用到的114株植物乳桿菌均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從四川省泡菜樣品中分離鑒定并保藏。

      指示菌:大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、乳酸菌均由本實(shí)驗(yàn)室保藏;福氏志賀菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、蠟狀芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌,中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

      MRS肉湯培養(yǎng)基,英國(guó)賽默飛公司;LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、BHI培養(yǎng)基,廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;過(guò)氧化氫酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶,上海瑞永生物科技有限公司;脂肪酶,德國(guó)西格瑪公司;十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、Triton X-100、EDTA,北京索萊寶科技有限公司;其他藥品及試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

      1.2 儀器及設(shè)備

      SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣凈化有限公司;5810R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)艾本德股份有限公司;FE28 pH計(jì),梅特勒-托利多儀器有限公司;MLS-3751L全自動(dòng)高壓滅菌鍋,日本三洋;LRH-250電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司;HH-21-6電熱恒溫水浴鍋,天津知春科技有限公司;SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀,美谷分子儀器。

      1.3 實(shí)驗(yàn)方法

      1.3.1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選

      1.3.1.1 無(wú)細(xì)胞上清液的制備

      將供試菌株從裝有體積分?jǐn)?shù)30%甘油的凍存管中接種至MRS培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)24 h,以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量連續(xù)活化至第3代,培養(yǎng)18 h后,將菌液以8 000×g離心10 min,棄除菌體,所得上清液保存于4 ℃冰箱,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

      1.3.1.2 牛津杯雙層平板法抑菌實(shí)驗(yàn)

      把保存在體積分?jǐn)?shù)30%甘油中的指示菌傳代至LB肉湯中,于37 ℃、235 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h,用生理鹽水將指示菌稀釋成106CFU/mL的菌懸液。在平板中倒入10 mL體積分?jǐn)?shù)為1.5%的素瓊脂,凝固后放置適量牛津杯,將菌懸液與15 mL(含體積分?jǐn)?shù)0.6 %瓊脂)的MRS肉湯混勻后倒入平板,置于超凈工作臺(tái)中30 min后,用鑷子拔出牛津杯,每孔加100 μL樣品。平板置于37 ℃培養(yǎng)12 h,測(cè)量并記錄抑菌圈。

      1.3.1.3 有機(jī)酸的排除實(shí)驗(yàn)

      使用1.3.1.1所述方法制備植物乳桿菌上清液,用3 mol/L的NaOH溶液將上清液的pH值中和至5.5,以未中和的上清液作為對(duì)照,用0.22 μm濾器過(guò)濾,使用1.3.1.2所述方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn),并記錄抑菌圈。

      1.3.1.4 過(guò)氧化氫的排除實(shí)驗(yàn)

      將上清液的pH調(diào)至7,加入過(guò)氧化氫酶,使過(guò)氧化氫酶的終質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL,37 ℃孵育2 h后,以未加入過(guò)氧化氫酶的上清液為對(duì)照,中和排酸后,過(guò)0.22 μm濾膜,使用牛津杯雙層平板法評(píng)估抑菌活性。

      1.3.1.5 蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的確定

      在上清液中加入蛋白酶K,使酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,37 ℃孵育2 h,以未加蛋白酶K的上清液為對(duì)照,中和后用牛津杯法比較處理前后抑菌活性的變化。

      1.3.2 抑菌物質(zhì)的抑菌特性

      1.3.2.1 抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

      經(jīng)1.3.1.1的方法制備植物乳桿菌上清液,取12等份,將每份上清液的pH值分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12,對(duì)照組不處理,37 ℃孵育2 h后中和排酸,使用牛津杯法測(cè)試剩余抑菌活性。

      1.3.2.2 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

      將植物乳桿菌上清液各取7等份,分別在37、50、60、70、80、90、100 ℃孵育30 min,以37 ℃處理的樣品為對(duì)照,將上清液中和至pH 5.5,用0.22 μm濾器過(guò)濾,使用牛津杯法對(duì)剩余抑菌能力進(jìn)行測(cè)定。

      1.3.2.3 抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性

      將上清液調(diào)至各酶的最適工作pH,使每種酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL,以蒸餾水代替酶液作為對(duì)照組,37 ℃孵育2 h后將pH值調(diào)回5.5,測(cè)定剩余抑菌活性。

