具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選及抑菌物質(zhì)特性的研究

翟佳琳，趙景娜，王丹丹，扎木蘇，陳永福

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古 呼和浩特，010018)

食品安全問(wèn)題一直影響著世界各國(guó)的公共衛(wèi)生，制約著食品工業(yè)的發(fā)展，其中食源性致病菌的污染是食品安全主要挑戰(zhàn)之一。大腸桿菌O157:H7是世界上最常見(jiàn)的食源性致病菌之一，它通過(guò)污染食物感染人體，感染劑量極低(約50 CFU)，具有耐熱性、耐酸性和高度的傳染性，導(dǎo)致感染者出現(xiàn)出血性腹瀉、腸炎甚至溶血性尿毒綜合征[1]。這種致病菌存在于恒溫動(dòng)物的消化道中，通常隨糞便排泄到環(huán)境中，對(duì)營(yíng)養(yǎng)缺乏、極端pH值和低溫等環(huán)境脅迫具有很強(qiáng)的耐受性[2]。因此，大腸桿菌O157:H7廣泛分布于水和土壤中，大多數(shù)食品易受其污染，目前，防控食品中大腸桿菌生長(zhǎng)最常見(jiàn)的方法是使用合成和天然的抗生素[3]。

但是，根據(jù)歐洲抗生素耐藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)(European Antimicrobial Resistance Surveilance Network，EARS-Net)報(bào)告顯示，在2013～2016年，大腸桿菌對(duì)頭孢菌素的耐藥性以及對(duì)頭孢菌素、氟喹諾酮類(lèi)和氨基糖苷類(lèi)藥物的聯(lián)合耐藥性大幅增加[4]。因此許多常見(jiàn)的感染正在變得嚴(yán)重甚至無(wú)法控制，從而導(dǎo)致更長(zhǎng)時(shí)間的疾病和更高的死亡率[5]。鑒于消費(fèi)者對(duì)感染大腸桿菌和抗生素耐藥性負(fù)面影響的認(rèn)識(shí)日益增強(qiáng)，人們對(duì)開(kāi)發(fā)可用于食品工業(yè)的天然抗菌劑的興趣與日俱增。

因此，尋找具有廣譜抑菌活性和較高穩(wěn)定性的新型天然抗菌劑對(duì)開(kāi)發(fā)抗生素替代品至關(guān)重要。泡菜作為一種常見(jiàn)的中國(guó)傳統(tǒng)發(fā)酵食品，是具有抑菌活性的植物乳桿菌(Lactiplantibacillusplantarum)的重要來(lái)源。近年來(lái)，研究者們篩選出了一些抑菌活性較強(qiáng)的植物乳桿菌，如植物乳桿菌A2和其他菌株共培養(yǎng)可以抑制白色念珠菌[6]，植物乳桿菌D1和D2對(duì)腸沙門(mén)氏菌有明顯的抑制作用[7]。還有一些研究者發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌通過(guò)產(chǎn)生細(xì)菌素等抗菌物質(zhì)，抑制病原菌在腸道內(nèi)的黏附和定植來(lái)拮抗病原體[8]。根據(jù)植物乳桿菌安全無(wú)害的特性，有潛力成為天然抗菌劑的合適候選者[9]。

本文從源于四川泡菜的114株植物乳桿菌中篩選對(duì)大腸桿菌O157：H7具有較高拮抗活性的菌株，并研究其所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌特性，為其進(jìn)一步分離純化和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)所用到的114株植物乳桿菌均由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期從四川省泡菜樣品中分離鑒定并保藏。

指示菌：大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、乳酸菌均由本實(shí)驗(yàn)室保藏；福氏志賀菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、熒光假單胞菌、副溶血弧菌、蠟狀芽孢桿菌、阪崎克羅諾桿菌，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

MRS肉湯培養(yǎng)基，英國(guó)賽默飛公司；LB肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、BHI培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；過(guò)氧化氫酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶，上海瑞永生物科技有限公司；脂肪酶，德國(guó)西格瑪公司；十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate，SDS)、Triton X-100、EDTA，北京索萊寶科技有限公司；其他藥品及試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器及設(shè)備

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣凈化有限公司；5810R高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份有限公司；FE28 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；MLS-3751L全自動(dòng)高壓滅菌鍋，日本三洋；LRH-250電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；HH-21-6電熱恒溫水浴鍋，天津知春科技有限公司；SpectraMax M2多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選

