重組大腸桿菌產(chǎn)鹵代烷脫鹵酶的發(fā)酵條件優(yōu)化

名曉東，郭自濤，陳劍雄，顧正華，辛瑜，孫海彥，關(guān)彥明，張梁*

1(江南大學(xué) 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)2(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所，海南 ?？冢?71101)3(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015)

工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中會(huì)產(chǎn)生大量的鹵代化合物，這些化合物具有高毒性、持久性以及生物濃縮性，對(duì)人類健康以及生態(tài)環(huán)境構(gòu)成了巨大的危害[1-2]。傳統(tǒng)的化學(xué)消解、焚燒等處理方法在處理過程中會(huì)產(chǎn)生新的有毒副產(chǎn)品。同時(shí)，這些化學(xué)試劑大多屬于有毒試劑，使用時(shí)或使用后會(huì)產(chǎn)生新的環(huán)境污染問題。因此，迫切需要開發(fā)安全、綠色的處理方法[3]。生物酶處理法具有溫和、環(huán)保、無(wú)毒、無(wú)腐蝕的特點(diǎn)，逐漸成為治理環(huán)境污染物的研究熱點(diǎn)。

鹵代烷脫鹵酶(EC3.8.1.5，HLDs)是一類能夠催化鹵代烷烴化合物碳-鹵鍵斷裂的水解酶，可以將底物轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醇、鹵素離子與質(zhì)子，整個(gè)酶促反應(yīng)過程中僅需水作為唯一的輔助因子，不需要輔酶/輔基或者氧的參與[4]。此外，其底物譜比較廣泛，可以催化氯代、溴代、碘代烷烴、環(huán)烷烴、酯、醚、環(huán)氧化物等化合物的水解[5]。基于其底物的多功能性，HLDs在多種領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，例如工業(yè)催化、環(huán)境污染物的降解、化學(xué)過程副產(chǎn)品的回收、環(huán)境污染物的生物傳感以及蛋白分析與分子成像等[4,6-8]。DhaA是最具有代表性的鹵代烷烴脫鹵酶之一，該基因最早從RhodococcusrhodochrousNCIMB 13064中分離出來[9]，DhaA不僅對(duì)工業(yè)副產(chǎn)品三氯苯酚有降解作用[10]，同時(shí)對(duì)糜爛性毒劑芥子氣也有一定的降解作用[11]。然而，其廣泛的應(yīng)用目前主要受限于酶的穩(wěn)定性與產(chǎn)量方面[12]。目前，對(duì)于此酶的研究主要通過定點(diǎn)突變提高酶的催化效率及熱穩(wěn)定性[13-15]；通過固定化的手段提高酶的溫度、pH、金屬離子、有機(jī)溶劑耐受性以及儲(chǔ)藏穩(wěn)定性[16-18]。然而，對(duì)于提高其表達(dá)量的研究較少。因此，在提升其穩(wěn)定性的同時(shí)，提高酶的表達(dá)量將促進(jìn)其生產(chǎn)應(yīng)用。

本研究中，對(duì)已構(gòu)建好的重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA在搖瓶中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)基與發(fā)酵工藝的優(yōu)化，并在5 L發(fā)酵罐中進(jìn)行了工藝放大驗(yàn)證。本研究將為DhaA的進(jìn)一步放大生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時(shí)也將為其他種類HLD的發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌種

重組大腸桿菌BL21(DE3)/pET28a-DhaA,本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(LB)(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

基礎(chǔ)培養(yǎng)基(TB)(g/L)：甘油5，酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31, K2HPO412.54。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)(pH 7.0)：甘油10，酵母粉23，蛋白胨14，MgSO4·7H2O 1.3，ZnSO4·7H2O 0.1。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

JY92-IIDN超聲細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技有限公司；T&J Atype 5 L玻璃發(fā)酵罐，上海迪比爾生物工程有限公司；V-1200可見分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器公司；MQD-B3R搖床，上海旻泉儀器有限公司；Spark全自動(dòng)酶標(biāo)儀，TECAN公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 種子活化

將保存于-70 ℃冰箱的菌種在固體LB培養(yǎng)基進(jìn)行劃線，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)14～16 h；挑取單菌落于裝有15 mL LB培養(yǎng)基的50 mL三角瓶中37 ℃培養(yǎng)12～13 h作為一級(jí)種子液；按2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)接種量接種于裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中培養(yǎng)9 h(對(duì)數(shù)中后期)作為二級(jí)種子液。

