慢性牙周炎患者牙齦卟啉單胞菌與Th17/Treg的相關(guān)性研究①

于淑琪 蘇 旭 徐 潔 陳曉濤 （新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院口腔科，烏魯木齊 830001）

慢性牙周炎（chronic peridontitis，CP）的發(fā)生與 口腔中致病微生物和宿主免疫系統(tǒng)的相互作用密切相關(guān)，同時受環(huán)境因素影響［1］。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）在促進免疫應(yīng)答過程中可誘導漿細胞占優(yōu)勢的免疫應(yīng)答，促進抗原特異性淋巴細胞活化［2］。輔助性T（helper T，Th）細胞是一類未完全分化的T 細胞，各亞群Th 細胞可分泌不同特異性細胞因子，并表達不同轉(zhuǎn)錄子，進而調(diào)節(jié)并影響CP 病理進程。研究證實，相比于健康對照組，CP 患者外周血Th17 細胞占比明顯增高，牙周探診深度與外周血Th17 細胞占比呈正相關(guān)［3］。與Th1/Th2 類似，Th17 細胞與Treg 處于平衡關(guān)系，在炎癥和自身免疫病中相互拮抗。Th17 細胞分泌特異性促炎因子IL-17，促進炎癥和自身免疫［4-5］；Treg 通過細胞間直接接觸或間接分泌細胞因子抑制T細胞增殖、分化，從而在免疫耐受及機體穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮負調(diào)控作用［6］。本研究旨在探討不同發(fā)展階段的CP患者外周血Th17/Treg 占比與患者牙齦下菌斑中Pg定植水平是否相關(guān)。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 研究對象及分組 選取2020年3月至2020年10 月于新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院就診的CP 患者45 例，其中輕度27 例，中重度18 例，另選取27 例健康志愿者。入組標準：①身體指標良好，符合CP 診斷標準［7］；②全口保留至少10顆牙齒；③過去6個月內(nèi)未接受任何口腔科治療且未服用過免疫調(diào)節(jié)類藥物及抗生素；④依從性良好。排除標準：①患有精神系統(tǒng)疾病或存在意識障礙者；②有既往吸煙史者；③免疫缺陷性疾病患者；④哺乳期及妊娠期女性；⑤糖尿病、高血壓及具有近期急性感染病史患者。按照患者牙周炎疾病嚴重程度分為輕、中、重度組［8］：①輕度組：牙齦炎癥和探診出血，牙周袋寬度≤4 mm，附著喪失范圍1～2 mm，X線檢測顯示牙槽骨吸收≤牙根長度1/3；②中度組：牙齦炎癥和探診出血，可有膿，牙周袋寬度≤6 mm，附著喪失范圍3～4 mm，X 線片顯示牙槽骨吸收或角型吸收達到牙根長度1/3～1/2；③重度：有明顯牙齦炎癥，牙周袋寬度＞6 mm，附著喪失范圍＞5 mm，X線顯示牙槽骨吸收＞牙根長度1/2；④健康對照組：全口牙無出血，無附著喪失，無牙槽骨吸收，探診深度（probing depth，PD）≤3 mm。3 組患者年齡、性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，表1）。本研究經(jīng)新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象知情同意（2016029）。

表1 臨床資料（±s）Tab.1 Clinical data（±s）

表1 臨床資料（±s）Tab.1 Clinical data（±s）

Note：1）P＜0.05 vs control group；2）P＜0.05 vs mild group.

Moderate to severe（n=18）12/6 51.50±10.50 6.80±0.531）2）Items Control（n=27）Mild（n=27）Male/Female Age/year PD/mm 17/10 48.04±12.48 1.60±0.35 16/11 53.67±10.59 4.48±0.311）

1.1.2 主要試劑與儀器 Pg標準株（BNCC337441）購 自ATCC 公 司；抗 人CD3、CD4、IL-17A、CD25、CD127 單克隆抗體購自美國Biolegend 公司；蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑（BFA）、離子霉素（IO）、佛波酯（PMA）購自美國Biogems 公司；淋巴細胞分離液購自天津華科生物有限公司；細菌基因組DNA 提取試劑盒購自南京諾維贊公司；QIAquick PCR 產(chǎn)物純化試劑盒購自QIAGEN GmbH 公司；厭氧產(chǎn)氣袋、密封袋、厭氧指示劑購自日本三菱公司；PCR 儀購自德國TPRO?FESSION；FACSCanto TMⅡ流式細胞儀購自美國BD公司；LihgtCycler480Ⅱ熒光定量PCR 儀購自上海羅氏公司。