1.3.1.1 無(wú)細(xì)胞上清液的制備

將供試菌株從裝有體積分?jǐn)?shù)30%甘油的凍存管中接種至MRS培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，以體積分?jǐn)?shù)2%的接種量連續(xù)活化至第3代，培養(yǎng)18 h后，將菌液以8 000×g離心10 min，棄除菌體，所得上清液保存于4 ℃冰箱，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.1.2 牛津杯雙層平板法抑菌實(shí)驗(yàn)

把保存在體積分?jǐn)?shù)30%甘油中的指示菌傳代至LB肉湯中，于37 ℃、235 r/min的搖床中培養(yǎng)12 h，用生理鹽水將指示菌稀釋成106CFU/mL的菌懸液。在平板中倒入10 mL體積分?jǐn)?shù)為1.5%的素瓊脂，凝固后放置適量牛津杯，將菌懸液與15 mL(含體積分?jǐn)?shù)0.6 %瓊脂)的MRS肉湯混勻后倒入平板，置于超凈工作臺(tái)中30 min后，用鑷子拔出牛津杯，每孔加100 μL樣品。平板置于37 ℃培養(yǎng)12 h，測(cè)量并記錄抑菌圈。

1.3.1.3 有機(jī)酸的排除實(shí)驗(yàn)

使用1.3.1.1所述方法制備植物乳桿菌上清液，用3 mol/L的NaOH溶液將上清液的pH值中和至5.5，以未中和的上清液作為對(duì)照，用0.22 μm濾器過(guò)濾，使用1.3.1.2所述方法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，并記錄抑菌圈。

1.3.1.4 過(guò)氧化氫的排除實(shí)驗(yàn)

將上清液的pH調(diào)至7，加入過(guò)氧化氫酶，使過(guò)氧化氫酶的終質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL，37 ℃孵育2 h后，以未加入過(guò)氧化氫酶的上清液為對(duì)照，中和排酸后，過(guò)0.22 μm濾膜，使用牛津杯雙層平板法評(píng)估抑菌活性。

1.3.1.5 蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的確定

在上清液中加入蛋白酶K，使酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，37 ℃孵育2 h，以未加蛋白酶K的上清液為對(duì)照，中和后用牛津杯法比較處理前后抑菌活性的變化。

1.3.2 抑菌物質(zhì)的抑菌特性

1.3.2.1 抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

經(jīng)1.3.1.1的方法制備植物乳桿菌上清液，取12等份，將每份上清液的pH值分別調(diào)至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，對(duì)照組不處理，37 ℃孵育2 h后中和排酸，使用牛津杯法測(cè)試剩余抑菌活性。

1.3.2.2 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

將植物乳桿菌上清液各取7等份，分別在37、50、60、70、80、90、100 ℃孵育30 min，以37 ℃處理的樣品為對(duì)照，將上清液中和至pH 5.5，用0.22 μm濾器過(guò)濾，使用牛津杯法對(duì)剩余抑菌能力進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2.3 抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性

將上清液調(diào)至各酶的最適工作pH，使每種酶的終質(zhì)量濃度為1 mg/mL，以蒸餾水代替酶液作為對(duì)照組，37 ℃孵育2 h后將pH值調(diào)回5.5，測(cè)定剩余抑菌活性。

1.3.2.4 表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

取pH 5.5的上清液6等份，分別加入SDS、EDTA、尿素、Triton X-100、吐溫-80、吐溫-20，使各試劑終體積分?jǐn)?shù)為5%或濃度為5 mmol/L，37 ℃孵育2 h，以蒸餾水代替表面活性劑為對(duì)照，測(cè)試抑菌活性。

1.3.2.5 金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

配制1 mol/L的CaCl2、CuSO4、MnSO4、MgSO4、FeSO4、ZnSO4溶液，與上清液以1∶100的體積比混合，37 ℃孵育2 h后，以未處理的上清液為對(duì)照，排酸后測(cè)定樣品殘余的抑菌活性。

1.3.2.6 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

將甲醇、正丁醇、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異丙醇加到pH值為5.5的上清液中，至終體積分?jǐn)?shù)5%，37 ℃孵育2 h，以未處理的上清液為對(duì)照，將各樣品排酸后測(cè)定剩余抑菌活性。

1.3.2.7 不同濃度NaCl對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

在上清液中分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、4%、6%、8%、10%、12%的NaCl溶液，以不加NaCl的上清液為對(duì)照，中和排酸后測(cè)定抑菌活性。