1.3.2 粗酶液的收集

將發(fā)酵后的菌體轉(zhuǎn)移至離心管進(jìn)行收集，使用0.1 mol/L的Gly-NaOH(pH 8.6)緩沖液將菌體洗滌2遍后進(jìn)行超聲破碎。破碎完畢離心去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。

1.3.3 酶活力的測(cè)定

酶活力定義：在一定條件下，1 min催化底物產(chǎn)生1 μmol Cl-所需的酶量定義為1個(gè)酶活力單位。

酶活力測(cè)定方法：雙(2-氯乙基)醚作為底物，總反應(yīng)體系500 μL，緩沖液為0.1 mol/L Gly-NaOH，底物的終濃度為10 mmol/L，加酶量為10 μL粗酶液。40 ℃反應(yīng)20 min后，吸取200 μL加入裝有20 μL 30%(體積分?jǐn)?shù))HNO3離心管中終止反應(yīng)，之后加入55 μL Hg(SCN)2溶液和110 μL NH4Fe(SO4)2溶液，混勻靜置10 min后取200 μL加入96孔板中，使用酶標(biāo)儀測(cè)量在460 nm下的吸光度[16,19]。

1.3.4 SDS-PAGE

將發(fā)酵取樣的菌體濃度稀釋至同一水平，0.1 mol/L的Gly-NaOH(pH 8.6)緩沖液洗滌2遍后進(jìn)行超聲破碎，離心去除細(xì)胞碎片，上清液即為粗酶液。取20 μL的上清液，加入5 μL上樣緩沖液，沸水浴10 min后，離心，上樣量均為10 μL。電泳結(jié)束后，進(jìn)行染色脫色處理。

1.4 初始培養(yǎng)方法

以2%接種量將二級(jí)種子液接種于50 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中(250 mL三角瓶)，37 ℃培養(yǎng)至OD600=0.8時(shí)加入終濃度為0.5 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG)25 ℃誘導(dǎo)13 h。

1.5 培養(yǎng)基優(yōu)化

1.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以O(shè)D600與酶活力為指標(biāo)，依次以碳源種類、碳源濃度、氮源種類、氮源濃度、磷酸鹽濃度、無(wú)機(jī)鹽種類、無(wú)機(jī)鹽濃度、金屬離子種類以及金屬離子濃度為影響因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)。

1.5.2 Plackett-Burman(PB)實(shí)驗(yàn)

在單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)培養(yǎng)基成分進(jìn)行關(guān)鍵因素的篩選，各因素選取2個(gè)水平，高水平為低水平的1.5倍，以酶活力作為實(shí)驗(yàn)響應(yīng)值進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 PB實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平 單位：g/LTable 1 Factors and levels of PB experimental design

1.5.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

以PB實(shí)驗(yàn)篩選出的3個(gè)顯著影響因素(酵母粉濃度、蛋白胨濃度、MgSO4·7H2O濃度)為實(shí)驗(yàn)因素進(jìn)行Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素設(shè)置3個(gè)實(shí)驗(yàn)水平，以酶活力作為響應(yīng)值。實(shí)驗(yàn)水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平 單位：g/LTable 2 Factors and levels of Box-Behnken experimental design

1.6 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

在優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵條件中的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、接種量、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、裝液量進(jìn)行優(yōu)化。

1.7 發(fā)酵罐驗(yàn)證

分批發(fā)酵：5 L發(fā)酵罐中，2.5 L的初始裝液量，接種量為5%。接種前加入一定量的卡那霉素，使其終質(zhì)量濃度為50 mg/L，通氣比為1 vvm，溶氧為30%，溶氧與轉(zhuǎn)速進(jìn)行偶聯(lián)，pH 7.0，使用10%(體積分?jǐn)?shù))硫酸與50%(體積分?jǐn)?shù))氨水進(jìn)行pH的調(diào)控。37 ℃培養(yǎng)4 h后，溫度降至20 ℃，加入終濃度為0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

補(bǔ)料分批發(fā)酵：在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上恒速流加50%(體積分?jǐn)?shù))的甘油，溶氧反彈作為流加甘油的標(biāo)志。

1.8 數(shù)據(jù)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。應(yīng)用Excel 2013和Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并使用Origin 2019作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 培養(yǎng)基優(yōu)化

