基于miR-34a/Notch 信號通路研究補肺益腎方對慢性阻塞性肺疾病大鼠模型免疫失衡和炎癥反應(yīng)的影響①

欒 英 李敬蕊 劉林林 高春燕 張菊香 王 晶 崔朝勃

（河北省衡水市哈勵遜國際和平醫(yī)院，衡水市人民醫(yī)院，衡水 053000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic obstructive pulmo?nary disease，COPD）是臨床常見的呼吸及氣流受限的一種氣道及肺部慢性炎癥性疾?。?］。COPD 因具有較高的發(fā)病率及病死率而受到世界公共衛(wèi)生組織的重視［2］。目前研究發(fā)現(xiàn)機體免疫功能失衡及肺部和氣道炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致COPD 患者肺泡破壞、肺組織損傷甚至死亡的主要原因［3］。果蠅雙翅邊緣缺刻同源基因（drosophila double-wing margin nicked homologous gene，Notch）可調(diào)控細胞炎癥、凋亡等生理活動而參與多種疾病的生理過程，且已有報道發(fā)現(xiàn)，COPD 過程中，巨噬細胞激活Notch 信號通路介導(dǎo)的炎癥及免疫反應(yīng)失衡與COPD 肺組織及氣道炎癥損傷關(guān)系密切［4-5］。大量研究證實Notch 是微小RNA-34a（microRNA-34a，miR-34a）的 靶 蛋 白，且miR-34a 可靶向抑制Notch 表達來調(diào)控細胞炎癥及凋亡 過程［6-7］。但miR-34a 是否參與COPD 病理過程，研究較少。過往研究發(fā)現(xiàn)，補肺益腎方（Bufei Yishen Fang，BYF）可通過降低炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)機體免疫等來緩解COPD 患者臨床癥狀及炎癥反應(yīng)［8-9］。但BYF 的具體分子生物學(xué)機制還不甚明確。本研究建立大鼠COPD 模型，從miR-34a/Notch 軸探究BYF 改善COPD 大鼠炎癥及免疫失衡的機制，以期闡明BYF 治療COPD 的可能機制，為BYF的開發(fā)應(yīng)用及國際化進程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級SD 雄性大鼠72 只，6～7 周齡，體質(zhì)量200～220 g，購自河南襄城縣隆瑞實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SYXK（豫）2020-0010；使用許可證號：SCXK（豫）2020-0001。所有大鼠于哈勵遜國際和平醫(yī)院動物房中常規(guī)飼養(yǎng)。本試驗符合3R原則，且經(jīng)哈勵遜國際和平醫(yī)院倫理委員會批準。

1.1.2 主要試劑及儀器 肺炎克雷伯桿菌（北京索萊寶科技有限公司，貨號：LA9000）；Notch 通路激活劑（Jagged1，美國Systems公司，貨號：HY-P1846）；Notch、IL-17、IL-6、輔助性T 細胞17（Th17）轉(zhuǎn)錄因子（RoRγt）、調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）及β-actin抗體（美國Abcam公司，貨號分別為：ab167441、ab193955、ab271270、ab113434、ab215206、ab8226）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海愛必信生物科技有限公司，貨號：abs9217）；RT-qPCR 試劑盒、Trizol 試劑盒（美國賽默飛公司，貨號：AB4106A、12183555）；RIPA 裂解液、BCA 試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號R0010-20、PC0020）；血液分析系統(tǒng)（德國西門子公司，型號：ADVIA 2120i）；流式細胞儀（美國BD 公司，型號BD001）；動物肺功能分析系統(tǒng)（加拿大SCIREQ公司，型號FLEXIVENT）等。

1.2 方法

1.2.1 大鼠COPD 模型的建立及分組給藥 取SD大鼠參照文獻［8］暴露于香煙［煙霧體積分數(shù)：（3 000±500）ml/m3］條件下12 周，2 次/d，6 d/周，并用肺炎克雷伯桿菌（0.1 ml）滴鼻8 周，5 d/次建立COPD 模型。參照文獻［10］觀察大鼠一般行為，若大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息、腹式呼吸、鼻頭發(fā)紺或分泌物增多現(xiàn)象，視為造模成功。將造模成功的60只大鼠分為模型組、BYF（3.7 g/kg）組、miR-34a低表達（miR-34a antagomir，4 nmol/kg）組、BYF+miR-34a antagomir（3.7 g/kg+4 nmol/kg）組、miR-34a低表達陰性對照（antagomir-NC）組，每組12只。另取12只SD大鼠不做任何處理，作為正常對照組。各組大鼠均于第9 周開始給藥，BYF 組參照文獻［8］設(shè)置劑量，用生理鹽水稀釋為濃度為0.37 g/ml 的混懸液并按10 ml/kg 的體積灌胃給藥，2 次/d；miR-34a antagomir及antagomir-NC 參照文獻［11］用生理鹽水稀釋成終濃度為1 nmol/50 μl 混懸液，按200 μl/kg 的體積經(jīng)尾靜脈注射給藥，每周1 次；BYF+miR-34a antagomir組灌胃給予BYF 并經(jīng)尾靜脈注射給予miR-34a antagomir；正常對照組及模型組給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥12周。