      1.3.2.4 表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

      取pH 5.5的上清液6等份,分別加入SDS、EDTA、尿素、Triton X-100、吐溫-80、吐溫-20,使各試劑終體積分?jǐn)?shù)為5%或濃度為5 mmol/L,37 ℃孵育2 h,以蒸餾水代替表面活性劑為對(duì)照,測(cè)試抑菌活性。

      1.3.2.5 金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

      配制1 mol/L的CaCl2、CuSO4、MnSO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4溶液,與上清液以1∶100的體積比混合,37 ℃孵育2 h后,以未處理的上清液為對(duì)照,排酸后測(cè)定樣品殘余的抑菌活性。

      1.3.2.6 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

      將甲醇、正丁醇、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇加到pH值為5.5的上清液中,至終體積分?jǐn)?shù)5%,37 ℃孵育2 h,以未處理的上清液為對(duì)照,將各樣品排酸后測(cè)定剩余抑菌活性。

      1.3.2.7 不同濃度NaCl對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

      在上清液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%、12%的NaCl溶液,以不加NaCl的上清液為對(duì)照,中和排酸后測(cè)定抑菌活性。

      1.3.2.8 紫外照射對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

      將上清液置于30 W紫外燈下30 cm處,在20、40、60 min時(shí)分別取樣,以未經(jīng)紫外處理上清液為對(duì)照,中和后測(cè)定殘余的抑菌活性。

      1.3.3 抑菌物質(zhì)的抑菌譜

      使用牛津杯雙層平板法制備每種指示菌的含菌平板,將上清液中和排酸后,以不中和的原液為對(duì)照,每個(gè)孔中加100 μL樣品,每種指示菌3個(gè)平行,將平板放在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),記錄最終抑菌圈大小。

      2 結(jié)果與分析

      2.1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,114株植物乳桿菌的上清液在未經(jīng)處理時(shí),pH值在4左右,均可以對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)上清液被中和排酸后,98株菌通過(guò)有機(jī)酸對(duì)指示菌進(jìn)行抑制,僅有16株菌仍有抑菌效果(表1)。

      表1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of L.plantarum with bacteriostatic activity

      將中和排酸后仍有抑菌效果的16株菌的上清液使用過(guò)氧化氫酶處理后,有13株菌的抑菌效果沒(méi)有受到影響,說(shuō)明這13株菌對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用的主要物質(zhì)并不是過(guò)氧化氫,在經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后,植物乳桿菌IMAU80043、IMAU80124、IMAU80144的抑菌活性得到明顯降低,其余13株菌的抑菌效果完全消失,證明這16株植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)可以被蛋白酶分解,具有蛋白性質(zhì),可以初步推斷抑菌物質(zhì)為抗菌肽。

      2.2 抑菌物質(zhì)的抑菌特性

      2.2.1 抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

      優(yōu)良的物理特性有利于各種抑菌物質(zhì)在食品保存中的應(yīng)用,為了篩選產(chǎn)抑菌效果好且抑菌穩(wěn)定性強(qiáng)的菌株,對(duì)3株植物乳桿菌——IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的酸堿穩(wěn)定特性進(jìn)行探究。由表1可知, IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的抑菌效果并不來(lái)自于過(guò)氧化氫,而是經(jīng)蛋白酶消化后抑菌作用大幅降低甚至完全消失,所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中,通過(guò)測(cè)定中和排酸后上清液的抑菌圈來(lái)評(píng)估菌株的抑菌活性。如圖1所示,IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)僅在pH 5和pH 6時(shí)具有抑菌活性,IMAU80028則可以耐受pH 4~6,而IMAU80122在pH 3~8時(shí)均可以抑制大腸桿菌,在pH 4~5活性最強(qiáng),隨著pH的增高抑菌作用逐漸下降,在較寬的酸性和弱堿性條件下保持良好的抑菌活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,大多數(shù)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)(如抗菌肽)都在酸性條件下能夠保持穩(wěn)定,在中性或堿性條件下活性降低甚至喪失[10],可能是由于抗菌肽分子在堿性pH下會(huì)堿裂解,如Nisin[11]。

      圖1 植物乳桿菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性Fig.1 Acid-base stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043注:圖中不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