1.2 方法

1.2.1 牙齦下菌斑樣本檢測 取健康志愿者上頜第一磨牙頰側(cè)近中位點（健康位點），CP患者則取口內(nèi)牙周袋最深位，隔濕，無菌刮匙刮去齒齦上菌斑，將滅菌紙尖插入牙周袋直到感覺到阻力后靜置30 s，取置于無菌Eppendorf 管，-20 ℃貯存?zhèn)溆?。由?？漆t(yī)師檢測對照組、牙周炎患者全口牙位的出血指數(shù)（bleeding index，BI）、臨床附著喪失（attachment loss，AL）及PD。

1.2.2 DNA 提取 樣本室溫下振蕩，12 000 r/min離心，沉淀。按照試劑盒說明提取Pg DNA，微量分光光度計檢測DNA 濃度至0.02～20 ng/μl，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 RT-qPCR Pg引物來自編碼16S rRNA的基因，正向序列：5′-GTGCGTAGGTTGTTCGGTAAGTC-3′，反向序列：5′-CTTCGTGCTTCAGTGTCAGTCG-3′，產(chǎn)物為192 bp，引物由上海生工合成。反應(yīng)條件：總反應(yīng)體系體積為20 μl：2×SYBR Green Master Mix 10 μl；正、反向引物各1.4 μl；DNA 模板均為1 μl，無菌水補足反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：預變性95 ℃2 min；變性95 ℃5 s；退火/延伸60 ℃10 s；50 個循環(huán)。選擇標準菌株P(guān)g BNCC337441 基因組DNA 作為陽性對照，等體積雙蒸水作為空白對照。

1.2.4 外周血Th17 細胞、Treg 水平檢測 清晨收集各組受試者外周靜脈血4 ml，采用Ficoll密度梯度離心法，按照試劑盒說明分離外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。Th17 檢測：轉(zhuǎn)移PBMC 至24 孔板培養(yǎng)，加入PMA 和IO 作用1 h，加入BFA 活化細胞，37 ℃培養(yǎng)4 h，收集細胞，采用抗CD3、CD4 抗體標記，TBS-T 打孔反應(yīng)后以抗IL-17A 抗體標記，測定Th17 細胞占比。Treg 檢測：以抗CD4、CD25、CD127 等抗體標記PBMC，避光反應(yīng)20 min，PBS 洗滌并重懸，流式細胞儀檢測Th17/Treg占比。

1.3 統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，菌量進行對數(shù)轉(zhuǎn)換后分析。正態(tài)、方差齊資料組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血Th17 細胞、Treg 變化 輕度組與中重度組患者外周血中Th17 細胞比例明顯高于對照組（P＜0.05），中重組較輕度組更高（P＜0.05）；輕度組患者外周血Treg 比例明顯高于另外兩組（P＜0.05），中重度組Treg 比例略低于對照組，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；中重度組患者外周血Th17/Treg 顯著高于其他兩組（P＜0.05），輕度組患者外周血與對照組患者外周血相比Th17/Treg較高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 各組Th17細胞、Treg占比及Th17/TregFig.1 Proportions of Th17 cells，Treg and ratio of Th17/Treg in each group

2.2 牙齦下菌斑中Pg 菌量變化 與對照組相比，輕度及中重度組Pg菌量（對數(shù)轉(zhuǎn)換后）明顯增加（P＜0.05），中重度組較輕度組菌量較高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖2）。

圖2 各組Pg菌量Fig.2 Amount of Pg bacteria in each group

2.3 Th17細胞、Treg、Th17/Treg與Pg菌量的相關(guān)性分析 Pg 菌量值與Th17 細胞百分比、Th17/Treg 呈正相關(guān)（r=0.370、0.384，P＜0.05）；Pg 菌量值與Treg呈正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學意義（r=0.101，P＞0.05，圖3）。

圖3 Th17細胞、Treg、Th17/Treg與Pg菌量的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of Th17 cells，Treg，Th17/Treg and Pg bacteria quantity

2.4 Th17 細胞、Treg、Th17/Treg、Pg 菌量與PD 的相關(guān)性分析 PD 與Pg 菌量值、Th17 細胞百分比、Th17/Treg 呈顯著正相關(guān)（r=0.622、0.468、0.405，P＜0.001），Treg 與PD 呈正相關(guān)，但差異無統(tǒng)計學意義（r=0.028，P＞0.05，圖4）。

3 討論

CP 是口腔科最常見疾病之一。Pg 是牙周優(yōu)勢致病菌的“紅色復合體”中的主要成員，通過多種途徑入侵口腔上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成骨細胞等多種宿主細胞，與牙周炎進展密切相關(guān)［9-10］。探討口腔局部炎癥與免疫細胞激活的相關(guān)機制具有一定臨床意義。