1.2.2 大鼠行為學(xué)觀察 于給藥期間觀察各組大鼠行為學(xué)變化。

1.2.3 大鼠肺功能檢測 末次給藥12 h 后，用動物肺功能分析系統(tǒng)檢測大鼠肺功能指標，包括用力肺活量（FVC）、第0.3 秒用力呼氣容積（FEV0.3）、肺阻力（R）、肺順應(yīng)性（Cdyn）變化。

1.2.4 流式細胞儀檢測外周血中T 淋巴細胞亞群（CD4+T、CD8+T、Th17/Treg）水平 各組大鼠在做完肺功能檢測后，麻醉，取腹主動脈血6 ml，迅速放入抗凝管和促凝管中，12 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測血CD4+、CD8+T 淋巴細胞數(shù)量，并計算CD4+/CD8+。制備含有1×106個/ml的單細胞懸液，用FITC+CD4 抗體染色后，固定，用0.1%非離子表面活性劑-聚乙二醇辛基苯基醚（Triton）滲透，并用PE+Foxp3和PE+IL-17抗體染色，檢測CD4+IL-17、CD4+Foxp3 表達，并以CD4+IL-17/CD4+Foxp3比例代表Th17/Treg平衡狀態(tài)。

1.2.5 血液分析系統(tǒng)檢測肺泡灌洗液中白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)量 各組大鼠麻醉取血后，處死，結(jié)扎右肺，用冰生理鹽水2 ml 對左肺葉進行灌洗，取灌洗液用血液分析系統(tǒng)檢測白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)量。

1.2.6 HE 染色檢測肺組織病理變化 取右肺組織，剪取部分組織置于-80 ℃冰箱保存，其余組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h 后，進行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后切成5 μm 切片，按HE 試劑盒說明書進行染色，封片后置于顯微鏡下觀察肺組織病理變化。

1.2.7 qRT-PCR 檢測大鼠肺組織miR-34a、Notch mRNA 相對表達水平 取1.2.6 中-80 ℃冰箱保存的組織在4 ℃冰箱中解凍后，用Trizol 抽提取總RNA，以總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄cDNA。取cDNA，按RT-qPCR 試劑盒（SYBR Green）說明書和PCR 儀進行擴增，共進行40 個循環(huán)：95℃120 s（1 個循環(huán)），95 ℃30 s、55～60 ℃30 s、72 ℃30 s（40 個循環(huán)），72 ℃300 s（1 個循環(huán)）后終止反應(yīng)。miR-34a 以U6為內(nèi)參，Notch mRNA 以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt算法計算miR-34a、Notch mRNA相對表達水平。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物設(shè)計見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Tab.1 Primer sequence of RT-qPCR

1.2.8 Western blot 法 檢 測 肺 組 織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3 蛋白相對表達水平 取1.2.6 中-80 ℃冰箱保存的組織100 mg，在4 ℃冰箱中解凍后，加入RIPA 裂解液勻漿、離心分離后，取上清液用BCA 試劑盒測定蛋白濃度，取50 μg 蛋白進行電泳、轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，5%牛血清蛋白于室溫下封閉1 h 后，加入兔一抗［Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3（稀釋倍數(shù)1∶2 000）、β-actin內(nèi)參抗體（稀釋倍數(shù)1∶1 000）］，4 ℃搖床孵育過夜并加入羊抗兔二抗（稀釋倍數(shù)1∶2 000）在37 ℃條件下孵育1 h 后，用增強化學(xué)發(fā)光法顯色，以化學(xué)發(fā)光儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間比較進行單因素方差分析，進一步兩組間比較行SNK-q檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BYF 對大鼠行為變化的影響 正常對照組大鼠行為及飲食活動正常，無死亡。模型組大鼠毛發(fā)逐漸枯槁、飲水增加但活動減少，形體消瘦，由煩躁不安逐漸變?yōu)榫裎摇⒑粑贝?、喘息、鼻頭發(fā)紺且分泌物增多，且有2只死亡。BYF 組大鼠無死亡，呼吸喘促等上述癥狀最輕。miR-34a antagomir 組大鼠有4 只死亡，且上述行為癥狀進一步加重。antagomir-NC 組、BYF+miR-34a antagomir 組大鼠有2只死亡，行為變化與模型組相似。

