miRNA參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的調(diào)控機(jī)制及中藥干預(yù)研究的新進(jìn)展①

陳 杰 趙夜雨 高明利 （遼寧中醫(yī)藥大學(xué)，沈陽 110847）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種免疫介導(dǎo)的慢性、炎癥性自身免疫性疾病，其炎癥反應(yīng)不僅導(dǎo)致關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞，亦可引起肺部、心血管系統(tǒng)等關(guān)節(jié)外表現(xiàn)［1］。RA 發(fā)病率約為1%～3%，臨床常見于50～60 歲中年女性，若不能及時(shí)、有效治療，可發(fā)生不可逆轉(zhuǎn)的關(guān)節(jié)及器官損傷，嚴(yán)重影響患者生命健康及生活質(zhì)量［2］。目前，RA 具體發(fā)病機(jī)制尚不能完全明確，但大量研究已證實(shí)，非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在調(diào)節(jié)自身免疫與炎癥方面具有重要作用［3］。作為RA 調(diào)節(jié)因子，ncRNA 已成為RA 診斷及治療的新生物標(biāo)志物。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)度為18～25 個(gè)核苷酸的短鏈ncRNA，通過降解或翻譯抑制靶信使RNA（messenger RNA，mRNA），實(shí)現(xiàn)基因調(diào)控作用［4］。因此，進(jìn)一步闡明miRNA 參與機(jī)制可為更好地治療RA提供新的視角與思路。

1 miRNA參與RA發(fā)生發(fā)展的機(jī)制

STANCZYK 等［5］2008 年首次描述RA 異常表達(dá)的miR-155與miR-146a，證明炎癥環(huán)境對(duì)RA滑膜細(xì)胞miRNA 表達(dá)的影響，引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)于RA 及其相關(guān)miRNA 研究的重視。近年來已有眾多研究證實(shí)，miRNA 通過多種通路及途徑參與RA 發(fā)生發(fā)展，形成極其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.1 miRNA 調(diào)控RA 滑膜組織細(xì)胞 RA 關(guān)節(jié)破壞的主要原因?yàn)殛P(guān)節(jié)滑膜過度異常增殖，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocyte，F(xiàn)LS）為參與以上過程的關(guān)鍵細(xì)胞。正常情況下FLS位于滑膜內(nèi)膜襯里層，參與正常炎癥反應(yīng)，組織損傷時(shí)可調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能、修復(fù)關(guān)節(jié)囊、重塑基質(zhì)。RA-FLS 被異常激活，發(fā)生獨(dú)特侵襲行為，F(xiàn)LS 過度增殖，分泌大量炎癥細(xì)胞因子，于關(guān)節(jié)處堆積，導(dǎo)致滑膜組織增生及骨破壞。

蔡松濤等［6］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RA-FLS miR-23b-3p 顯著下調(diào)，且miR-23b-3p 可通過負(fù)向調(diào)控X 連鎖凋亡抑制蛋白（x-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP），抑制RA-FLS增殖，促進(jìn)其凋亡。黃勤等［7］應(yīng)用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激FLS異常增殖，模擬RA 環(huán)境，miR-146 表達(dá)顯著下調(diào)；轉(zhuǎn)染miR-146 后，F(xiàn)LS增殖能力抑制，TNF-α、IL-1β與IL-6等炎癥細(xì)胞因子釋放降低，磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）及其下游分子蛋白激酶B（Akt）表達(dá)下調(diào)；miR-146 可能通過PI3K/Akt 信號(hào)通路抑制FLS。SIRT3 是一種去乙?；鞍?，可參與RA 線粒體代謝調(diào)節(jié)、能量代謝酶調(diào)節(jié)及抗氧化應(yīng)激酶調(diào)節(jié)等多種生物過程。ZU 等［8］經(jīng)熒光素酶報(bào)告分析驗(yàn)證SIRT3 為miR-140-3p 靶點(diǎn)，且SIRT3表達(dá)與FLS miR-140-3p表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步研究顯示，RA-FLS SIRT3 過表達(dá)，F(xiàn)LS細(xì)胞活性升高，凋亡受到抑制；miR-140-3p 可通過靶向SIRT3抑制FLS過度增殖，促進(jìn)其凋亡。Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）可介導(dǎo)眾多炎癥疾病發(fā)生發(fā)展，通過激活核因子κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號(hào)通路，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，參與RA炎癥反應(yīng)［9］。BAO 等［10］應(yīng)用生物信息學(xué)分析預(yù)測(cè)到TLR4 為RA-FLS miR-23a-5p 的靶基因，miR-23a-5p過表達(dá)可顯著抑制RA-FLS 增殖與炎癥反應(yīng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，miR-23a-5p 模擬物可誘導(dǎo)TNF-α處理的MH7A細(xì)胞活性與遷移率下降，TLR4 基因敲除可加強(qiáng)以上過程，同時(shí)亦可進(jìn)一步抑制NF-κB 信號(hào)激活并產(chǎn)生促炎因子，證實(shí)miR-23a-5p可能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制RA-FLS增殖及炎癥過程。