2.1.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)培養(yǎng)基碳源的優(yōu)化

以相同質(zhì)量濃度的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、糊精、蔗糖、淀粉替換基礎(chǔ)培養(yǎng)基的甘油，誘導(dǎo)13 h后測(cè)定菌體濃度與酶活力，不同碳源對(duì)重組菌的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶情況如圖1-a所示。以甘油作為碳源時(shí)，菌體的酶活力最大，達(dá)到(610.44±4.16) U/L。雖然葡萄糖是常見的速效碳源，適合菌體的生長(zhǎng)，但總產(chǎn)酶水平與單位菌體產(chǎn)酶水平均比甘油效果差，這可能是由于葡萄糖會(huì)降低含有Lac啟動(dòng)子重組菌胞內(nèi)的cAMP水平，對(duì)誘導(dǎo)物的利用有抑制作用，進(jìn)而會(huì)降低其產(chǎn)酶水平[20]。并且，考慮到葡萄糖的快速利用容易產(chǎn)生大量乙酸，抑制菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物的形成[21]，因此選擇甘油作為最適碳源。碳源濃度對(duì)酶活力的影響如圖1-b所示，隨著碳源濃度的增加，菌體的產(chǎn)酶水平呈現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，當(dāng)甘油添加量達(dá)到10 g/L時(shí)，菌體的產(chǎn)酶水平最高，達(dá)到(592.11±12.98)U/L，因此選擇10 g/L的甘油作為碳源。

a-碳源種類;b-甘油添加量圖1 碳源對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Influence of carbon source on fermentation

(2)培養(yǎng)基氮源的優(yōu)化

以相同質(zhì)量濃度的酵母粉、牛肉膏、玉米漿粉、蛋白胨以及硫酸銨代替培養(yǎng)基中的復(fù)合氮源，誘導(dǎo)13 h后測(cè)定菌體濃度與酶活力。結(jié)果如圖2-a所示，相對(duì)于單一的氮源成分，復(fù)合氮源下的菌體濃度與產(chǎn)酶水平均達(dá)到最高，酶活力達(dá)到(779.60±18.94) U/L。以無(wú)機(jī)氮源作氮源時(shí)，菌體濃度與產(chǎn)酶水平均為最低，說明無(wú)機(jī)氮源并不適合菌體的生長(zhǎng)與產(chǎn)酶。酵母粉與蛋白胨的復(fù)合不僅能夠提供氮源，并且可以提供維生素、礦物質(zhì)與氨基酸等。同時(shí)，酵母粉可以促進(jìn)重組大腸桿菌將重組酶釋放到周質(zhì)空間[22]。因此，選擇酵母粉與蛋白胨組成的復(fù)合氮源作為最佳氮源。酵母粉與蛋白胨的濃度優(yōu)化結(jié)果如圖2-b和圖2-c所示，最佳的酵母粉與蛋白胨質(zhì)量濃度分別為20、15 g/L，其對(duì)應(yīng)的產(chǎn)酶水平分別為(812.05±3.75)、(881.28±1.65) U/L。

a-氮源種類；b-酵母粉濃度；c-蛋白胨濃度；d-磷酸鹽濃度圖2 氮源與磷酸鹽對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of nitrogen source and phosphate on fermentation

(3)培養(yǎng)基磷酸鹽濃度的優(yōu)化

搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)13 h后測(cè)定菌體濃度與酶活力，探究磷酸鹽濃度對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖2-d所示，磷酸鹽濃度從0～180 mmol/L增加的過程中，對(duì)菌體濃度的影響并不大，酶活力出現(xiàn)了先降低后增加再降低的趨勢(shì)。不加磷酸鹽時(shí)，發(fā)酵過程中pH與對(duì)照組相比無(wú)明顯差異，并且此時(shí)的酶活力最高可達(dá)到(850.46±21.99) U/L。類似現(xiàn)象在其他酶的發(fā)酵優(yōu)化過程中也有報(bào)道，這可能是高濃度磷酸鹽對(duì)某些酶的生產(chǎn)有抑制作用[20]。同時(shí)，考慮到不添加磷酸鹽可降低廢水的污染，所以培養(yǎng)基中選擇去除磷酸鹽。