2.2 BYF 對大鼠肺功能的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠FVC、FEV0.3、Cdyn 降低（P＜0.05），R 升高（P＜0.05），預(yù)示肺功能降低。與模型組相比，BYF 組大鼠肺功能升高（P＜0.05）。miR-34a antagomir 組大鼠肺功能進一步降低（P＜0.05）。BYF+miR-34a antagomir 組上述指標與BYF 組相反（P＜0.05）。antagomir-NC 組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠肺功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes of rats in each group（±s）

表2 各組大鼠肺功能指標比較（±s）Tab.2 Comparison of pulmonary function indexes of rats in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BYF group，3）P＜0.05.

R/（ml·cm H2O-1）0.22±0.02 0.49±0.041）0.33±0.051）2）0.61±0.051）2）0.48±0.041）3）0.47±0.041）3）Groups Normal control Model BYF miR-34a antagomir BYF+miR-34a antagomir antagomir-NC n 12 10 12 8 10 10 FVC/ml 7.38±0.50 5.19±0.441）6.71±0.491）2）4.11±0.321）2）5.12±0.431）3）5.16±0.401）3）FEV0.3/ml 5.78±0.40 3.19±0.221）4.53±0.391）2）2.26±0.121）2）3.16±0.221）3）3.17±0.201）3）Cdyn/（ml·cm H2O-1）0.78±0.04 0.39±0.021）0.53±0.051）2）0.21±0.021）2）0.36±0.021）3）0.38±0.031）3）

2.3 BYF 對大鼠肺組織病理變化的影響 正常對照組肺泡結(jié)構(gòu)正常，模型組大鼠肺泡壁斷裂、融合、氣管壁增厚及管壁周圍結(jié)締組織增生、炎癥細胞浸潤嚴重；BYF 組大鼠肺泡壁幾乎未見融合斷裂現(xiàn)象，管壁炎癥細胞浸潤較少；miR-34a antagomir 組大鼠肺泡斷裂融合及炎癥細胞浸潤最嚴重；BYF+miR-34a antagomir 組及antagomir-NC 組肺組織上述病理損傷程度與模型組相近，見圖1。

圖1 大鼠肺組織HE染色圖（×400）Fig.1 HE staining of rat lung tissue（×400）

2.4 BYF 對大鼠肺組織miR-34a、Notch mRNA 表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織Notch mRNA 表達升高（P＜0.05），miR-34a 表達降低（P＜0.05）。與 模 型 組 相 比，BYF 組 大 鼠Notch mRNA 表達降低（P＜0.05），miR-34a 表達升高（P＜0.05）；miR-34a antagomir 組上述指標變化趨勢與模型組一致（P＜0.05）。BYF+miR-34a antagomir 組上述指標變化與BYF 組相反（P＜0.05）。antagomir-NC組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠肺組織miR-34a、Notch mRNA 表達水平比較（±s）Tab.3 Expression levels of miR-34a and Notch mRNA in lung tissue of rats in each group（±s）

表3 各組大鼠肺組織miR-34a、Notch mRNA 表達水平比較（±s）Tab.3 Expression levels of miR-34a and Notch mRNA in lung tissue of rats in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BYF group，3）P＜0.05.

Notch/β-actin 1.09±0.15 1.79±0.171）1.42±0.141）2）1.95±0.191）2）1.73±0.171）3）1.76±0.171）3）Groups Normal control Model BYF miR-34a antagomir BYF+miR-34a antagomir antagomir-NC n 12 10 12 8 10 10 miR-34a/U6 1.03±0.16 0.59±0.101）0.72±0.141）2）0.25±0.091）2）0.56±0.111）3）0.56±0.121）3）

2.5 BYF 對大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠肺泡灌洗液白細胞、淋巴細胞和巨噬細胞等炎癥細胞數(shù)量升高（P＜0.05）。與模型組相比，BYF 組大鼠炎癥細胞數(shù)量降低（P＜0.05）；miR-34a antagomir 組大鼠炎癥細胞數(shù)量進一步升高（P＜0.05）。BYF+miR-34a antagomir 組上述指標變化與BYF 組相反（P＜0.05），antagomir-NC 組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)量比較（±s，1×106 個/L）Tab.4 Comparison of inflammatory cells in BALF of rats in each group（±s，1×106 cells/L）

表4 各組大鼠肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)量比較（±s，1×106 個/L）Tab.4 Comparison of inflammatory cells in BALF of rats in each group（±s，1×106 cells/L）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared withmodel group，2）P＜0.05；compared with BYF group，3）P＜0.05.