上述研究結(jié)果表明，RA-FLS中存在多種miRNA異常表達(dá)，且miRNA 在RA 患者FLS 增殖過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。通過靶向這些miRNA，可抑制FLS 增殖，促進(jìn)其凋亡，提示干預(yù)miRNA 存在治療RA的巨大潛力。

1.2 miRNA 調(diào)控RA 炎癥細(xì)胞因子 細(xì)胞因子作為機(jī)體免疫細(xì)胞之間的“通訊員”，肩負(fù)協(xié)調(diào)免疫網(wǎng)絡(luò)的重任。在RA 發(fā)病過程中，涉及多種炎癥細(xì)胞因子，形成復(fù)雜的細(xì)胞因子通路網(wǎng)絡(luò)。其中最關(guān)鍵的炎癥細(xì)胞因子包括TNF-α、IL 家族（IL-1β、IL-6、IL-17）及粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulo?cyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等［11］。眾多研究證實(shí)miRNA 可調(diào)控RA相關(guān)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)，影響RA發(fā)生發(fā)展（見表1）。

表1 有調(diào)控參與致RA炎癥的主要細(xì)胞因子作用的miRNATab.1 miRNA that regulate main cytokines involved in RA inflammation

1.2.1 TNF-α TNF-α 是一種單核巨噬細(xì)胞分泌的小分子蛋白，在RA 發(fā)病過程中起重要炎癥介導(dǎo)作用。TNF-α可刺激RA-FLS發(fā)生增殖，促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［12］。鋅指蛋白36（tristetraprolin，TTP）是一種可抑制TNF-α 合成的RNA 結(jié)合蛋白，可靶向TNF-α并提升其mRNA 的不穩(wěn)定性。SEMAAN 等［13］發(fā)現(xiàn)，抑制miR-346 可降低TTP 在RA-FLS 中表達(dá)；相反，在LPS 激活的THP-1 細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-346 可上調(diào)TTP mRNA 表達(dá)并抑制TNF-α 釋放；證明miR-346 可能通過上調(diào)TTP 表達(dá)從而控制RA TNF-α 釋放。miR-155 是TNF-α 刺激的RA-FLS 誘導(dǎo)率最高的miRNA［14］。LI 等［15］實(shí)驗(yàn)亦表明RA 患者外周血miR-155表達(dá)上調(diào)，且與TNF-α、IL-1β高表達(dá)顯著相關(guān)；細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)抑制蛋白1（suppressor of cyto?kine signaling 1，SOCS1）可反饋性阻斷TNF-α、IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)一步體外研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 可靶向SOCS1并抑制其表達(dá)，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β的上調(diào)。