1.3.2.8 紫外照射對(duì)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響

將上清液置于30 W紫外燈下30 cm處，在20、40、60 min時(shí)分別取樣，以未經(jīng)紫外處理上清液為對(duì)照，中和后測(cè)定殘余的抑菌活性。

1.3.3 抑菌物質(zhì)的抑菌譜

使用牛津杯雙層平板法制備每種指示菌的含菌平板，將上清液中和排酸后，以不中和的原液為對(duì)照，每個(gè)孔中加100 μL樣品，每種指示菌3個(gè)平行，將平板放在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，記錄最終抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，114株植物乳桿菌的上清液在未經(jīng)處理時(shí)，pH值在4左右，均可以對(duì)大腸桿菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用。當(dāng)上清液被中和排酸后，98株菌通過(guò)有機(jī)酸對(duì)指示菌進(jìn)行抑制，僅有16株菌仍有抑菌效果(表1)。

表1 具有抑菌活性植物乳桿菌的篩選結(jié)果Table 1 Screening results of L.plantarum with bacteriostatic activity

將中和排酸后仍有抑菌效果的16株菌的上清液使用過(guò)氧化氫酶處理后，有13株菌的抑菌效果沒(méi)有受到影響，說(shuō)明這13株菌對(duì)大腸桿菌產(chǎn)生抑制作用的主要物質(zhì)并不是過(guò)氧化氫，在經(jīng)過(guò)蛋白酶K處理后，植物乳桿菌IMAU80043、IMAU80124、IMAU80144的抑菌活性得到明顯降低，其余13株菌的抑菌效果完全消失，證明這16株植物乳桿菌的抑菌物質(zhì)可以被蛋白酶分解，具有蛋白性質(zhì)，可以初步推斷抑菌物質(zhì)為抗菌肽。

2.2 抑菌物質(zhì)的抑菌特性

2.2.1 抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性

優(yōu)良的物理特性有利于各種抑菌物質(zhì)在食品保存中的應(yīng)用，為了篩選產(chǎn)抑菌效果好且抑菌穩(wěn)定性強(qiáng)的菌株，對(duì)3株植物乳桿菌——IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的酸堿穩(wěn)定特性進(jìn)行探究。由表1可知， IMAU80028、IMAU80043和IMAU80122的抑菌效果并不來(lái)自于過(guò)氧化氫，而是經(jīng)蛋白酶消化后抑菌作用大幅降低甚至完全消失，所以在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)測(cè)定中和排酸后上清液的抑菌圈來(lái)評(píng)估菌株的抑菌活性。如圖1所示，IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)僅在pH 5和pH 6時(shí)具有抑菌活性，IMAU80028則可以耐受pH 4～6，而IMAU80122在pH 3～8時(shí)均可以抑制大腸桿菌，在pH 4～5活性最強(qiáng)，隨著pH的增高抑菌作用逐漸下降，在較寬的酸性和弱堿性條件下保持良好的抑菌活性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大多數(shù)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)(如抗菌肽)都在酸性條件下能夠保持穩(wěn)定，在中性或堿性條件下活性降低甚至喪失[10]，可能是由于抗菌肽分子在堿性pH下會(huì)堿裂解，如Nisin[11]。

圖1 植物乳桿菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性Fig.1 Acid-base stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043注：圖中不同字母代表差異顯著(P<0.05)(下同)

2.2.2 抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性

由圖2可知，IMAU80122的上清液在50、60、70、80 ℃處理30 min后，抑菌物質(zhì)的剩余活力分別為88.15%、72.18%、60.68%和53.68%，IMAU80043的抑菌物質(zhì)在70 ℃時(shí)就已失去活性，而IMAU80028的抑菌物質(zhì)無(wú)法耐受熱處理。一般來(lái)說(shuō)，蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性與其分子質(zhì)量大小成反比，所以推測(cè)IMAU80028所產(chǎn)抑菌物質(zhì)可能為熱穩(wěn)定性差的大分子蛋白。相較于其他2株植物乳桿菌，IMAU80122具有較好的熱穩(wěn)定性，故只選用IMAU80122作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的供試菌株。

圖2 植物乳桿菌IMAU80122、IMAU80028、IMAU80043所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性Fig.2 Thermal stability of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122, IMAU80028 and IMAU80043