      2.2.2 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

      由圖2可知,IMAU80122的上清液在50、60、70、80 ℃處理30 min后,抑菌物質(zhì)的剩余活力分別為88.15%、72.18%、60.68%和53.68%,IMAU80043的抑菌物質(zhì)在70 ℃時(shí)就已失去活性,而IMAU80028的抑菌物質(zhì)無(wú)法耐受熱處理。一般來(lái)說(shuō),蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其分子質(zhì)量大小成反比,所以推測(cè)IMAU80028所產(chǎn)抑菌物質(zhì)可能為熱穩(wěn)定性差的大分子蛋白。相較于其他2株植物乳桿菌,IMAU80122具有較好的熱穩(wěn)定性,故只選用IMAU80122作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試菌株。

      圖2 植物乳桿菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043

      2.2.3 抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性

      如表2所示,發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶處理后活性完全喪失,脂肪酶則不起作用,這是該抑菌物質(zhì)蛋白性質(zhì)的反映,可以初步判斷抑菌物質(zhì)是某類(lèi)抗菌肽。但經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理后抑菌活性變化不大,該抑菌物質(zhì)顯示出對(duì)胰蛋白酶具有抗性的特點(diǎn)。雖然蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)通常對(duì)蛋白水解酶敏感,但一些小分子多肽對(duì)各種蛋白酶的抗性并不少見(jiàn)[12],例如,LIU等[13]從唾液乳桿菌BGHO1中分離出的抗菌肽LS2在綠藻中表達(dá)后對(duì)蛋白酶具有完全耐受性。未來(lái)可以通過(guò)生物工程和納米顆粒的包裹來(lái)提高IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)胃腸道消化蛋白酶的穩(wěn)定性,從而用于治療人類(lèi)和動(dòng)物感染[14]。

      表2 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性Table 2 Enzymatic stability of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

      2.2.4 表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

      化學(xué)穩(wěn)定性支持了抑菌物質(zhì)的研究與應(yīng)用。如圖3所示,IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)尿素相對(duì)穩(wěn)定,表現(xiàn)出>90%的剩余抑制活性,但經(jīng)SDS、Triton X-100、吐溫-20處理后,抑菌能力出現(xiàn)了大幅度的下降,剩余活性降低到73.17%、72.91%、80.27%。相反,EDTA和吐溫-80對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性有促進(jìn)作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,在一定條件下,表面活性劑增強(qiáng)蛋白類(lèi)的抑菌作用是通過(guò)影響蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象來(lái)使蛋白質(zhì)展開(kāi),從而提高各種蛋白質(zhì)的溶解度,增強(qiáng)蛋白的活性[15]。

      圖3 表面活性劑對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.3 Effect of surfactants on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

      2.2.5 金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

      如圖4所示,和未經(jīng)金屬鹽處理的上清液相比,Ca2+的加入對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌能力造成損失,添加Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+使抗菌肽活力增強(qiáng)。YAO等[16]發(fā)現(xiàn)從海鞘中分離出的纖溶蛋白對(duì)金屬離子具有穩(wěn)定性,并且Mn2+、Mg2+、Ca2+和Na+可以增強(qiáng)其抑菌效果。抑菌物質(zhì)對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性或各種金屬離子對(duì)抑菌活性的促進(jìn)作用,原因可能是金屬離子誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化,同時(shí),一些金屬離子可以起到輔助因子的作用,使蛋白質(zhì)以可溶的形式穩(wěn)定[17]。

      圖4 金屬離子對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

      圖5 有機(jī)溶劑對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of organic solvents on antibacterial activity of antibacterial substances produced by L.plantarum IMAU80122

      2.2.6 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

      IMAU80122所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)被不同的有機(jī)溶劑處理后抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定(P>0.05),其中乙醇和三氯甲烷對(duì)抑菌物質(zhì)的活性造成了損失,但所有處理組剩余活性均在90%以上。抑菌活性的喪失可能是由于抑菌物質(zhì)被有機(jī)溶劑降解,迫使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)展開(kāi),通常會(huì)導(dǎo)致功能被破壞,甚至蛋白質(zhì)被分解[18]。