1.2.2 IL-1β、IL-6 及IL-17 IL-1 是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的IL，其中，IL-1β 已被證實(shí)在誘導(dǎo)RA-FLS 增殖、加重其炎癥發(fā)展方面發(fā)揮重要作用［16］。IL-1β 刺激可顯著提升RA-FLS 活性，提高相關(guān)炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［17］。IL-6 在RA 滑膜組織中發(fā)揮類似TNF-α 的效應(yīng)，其由單核細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞、成纖維細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞等多種類型細(xì)胞產(chǎn)生［18］。IL-6可增強(qiáng)機(jī)體炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)IL-6和其他炎癥細(xì)胞因子（如IL-1、TNF-α等）產(chǎn)生［19］。同時(shí)，IL-1 和TNF-α 可進(jìn)一步刺激IL-6產(chǎn)生［20］。

WANG 等［21］證實(shí)，miR-365 模擬物可降低RA 模型小鼠滑膜組織細(xì)胞IL-1β 表達(dá)。ZHANG 等［22］發(fā)現(xiàn)miR-125b 過表達(dá)可上調(diào)TNF-α、IL-1β 與IL-6 等細(xì)胞因子水平，下調(diào)NF-κB抑制蛋白激酶α表達(dá)，表明miR-125b可能通過激活NF-κB途徑促進(jìn)RA IL-1β與IL-6 等炎癥細(xì)胞因子釋放。此外，也有研究證明miR-155與miR-410-3p參與RA-FLS中TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)［23-24］。

IL-17 由T 細(xì)胞產(chǎn)生，在T 細(xì)胞誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。IL-17 在RA 中水平較高，可刺激滑膜細(xì)胞產(chǎn)生多種炎癥介質(zhì)，包括IL-6、IL-8、GMCSF 及前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）等［25］。SU 等［26］觀 察 到，miR-19a 可 與 基 質(zhì) 金 屬 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，MMP）13 下 游3′UTR 結(jié)合，調(diào)控MMP13可激活RA IL-17信號(hào)通路。后續(xù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)MMP13 可促進(jìn)RA-FLS 細(xì)胞增殖中，miR-19a 可通過IL-17 信號(hào)通路抑制RA-FLS中MMP13 表達(dá)，降低RA 炎癥水平。HU 等［27］驗(yàn)證了RA 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞miRNA 功能：miR-23a 可抑制IL-17 炎癥因子誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞NF-κB 活化及多種促炎介質(zhì)表達(dá)。最終得出結(jié)論：miR-23a 靶向RA關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞IKKα。

1.2.3 GM-CSF GM-CSF 除了是一種公認(rèn)造血生長(zhǎng)因子，亦可作為促炎細(xì)胞因子，參與調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答。GM-CSF 可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞分化與活化，影響自身免疫性疾病的免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)，許多研究均證實(shí)GM-CSF 在RA 發(fā) 病 機(jī) 制 中 有 重 要 作 用［28-30］。O'CONNELL 等［31］發(fā)現(xiàn)，miR-155 可上調(diào)GM-CSF 來源的樹突細(xì)胞，對(duì)炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生發(fā)揮促進(jìn)作用，提示miR-155 在自身免疫性疾病治療方面具有潛在價(jià)值。Th17 細(xì)胞不僅可分泌IL-17，亦可產(chǎn)生GM-CSF；GM-CSF影響Th17分化與激活，在RA發(fā)病中起重要作用［32］。有學(xué)者通過Targetscan 分析，發(fā)現(xiàn)GM-CSF 與IL-17 mRNA 3'UTR 是miR-466i 潛 在靶點(diǎn)，miR-466i可靶向GM-CSF與IL-17 mRNA并介導(dǎo)其衰減，提示miR-466i存在靶標(biāo)治療RA的可能［33］。

目前，已有大量研究證實(shí)，miRNA 通過靶向蛋白與基因，激活特定信號(hào)通路的途徑，影響RA 相關(guān)炎癥細(xì)胞因子分泌，進(jìn)而可減輕RA 炎癥反應(yīng)，延緩其發(fā)展進(jìn)程。但miRNA 對(duì)RA 的調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，尚不能完全闡明。目前，miRNA 在RA 發(fā)病及炎癥過程中的重要作用已證實(shí)，可為RA 診治提供新的研究視角。