2.2.3 抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性

如表2所示，發(fā)酵上清液經(jīng)胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶處理后活性完全喪失，脂肪酶則不起作用，這是該抑菌物質(zhì)蛋白性質(zhì)的反映，可以初步判斷抑菌物質(zhì)是某類(lèi)抗菌肽。但經(jīng)過(guò)胰蛋白酶處理后抑菌活性變化不大，該抑菌物質(zhì)顯示出對(duì)胰蛋白酶具有抗性的特點(diǎn)。雖然蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)通常對(duì)蛋白水解酶敏感，但一些小分子多肽對(duì)各種蛋白酶的抗性并不少見(jiàn)[12]，例如，LIU等[13]從唾液乳桿菌BGHO1中分離出的抗菌肽LS2在綠藻中表達(dá)后對(duì)蛋白酶具有完全耐受性。未來(lái)可以通過(guò)生物工程和納米顆粒的包裹來(lái)提高IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)胃腸道消化蛋白酶的穩(wěn)定性，從而用于治療人類(lèi)和動(dòng)物感染[14]。

表2 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的酶穩(wěn)定性Table 2 Enzymatic stability of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.4 表面活性劑對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

化學(xué)穩(wěn)定性支持了抑菌物質(zhì)的研究與應(yīng)用。如圖3所示，IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)尿素相對(duì)穩(wěn)定，表現(xiàn)出>90%的剩余抑制活性，但經(jīng)SDS、Triton X-100、吐溫-20處理后，抑菌能力出現(xiàn)了大幅度的下降，剩余活性降低到73.17%、72.91%、80.27%。相反，EDTA和吐溫-80對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌活性有促進(jìn)作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，在一定條件下，表面活性劑增強(qiáng)蛋白類(lèi)的抑菌作用是通過(guò)影響蛋白質(zhì)的三維構(gòu)象來(lái)使蛋白質(zhì)展開(kāi)，從而提高各種蛋白質(zhì)的溶解度，增強(qiáng)蛋白的活性[15]。

圖3 表面活性劑對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.3 Effect of surfactants on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.5 金屬離子對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

如圖4所示，和未經(jīng)金屬鹽處理的上清液相比，Ca2+的加入對(duì)抑菌物質(zhì)的抑菌能力造成損失，添加Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+使抗菌肽活力增強(qiáng)。YAO等[16]發(fā)現(xiàn)從海鞘中分離出的纖溶蛋白對(duì)金屬離子具有穩(wěn)定性，并且Mn2+、Mg2+、Ca2+和Na+可以增強(qiáng)其抑菌效果。抑菌物質(zhì)對(duì)金屬離子的穩(wěn)定性或各種金屬離子對(duì)抑菌活性的促進(jìn)作用，原因可能是金屬離子誘導(dǎo)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的構(gòu)象變化，同時(shí)，一些金屬離子可以起到輔助因子的作用，使蛋白質(zhì)以可溶的形式穩(wěn)定[17]。

圖4 金屬離子對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.4 Effect of metal ions on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

圖5 有機(jī)溶劑對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.5 Effect of organic solvents on antibacterial activity of antibacterial substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.6 有機(jī)溶劑對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

IMAU80122所產(chǎn)的抑菌物質(zhì)被不同的有機(jī)溶劑處理后抑菌活性相對(duì)穩(wěn)定(P>0.05)，其中乙醇和三氯甲烷對(duì)抑菌物質(zhì)的活性造成了損失，但所有處理組剩余活性均在90%以上。抑菌活性的喪失可能是由于抑菌物質(zhì)被有機(jī)溶劑降解，迫使蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)展開(kāi)，通常會(huì)導(dǎo)致功能被破壞，甚至蛋白質(zhì)被分解[18]。

2.2.7 鹽濃度對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

如圖6所示，4%以下的NaCl濃度不會(huì)對(duì)IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的活性造成影響，當(dāng)NaCl濃度高于4%時(shí)，抑菌活性開(kāi)始隨著NaCl濃度的增高而明顯降低(P<0.05)。BAGDE等[19]從屎腸球菌中純化的細(xì)菌素在1%的鹽濃度中活性不會(huì)受到影響。在ZHANG等[20]的研究中，從植物乳桿菌J23中純化出的細(xì)菌素Lac-B23在鹽濃度由低到高的環(huán)境中，抑菌活性出現(xiàn)了先下降后上升的變化，但并不顯著。這與本研究的結(jié)果不盡相同，可能與抑菌物質(zhì)自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