      2.2.7 鹽濃度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

      如圖6所示,4%以下的NaCl濃度不會(huì)對(duì)IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性造成影響,當(dāng)NaCl濃度高于4%時(shí),抑菌活性開(kāi)始隨著NaCl濃度的增高而明顯降低(P<0.05)。BAGDE等[19]從屎腸球菌中純化的細(xì)菌素在1%的鹽濃度中活性不會(huì)受到影響。在ZHANG等[20]的研究中,從植物乳桿菌J23中純化出的細(xì)菌素Lac-B23在鹽濃度由低到高的環(huán)境中,抑菌活性出現(xiàn)了先下降后上升的變化,但并不顯著。這與本研究的結(jié)果不盡相同,可能與抑菌物質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

      圖6 不同鹽濃度對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.6 Effects of different salt concentrations on the antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

      2.2.8 紫外照射對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

      如圖7所示,該抑菌物質(zhì)在紫外照射40和60 min時(shí)活性降低較明顯,紫外線照射對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加深。冉軍艦等[21]從嗜酸乳桿菌中提純的抗菌肽在紫外線照射30 min后抑菌效果無(wú)明顯變化,僅在紫外線照射1 h后抑菌圈顯著減小。舒梨等[22]對(duì)副干酪乳桿菌產(chǎn)生的抗菌肽研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律,與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

      圖7 紫外照射對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.7 Effects of ultraviolet irradiation on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

      2.3 抑菌物質(zhì)的抑菌譜

      由表3可知,植物乳桿菌IMAU80122對(duì)革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌和革蘭氏陰性(G-)菌均有抑菌效果,其中對(duì)G-菌,如大腸埃希氏菌、腸沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌有非常強(qiáng)的抑菌活性。

      表3 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜Table 3 Bacteriostatic spectrum of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

      對(duì)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌和阪崎腸桿菌稍弱(圖8-a~圖8-g);對(duì)G+菌,如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌有一定的抑制作用(圖8-h~圖8-k);對(duì)真菌的抑制作用較差,其中僅對(duì)芽枝狀枝孢表現(xiàn)出較弱的抑菌作用,對(duì)串珠鐮刀菌、黑曲霉和釀酒酵母無(wú)抑菌活性。從整體來(lái)看,相比G+菌,G-菌對(duì)IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)更為敏感;同時(shí),該抑菌物質(zhì)對(duì)供試的乳酸菌均無(wú)抑菌活性,包括與其親緣性近的種屬,這與國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌所產(chǎn)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的抑菌譜報(bào)道相一致[23],同其他文獻(xiàn)相比,IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在抑制食源性致病菌的方面具有很大優(yōu)勢(shì),說(shuō)明該抑菌物質(zhì)有潛力作為食品防腐劑添加在食品中,對(duì)控制食品安全也具有重要的意義。

      a-腸沙門(mén)氏菌;b-大腸埃希氏菌;c-銅綠假單胞菌;d-副溶血性弧菌;e-阪崎克羅諾桿菌;f-福氏志賀氏菌;g-熒光假單胞菌;h-蠟狀芽孢桿菌;i-產(chǎn)氣莢膜梭菌;j-單增李斯特氏菌;k-金黃葡萄球菌圖8 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)不同指示菌的抑菌圈Fig.8 Bacteriostatic zone of L.plantarum IMAU80122 on different indicator bacteria注:圖中孔直徑均為8 mm,孔周深色部分為樣品對(duì)指示菌的抑菌區(qū)域

      3 結(jié)論

      本研究利用牛津杯雙層瓊脂打孔法從114株分離自四川泡菜的植物乳桿菌中,篩選出16株產(chǎn)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的菌株。進(jìn)一步對(duì)3株菌IMAU80122、IMAU80028和IMAU80043的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較,得到一株抑菌活性強(qiáng)且抑菌特性良好的植物乳桿菌——IMAU80122。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)G+菌株和G-菌株均具有抑制效果,其中對(duì)G-菌的抑制效果更好,但對(duì)供試的乳酸菌均沒(méi)有抑菌活性;并且植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有耐酸、耐堿的特性,具有一定的熱穩(wěn)定性,對(duì)不同的表面活性劑、有機(jī)溶劑、金屬離子、紫外照射和鹽濃度均具有良好的耐受性,這些特性將有助于其進(jìn)一步的分離純化,同時(shí)也有利于其作為食品、醫(yī)藥添加劑的商業(yè)化應(yīng)用。

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