(4)培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽的優(yōu)化

無(wú)機(jī)鹽的主要作用是構(gòu)成菌體組織成分，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的滲透壓并維持某些酶的活性[23]。在培養(yǎng)基中添加NaCl、MgSO4·7H2O、CaCl2、KCl，添加量為1.0 g/L，誘導(dǎo)13 h后測(cè)定菌體濃度與酶活力，探究無(wú)機(jī)鹽對(duì)菌體產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖3-a所示，添加MgSO4·7H2O有利于菌體的產(chǎn)酶，酶活力達(dá)到(985.67±16.26)U/L。對(duì)MgSO4·7H2O的濃度優(yōu)化，如圖3-b所示，其濃度達(dá)到1.0 g/L時(shí)產(chǎn)酶最高，達(dá)到(1 101.69±38.53)U/L，所以培養(yǎng)基最終選擇添加1.0 g/L的MgSO4·7H2O。

a-無(wú)機(jī)鹽種類；b-MgSO4·7H2O濃度；c-金屬離子種類；d-ZnSO4·7H2O濃度圖3 無(wú)機(jī)鹽與金屬離子對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of inorganic salts and metal ions on fermentation

(5)培養(yǎng)基金屬離子的優(yōu)化

在培養(yǎng)基中添加0.1 g/L的ZnSO4·7H2O、CuSO4·5H2促進(jìn)鹵醇脫鹵酶表達(dá)相符。對(duì)ZnSO4·7H2O濃度優(yōu)化如圖3-d所示，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.1 g/L時(shí)，其酶活力最高可達(dá)到(1 085.13±9.00) U/L；當(dāng)其質(zhì)量濃度大于0.1 g/L時(shí)，菌體濃度與酶活力均有明顯下降，所以最佳質(zhì)量濃度設(shè)置為0.1 g/L。

2.1.2 PB實(shí)驗(yàn)

PB實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表3所示，顯著性分析結(jié)果如表4所示，模型顯著(P<0.05)，篩選出對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著影響的因素依次為酵母粉濃度(B)、蛋白胨濃度(C)、MgSO4·7H2O濃度(D)。

表3 PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 PB test results

表4 PB實(shí)驗(yàn)方差分析Table 4 PB analysis of variance

2.1.3 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

Box-Behnken的實(shí)驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)值如表5所示，顯著性分析如表6所示。此模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)，失擬值不顯著(P>0.05)，說明模型擬合度較高。對(duì)表5的數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合可得方程為：Y=1 151.71+62.36X1-16.58X2+19.96X3-95.78X1X2+16.79X1X3+30.78X2X3-151.21X1X1-67.52X2X2-15.70X3X3。該方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.996 0，可用于此菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的培養(yǎng)基優(yōu)化分析及預(yù)測(cè)。

表5 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 5 Box-Behnken experimental results

表6 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)方差分析Table 6 Box-Behnken experimental variance analysis

對(duì)響應(yīng)面的回歸方程、三維響應(yīng)面圖以及等高線圖分析后得到的最佳配比為酵母粉23 g/L、蛋白胨14 g/L、MgSO4·7H2O 1.3 g/L，酶活力的預(yù)測(cè)值為1 169.22 U/L。為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)的結(jié)果，進(jìn)行了3組平行的實(shí)驗(yàn)，酶活力為(1 182.94±10.86)U/L，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型預(yù)測(cè)的結(jié)果基本符合，比優(yōu)化前(610.44±4.16)U/L提高了93.78%，脫鹵酶的發(fā)酵水平顯著提高。

2.2 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化

(1)添加誘導(dǎo)劑的時(shí)間

異源蛋白表達(dá)的啟動(dòng)會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞正常代謝帶來負(fù)擔(dān)，對(duì)菌體濃度、蛋白表達(dá)和質(zhì)粒穩(wěn)定性都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響，過早的誘導(dǎo)不利于菌體的生長(zhǎng)，菌體濃度太低，沒有足夠量的菌體來進(jìn)行蛋白的表達(dá)；添加誘導(dǎo)劑時(shí)間太晚時(shí)，菌體積累的代謝產(chǎn)物較多，菌體趨于老化，其產(chǎn)酶能力減弱，蛋白質(zhì)的表達(dá)通常要使菌體處于一定的生長(zhǎng)水平[25]。以優(yōu)化完的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，分別在OD600達(dá)到0.6、1.2、1.8、2.6、3.4、4.4、5.6時(shí)添加誘導(dǎo)劑，25 ℃誘導(dǎo)13 h后測(cè)定菌體濃度與酶活力，如圖4-a所示，當(dāng)OD600達(dá)到1.8時(shí)(對(duì)數(shù)前期)添加誘導(dǎo)劑酶活力最大，達(dá)到(1 525.56±10.86)U/L，所以選擇在對(duì)數(shù)前期進(jìn)行誘導(dǎo)。