2 中藥通過miRNA調(diào)控治療RA

相較于西藥治療，中藥治療不僅有顯著臨床療效，且安全性高、不良反應(yīng)較少。但中藥作用機(jī)制不明確，給祖國(guó)醫(yī)學(xué)發(fā)展帶來一定阻礙。隨著時(shí)代和科技進(jìn)步，中醫(yī)學(xué)者們也不斷采用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)方式對(duì)中藥作用機(jī)制進(jìn)行探索與研究（表2）。

表2 中藥調(diào)控miRNA治療RATab.2 Chinese medicine regulates miRNA to treat RA

2.1 中藥提取成分 雷公藤多苷是由中藥雷公藤根部提取的多種有效成分混合物，有抗炎及免疫抑制作用。CHEN等［34］研究發(fā)現(xiàn)，RA患者miR-146a表達(dá)上調(diào)，其水平與疾病活動(dòng)度呈正相關(guān)，雷公藤多苷可顯著下調(diào)miR-146a 表達(dá)；提示雷公藤多苷可能通過影響miR-146a 治療RA。青藤堿是中藥青風(fēng)藤主要活性成分之一，可抑制RA 炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)其免疫功能。李嘉等［35］實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)青藤堿處理后RAFLS活性降低，細(xì)胞凋亡率升高，同時(shí)miR-23b-3p水平升高，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子9（fibroblast growth factor 9，F(xiàn)GF9）水平降低，miR-23b-3p 與FGF9 存在靶向關(guān)系；初步表明青藤堿可能通過調(diào)控miR-23b-3p/FGF9 抑制RA-FLS 增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。黃芩苷是傳統(tǒng)中藥黃芩有效成分之一，其藥理作用廣泛，有抗炎、抗菌、抗氧化等多種功效。段海政等［36］發(fā)現(xiàn)，黃芩苷不僅抑制RA-FLS 活性，亦可降低miR-21表達(dá)，同時(shí)TGF-β1 合成抑制，且促進(jìn)其抑制物Smad7表達(dá)。miR-21已證實(shí)可靶向結(jié)合Smad7蛋白并抑制其表達(dá)，引起組織纖維化［37］。提示黃芩苷可能通過抑制miR-21 表達(dá)，上調(diào)Smad7 表達(dá)，抑制TGF-β1 合成，起抗RA 滑膜纖維化作用。小檗堿是一種黃連提取的生物堿化合物，在臨床上應(yīng)用廣泛，有抗炎鎮(zhèn)痛作用。SUJITHA 等［38］實(shí)驗(yàn)表明，RA TLR4與TNF受體關(guān)聯(lián)因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）表達(dá)上調(diào)，其下游細(xì)胞凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1（apoptosis signal-regulating kinase 1，ASK1）激活，miR-23a 表達(dá)抑制。小檗堿處理后可上調(diào)miR-23a 表達(dá)，抑制TLR4 與TRAF2 表達(dá)及ASK1/p38 磷酸化，減少促炎細(xì)胞因子分泌，提示小檗堿可能通過上調(diào)miR-23a 表達(dá)抑制TLR4/TRAF2 介導(dǎo)的ASK1 信號(hào)通路，發(fā)揮延緩RA 炎癥進(jìn)程的作用。丹皮酚是中藥牡丹皮有效成分之一，有抗炎、止痛、調(diào)節(jié)免疫等多種作用。LIU 等［39］發(fā)現(xiàn)，丹皮酚或miR-155 抑制劑處理均可抑制TNF-α 誘導(dǎo)的RA-FLS 叉頭轉(zhuǎn)錄因子O3（forkhead box O3，F(xiàn)OXO3）蛋白表達(dá)，減少炎癥因子釋放。FOXO3 是miR-155-5p 的直接靶點(diǎn)，抑制FOXO3可導(dǎo)致丹皮酚保護(hù)作用消失。綜上所述，丹皮酚可能通過降低miR-155表達(dá)，上調(diào)其靶基因FOXO3，抑制FLS增殖及細(xì)胞因子釋放。