腫瘤、自身免疫性疾病等患者外周血中均檢測出Th17/Treg 兩種細胞比例變化或失衡［11］。發(fā)揮相互拮抗作用的Th17細胞和Treg 的比值與CP 的相關(guān)性逐漸引起關(guān)注［12］。本研究顯示，CP 組Pg 菌量較對照組明顯增加，與牙周PD呈正相關(guān)，支持CP患者Pg 感染居于高水平，與既往文獻結(jié)論一致。牙周組織中普雷沃特氏菌、具核酸桿菌、齒垢密螺旋體和Pg 等增加，一方面與直接破壞牙周組織中上皮屏障、并骨組織漸進性吸收密切相關(guān)，另一方面，牙周組織受到牙周致病菌入侵后激活單核吞噬細胞免疫應(yīng)答，對致病菌抗原進行免疫識別后進一步提呈至區(qū)域淋巴結(jié)，誘導T 細胞活化、增殖［13-14］。OHLRICH 等［15］研究表明，Th17/Treg 比例失衡導致免疫抑制效應(yīng)不足，是導致CP患者免疫異常的重要因素之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，外周血中Th17 細胞占比及Th17/Treg 隨PD 增加而升高，提示牙周炎患者外周血中Th17細胞占比提高，Th17/Treg比例失調(diào)與牙周炎嚴重程度相關(guān)，原因可能為機體免疫應(yīng)答異常，促進炎癥進展。進一步相關(guān)性關(guān)系分析，Pg 在牙齦下菌斑中的定植量與患者外周血中Th17 細胞占比、Th17/Treg 呈正相關(guān)，且差異有統(tǒng)計學意義，推測牙周致病菌Pg 可促進外周血Th17 細胞生成，并影響Th17/Treg。隨著Pg在牙齦部位的局部定植量上升，牙周感染情況加重，通過釋放多種細胞因子與炎癥因子誘導Th17細胞分化。張莉平等［16］報道，Pg可釋放LPS，呈時間依賴性上調(diào)PEMC IL-1β、IL-6、IL-23和TGF-β 等Th17 細胞相關(guān)細胞因子表達，證實Pg-LPS通過活化單核細胞產(chǎn)生Th17細胞相關(guān)炎癥因子促進Th17細胞分化。CHENG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，Pg可通過激活TLR2/4 受體信號轉(zhuǎn)導途徑誘導單核細胞免疫應(yīng)答，使CD4+T 細胞向Th17 方向分化。葛楠等［18］的動物實驗指出，Th17 細胞、Treg 占比及Th17/Treg 在牙周炎患者病情進程不同階段的變化規(guī)律亦不相同，活動期牙周炎大鼠體內(nèi)外周血Th17細胞與Treg 及Th17/Treg 均顯著升高。MOUTSO?POULOS等［19］研究報道，Pg可通過激活細胞中NF-κB途徑刺激細胞中炎癥因子IL-23、IL-6、IL-1β 分泌，使Th17細胞分化成熟。本研究顯示，Pg菌量與血清Treg占比并不存在顯著相關(guān)性。但一項牙周炎模型小鼠實驗證實，小鼠口服Pg 后，其外周血FOXP3 表達明顯上調(diào)，表明Treg 發(fā)揮了免疫保護作用［20］。因此，Pg與Th17細胞、Treg是否相關(guān)，其具體機制如何仍需進一步研究。

本研究中，輕度牙周炎患者組Treg 比例顯著增高，而中重度患者組與健康組差異無統(tǒng)計學意義。牙槽骨吸收是牙周炎發(fā)展的重要表現(xiàn)形式之一，免疫細胞與骨代謝CD4+T、Th1、Th1/Th2、Thl7 等增多會增強破骨細胞活性，而CD8+T細胞、Treg等增多則抑制破骨細胞作用［21］。因此推測當牙周炎處于早期階段時，牙周感染相關(guān)病原體激活機體免疫應(yīng)答，使得CD4+T 細胞分化為Th17 細胞。機體負反饋機制作用下，當牙周炎發(fā)展至晚期時，牙周組織內(nèi)存在由炎癥細胞分泌的高濃度IL-6，而IL-6可與TGF-β協(xié)同作用，促進CD4+T 細胞分化為Th17 細胞，進而抑制Treg 分化，推斷由于大部分CD4+T 細胞分化為Th17 細胞，數(shù)量遠大于Treg 數(shù)量，導致Th17/Treg 升高，促進炎癥發(fā)展，其原因可能為Treg 減少而導致自身對免疫系統(tǒng)的負調(diào)控異常，從而導致自身免疫應(yīng)答過強，無法得到有效控制。

綜上，隨著慢性牙周炎發(fā)生，Th17 及Treg 數(shù)量及兩者比值在外周血中異常表達，可能與慢性牙周炎病理進程密切相關(guān)，牙齦下菌斑中Pg 可促進Th17/Treg 相關(guān)免疫炎癥反應(yīng)，其作用機制有待進一步研究。