(2)接種量

接種量對(duì)于發(fā)酵周期與產(chǎn)物合成有著直接影響，合適的接種量縮短延遲期，減少雜菌污染的機(jī)會(huì)，接種量大時(shí)，菌體繁殖快，容易造成溶氧不足，持續(xù)生長(zhǎng)時(shí)間短，自溶也較快，不利于目的蛋白的積累[26]。如圖4-b所示，當(dāng)接種量為5%時(shí)，酶活力達(dá)到最大(1 873.22±94.16)U/L，因此，選擇5%為最佳接種量。

(3)誘導(dǎo)溫度

誘導(dǎo)溫度是影響異源蛋白表達(dá)的關(guān)鍵參數(shù)之一。低溫誘導(dǎo)通?？梢詼p少蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤折疊，但同樣會(huì)降低菌體的代謝活動(dòng)，延長(zhǎng)發(fā)酵周期，高溫誘導(dǎo)雖然可以加快代謝活動(dòng)，縮短發(fā)酵周期，但同時(shí)會(huì)由于蛋白質(zhì)折疊太快出現(xiàn)錯(cuò)誤折疊，并產(chǎn)生大量的不溶性蛋白(包涵體)[25]。如圖4-c與圖4-d所示，20 ℃誘導(dǎo)22 h的酶活力最大，達(dá)到(2 798.22±17.45)U/L。30 ℃誘導(dǎo)的菌體濃度與酶活力均受到抑制，其他重組蛋白的發(fā)酵過程中也觀察到類似的現(xiàn)象[27]，可能是由于高溫誘導(dǎo)產(chǎn)生的包涵體對(duì)菌體生長(zhǎng)和目的蛋白的可溶性表達(dá)均有抑制作用。而低于20 ℃的誘導(dǎo)溫度在發(fā)酵周期和溫度控制方面均不適合實(shí)際生產(chǎn)，所以選擇20 ℃誘導(dǎo)22 h作為最佳條件。

a-誘導(dǎo)時(shí)機(jī)；b-接種量；c-不同誘導(dǎo)溫度下的菌體生長(zhǎng)狀況；d-不同誘導(dǎo)溫度下的菌體產(chǎn)酶狀況圖4 誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、接種量及誘導(dǎo)溫度對(duì)發(fā)酵的影響Fig.4 Effects of induction time, inoculation amount and induction temperature on fermentation

(4)誘導(dǎo)劑濃度

IPTG可作為基于T7啟動(dòng)子表達(dá)載體的誘導(dǎo)劑[28]，如圖5-a所示。在低濃度時(shí)，酶活力隨著IPTG濃度的增加而增加，濃度增加至0.4 mmol/L時(shí)，其產(chǎn)酶能力達(dá)到閾值，此時(shí)的酶活力達(dá)(3 372.89±17.03)U/L，由于高濃度的IPTG對(duì)菌體有一定的毒性，繼續(xù)增加IPTG濃度對(duì)菌體濃度與酶活力均有一定抑制作用。因此，以0.4 mmol/L的誘導(dǎo)劑作為最佳誘導(dǎo)濃度。

(5)裝液量

搖瓶發(fā)酵過程中的裝液量通過影響發(fā)酵液與空氣的接觸面積來影響發(fā)酵過程中的溶氧水平，對(duì)菌體的生長(zhǎng)與蛋白的表達(dá)有著重要影響[29]。如圖5-b所示，搖瓶的溶氧水平隨著裝液量的增加而減少，裝液量達(dá)到40 mL/250 mL時(shí)達(dá)到最大酶活(3 585.83±15.02)U/L，繼續(xù)增加裝液量則由于供氧不足對(duì)菌體生長(zhǎng)與蛋白表達(dá)均產(chǎn)生了負(fù)面影響，所以最終選擇40 mL/250 mL作為最佳裝液量。

a-IPTG濃度；b-裝液量圖5 誘導(dǎo)劑濃度及裝液量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.5 Effect of inducer concentration and liquid loading amount on fermentation

2.3 5 L發(fā)酵罐放大實(shí)驗(yàn)