2.2 中藥復(fù)方 中藥復(fù)方治療RA 為多藥物、多成分、多靶點(diǎn)協(xié)同作用。王慧蓮等［40］通過臨床研究發(fā)現(xiàn)宣痹方可有效緩解RA 患者癥狀，其機(jī)制為抑制NF-κB 信號(hào)通路及miR-155 表達(dá)，減輕RA 炎癥反應(yīng)。王志文等［41］研究麝香烏龍丸含藥血清對(duì)RA 患者外周血單核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）miRNA 的影響，發(fā)現(xiàn)麝香烏龍丸可通過調(diào)控miR-181a、miR-16及miR-18a表達(dá)，減少炎癥細(xì)胞因子釋放，發(fā)揮治療RA 的作用。周玲玲等［42］將滋腎通絡(luò)方分為3 個(gè)不同功效單元，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各個(gè)功效單元可靶向CIA 小鼠CD4+T 細(xì)胞不同miRNA，發(fā)揮相應(yīng)功效，全方對(duì)miRNA 的調(diào)控作用最強(qiáng)，提示滋腎通絡(luò)方可靶向調(diào)控多種miRNA，協(xié)同增效，發(fā)揮整體治療RA 的作用。劉喜德等［43］通過前期研究觀察到溫化蠲痹方可下調(diào)RA 患者PBMCs miR-146a 表達(dá)，上調(diào)DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase，DNMTs），恢復(fù)其甲基化水平，通過多靶點(diǎn)干預(yù)治療活動(dòng)期RA。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activited protein kinases，MAPKs）阻斷劑干預(yù)RA 活動(dòng)期患者，其miR-146a 與RAS 鳥嘌呤釋放蛋白1（RAS guang releasing protein 1，RASGRP1）水 平 下 降，DNMTs表達(dá)上調(diào)［44］。溫化蠲痹方干預(yù)后，RASGRP1表達(dá)同樣下降，提示溫化蠲痹方可能通過降低RAS?GRP1 水平，作用于MAPKs 信號(hào)通路，參與RA 患者miR-146a 對(duì)DNMTs 的調(diào)控過程，發(fā)揮治療作用。WANG 等［45］發(fā)現(xiàn)RA 患者血清lncRNA uc. 477 表達(dá)上調(diào)，miR-19b 表達(dá)下調(diào)，LncRNA uc.477 可能干擾miR-19b 成熟，起到促炎作用?；鰪?qiáng)腎通痹方治療后可抑制RA-FLS lncRNA uc.477，miR-19b 上升，減少炎癥細(xì)胞因子釋放，提示化瘀強(qiáng)腎通痹方可能通過抑制lncRNA uc.477 水平，促進(jìn)miR-19b 成熟，發(fā)揮減緩RA炎癥進(jìn)程的作用。

3 結(jié)語

有關(guān)miRNA 調(diào)控影響RA 的研究廣泛，涉及多通路、多靶點(diǎn)。但應(yīng)用中藥干預(yù)miRNA 調(diào)控治療RA 的研究存在諸多問題。首先中藥干預(yù)miRNA 調(diào)控治療RA 的研究仍然處于初級(jí)階段，整體數(shù)量較少；其次相關(guān)研究大多欠缺深度，僅為描述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并未深入挖掘其分子機(jī)制；中藥復(fù)方治療疾病為多途徑、多環(huán)節(jié)共同產(chǎn)生作用，僅研究其中某一條通路有局限性。

隨著科研技術(shù)水平地不斷發(fā)展進(jìn)步，未來可從多角度、多途徑進(jìn)行系統(tǒng)深入研究。結(jié)合miRNA 調(diào)控作用，闡明中藥治療RA 的作用機(jī)制，有望成為研究RA的下一個(gè)熱點(diǎn)。