圖6 不同鹽濃度對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.6 Effects of different salt concentrations on the antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.2.8 紫外照射對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響

如圖7所示，該抑菌物質(zhì)在紫外照射40和60 min時(shí)活性降低較明顯，紫外線照射對(duì)抑菌物質(zhì)活性的影響隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸加深。冉軍艦等[21]從嗜酸乳桿菌中提純的抗菌肽在紫外線照射30 min后抑菌效果無(wú)明顯變化，僅在紫外線照射1 h后抑菌圈顯著減小。舒梨等[22]對(duì)副干酪乳桿菌產(chǎn)生的抗菌肽研究中也發(fā)現(xiàn)了同樣的規(guī)律，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

圖7 紫外照射對(duì)植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.7 Effects of ultraviolet irradiation on antibacterial activity of bacteriostatic substances produced by L.plantarum IMAU80122

2.3 抑菌物質(zhì)的抑菌譜

由表3可知，植物乳桿菌IMAU80122對(duì)革蘭氏陽(yáng)性(G+)菌和革蘭氏陰性(G-)菌均有抑菌效果，其中對(duì)G-菌，如大腸埃希氏菌、腸沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌有非常強(qiáng)的抑菌活性。

表3 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)的抑菌譜Table 3 Bacteriostatic spectrum of bacteriostatic substance produced by L.plantarum IMAU80122

對(duì)熒光假單胞菌、銅綠假單胞菌、福氏志賀菌和阪崎腸桿菌稍弱(圖8-a～圖8-g)；對(duì)G+菌，如金黃色葡萄球菌、單增李斯特氏菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、蠟狀芽孢桿菌有一定的抑制作用(圖8-h～圖8-k)；對(duì)真菌的抑制作用較差，其中僅對(duì)芽枝狀枝孢表現(xiàn)出較弱的抑菌作用，對(duì)串珠鐮刀菌、黑曲霉和釀酒酵母無(wú)抑菌活性。從整體來(lái)看，相比G+菌，G-菌對(duì)IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)更為敏感；同時(shí)，該抑菌物質(zhì)對(duì)供試的乳酸菌均無(wú)抑菌活性，包括與其親緣性近的種屬，這與國(guó)內(nèi)外對(duì)乳酸菌所產(chǎn)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的抑菌譜報(bào)道相一致[23]，同其他文獻(xiàn)相比，IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)在抑制食源性致病菌的方面具有很大優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)有潛力作為食品防腐劑添加在食品中，對(duì)控制食品安全也具有重要的意義。

a-腸沙門(mén)氏菌；b-大腸埃希氏菌；c-銅綠假單胞菌；d-副溶血性弧菌；e-阪崎克羅諾桿菌；f-福氏志賀氏菌；g-熒光假單胞菌；h-蠟狀芽孢桿菌；i-產(chǎn)氣莢膜梭菌；j-單增李斯特氏菌；k-金黃葡萄球菌圖8 植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)不同指示菌的抑菌圈Fig.8 Bacteriostatic zone of L.plantarum IMAU80122 on different indicator bacteria注：圖中孔直徑均為8 mm，孔周深色部分為樣品對(duì)指示菌的抑菌區(qū)域

3 結(jié)論

本研究利用牛津杯雙層瓊脂打孔法從114株分離自四川泡菜的植物乳桿菌中，篩選出16株產(chǎn)蛋白類(lèi)抑菌物質(zhì)的菌株。進(jìn)一步對(duì)3株菌IMAU80122、IMAU80028和IMAU80043的酸堿穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性進(jìn)行比較，得到一株抑菌活性強(qiáng)且抑菌特性良好的植物乳桿菌——IMAU80122。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)對(duì)G+菌株和G-菌株均具有抑制效果，其中對(duì)G-菌的抑制效果更好，但對(duì)供試的乳酸菌均沒(méi)有抑菌活性；并且植物乳桿菌IMAU80122所產(chǎn)抑菌物質(zhì)具有耐酸、耐堿的特性，具有一定的熱穩(wěn)定性，對(duì)不同的表面活性劑、有機(jī)溶劑、金屬離子、紫外照射和鹽濃度均具有良好的耐受性，這些特性將有助于其進(jìn)一步的分離純化，同時(shí)也有利于其作為食品、醫(yī)藥添加劑的商業(yè)化應(yīng)用。