分批發(fā)酵結(jié)果如圖6-a所示，37 ℃培養(yǎng)4 h后，開始降溫至20 ℃并加入0.4 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，酶活力隨著菌體濃度的增加而增加，產(chǎn)物的生成與菌體濃度呈正相關(guān)。在發(fā)酵20 h時(shí)菌體濃度與酶活力達(dá)到最高，其中酶活力達(dá)到(4 496.60±141.22)U/L。圖7-a為分批發(fā)酵時(shí)的破碎上清液的蛋白電泳圖，將菌體濃度稀釋到同一水平進(jìn)行細(xì)胞破碎。上樣量一致情況下，可以明顯看出隨著誘導(dǎo)時(shí)間的增加，單位菌體的目的蛋白含量明顯增加。達(dá)到一定閾值后，總的目的蛋白含量隨著菌體濃度增加持續(xù)增加。

在分批發(fā)酵的過程中，發(fā)酵到14 h溶氧開始反彈，這可能是碳源缺乏造成。通過恒速流加一定量的甘油為發(fā)酵過程提供充足的碳源，如圖6-b所示，發(fā)酵到46 h的酶活力最高可達(dá)到(9 682.62±191.16)U/L。圖7-b為流加甘油發(fā)酵時(shí)細(xì)胞破碎上清液的蛋白電泳圖，與未流加甘油時(shí)進(jìn)行同樣的處理，可以看出隨著發(fā)酵的進(jìn)行，單位菌體的目的蛋白含量在增加，并且達(dá)到一定的閾值，菌體濃度提升的過程中，總蛋白產(chǎn)量也在增加。

a-恒定pH；b-恒定溶氧圖6 發(fā)酵罐中控制恒定pH與溶氧對(duì)發(fā)酵的影響Fig.6 Influence of constant pH and dissolved oxygen on fermentation in fermentation tank

a-分批發(fā)酵時(shí)的破碎上清液；b-流加甘油發(fā)酵時(shí)細(xì)胞破碎上清液圖7 發(fā)酵罐的蛋白電泳圖Fig.7 Protein electrophoresis of fermentation tank

3 結(jié)論

在微生物發(fā)酵過程中，培養(yǎng)基的成分與工藝對(duì)于發(fā)酵生產(chǎn)水平有著重要的影響。本研究首先在搖瓶的水平上對(duì)培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽與金屬離子進(jìn)行了單因素優(yōu)化，再通過PB實(shí)驗(yàn)與Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)其中的顯著因素進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，獲得最佳的培養(yǎng)基優(yōu)化方案。結(jié)果表明最佳的培養(yǎng)基配方為甘油10 g/L，酵母粉23 g/L，蛋白胨14 g/L，MgSO4·7H2O 1.3 g/L，ZnSO4·7H2O 0.1 g/L，優(yōu)化后培養(yǎng)基的酶活力是基礎(chǔ)培養(yǎng)基的1.94倍。優(yōu)化的最佳發(fā)酵條件為OD600達(dá)到1.8時(shí)添加誘導(dǎo)劑，接種量5%，誘導(dǎo)溫度20 ℃，誘導(dǎo)時(shí)間22 h，IPTG濃度0.4 mmol/L，裝液量40 mL/250 mL。經(jīng)過發(fā)酵條件的優(yōu)化，酶活力再次提高了3.03倍。

用5 L發(fā)酵罐對(duì)搖瓶的工藝進(jìn)行放大時(shí)，由于可以維持恒定的pH與溶氧，菌體濃度與酶活力有了進(jìn)一步的提升。當(dāng)發(fā)酵到14 h時(shí)，由于碳源的缺乏，溶氧出現(xiàn)了反彈現(xiàn)象。恒速流加甘油后，溶氧一直維持在30%，菌體濃度與酶活力較分批發(fā)酵均提高了1倍以上，最終的酶活力為搖瓶的2.7倍。通過一系列的條件優(yōu)化，鹵代烷脫鹵酶的發(fā)酵生產(chǎn)水平有了顯著提高。目前在發(fā)酵罐進(jìn)行的只是初步放大驗(yàn)證，后續(xù)可以在發(fā)酵罐上對(duì)工藝進(jìn)行優(yōu)化與放大，對(duì)補(bǔ)料策略、誘導(dǎo)策略等進(jìn)行探索以獲得更高的產(chǎn)量，為實(shí)現(xiàn)鹵代烷烴脫鹵酶(DhaA)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。