Groups Normal control Model BYF miR-34a antagomir BYF+miR-34a antagomir antagomir-NC n 12 10 12 White blood cell 210.32±20.01 751.26±70.261）361.36±36.111）2）Lymphocyte 140.28±10.36 451.33±40.211）221.52±21.631）2）Macrophage 3.28±0.38 16.83±1.181）8.12±0.831）2）8 989.96±90.831）2）669.31±60.261）2）31.31±0.151）2）10 731.62±21.331）3）456.32±40.641）3）16.26±1.061）3）17.13±1.211）3）10 742.52±62.621）3）447.81±40.291）3）

2.6 BYF 對大鼠免疫功能的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠CD8+/CD4+、Th17/Treg 升高（P＜0.05），預(yù)示免疫功能失衡。與模型組相比，BYF組大鼠免疫功能趨于正常（P＜0.05）；miR-34a antagomir組大鼠免疫功能進一步失衡（P＜0.05）。BYF+miR-34a antagomir 組上述指標變化與BYF 組相反（P＜0.05），antagomir-NC 組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表5。

表5 各組大鼠免疫功能比較（±s）Tab.5 Comparison of immune function of rats in each group（±s）

表5 各組大鼠免疫功能比較（±s）Tab.5 Comparison of immune function of rats in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BYF group，3）P＜0.05.

CD8+/CD4+0.32±0.01 0.66±0.051）0.46±0.041）2）0.86±0.081）2）0.69±0.061）3）0.63±0.061）3）Th17/Treg 0.48±0.06 0.73±0.071）0.57±0.051）2）0.89±0.081）2）0.58±0.061）3）0.71±0.061）3）Groups Normal control Model BYF miR-34a antagomir BYF+miR-34a antagomir antagomir-NC n 12 10 12 8 10 10

2.7 BYF 對大鼠肺組織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3 蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組 大 鼠 肺 組 織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3、RoRγt/Foxp3 蛋白表達升高（P＜0.05）。與模型組相比，BYF 組大鼠肺組織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3、RoRγt/Foxp3 蛋白表達降低（P＜0.05）；miR-34a antagomir 組大鼠上述蛋白表達進一步升高（P＜0.05）。BYF+miR-34a antagomir 組上述指標變化與BYF 組相反（P＜0.05），antagomir-NC 組與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表6，圖2。

圖2 各組大鼠肺組織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3蛋白表達免疫印跡圖Fig.2 Western blot of Notch，IL-17，IL-6，RoRγt and Foxp3 protein expressions in lung tissue of rats in each group

表6 各組大鼠肺組織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of Notch，IL-17，IL-6，RoRγt and Foxp3 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s）

表6 各組大鼠肺組織Notch、IL-17、IL-6、RoRγt、Foxp3蛋白表達比較（±s）Tab.6 Comparison of Notch，IL-17，IL-6，RoRγt and Foxp3 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s）

Note：Compared with normal control group，1）P＜0.05；compared with model group，2）P＜0.05；compared with BYF group，3）P＜0.05.

RoRγt/Foxp3 1.05±0.02 1.59±0.111）1.30±0.121）2）1.81±0.131）3）1.65±0.131）3）1.61±0.141）3）Groups Normal control Model BYF miR-34a antagomir BYF+miR-34a antagomir antagomir-NC n 12 10 12 8 10 10 Notch/β-actin 1.09±0.11 1.74±0.181）1.31±0.131）2）2.12±0.201）2）1.72±0.17a1）3）1.76±0.161）3）IL-17/β-actin 1.16±0.13 1.83±0.181）1.42±0.141）2）2.21±0.201）3）1.82±0.181）3）1.84±0.181）3）IL-6/β-actin 1.19±0.12 1.73±0.171）1.52±0.161）2）2.11±0.181）3）1.75±0.171）3）1.71±0.181）3）RoRγt/β-actin 1.06±0.13 2.43±0.191）1.72±0.161）2）2.98±0.191）3）2.55±0.161）3）2.48±0.171）3）Foxp3/β-actin 1.01±0.10 1.53±0.151）1.32±0.131）2）1.66±0.161）3）1.55±0.121）3）1.54±0.131）3）

3 討論

據(jù)世界流行病學(xué)分析，COPD 病死率已位于世界第4 位，中國COPD 患者已達1 億，且40 歲以上COPD 患者高達13.7%［12］。COPD 發(fā)病機制復(fù)雜且不明確，目前認為吸煙、環(huán)境污染、氣道感染等是造成COPD 肺不可逆損傷的主要因素［13］。大鼠暴露于煙熏下2 個月，可模擬人類COPD 病理生理特征［14］。本研究用煙熏+細菌感染的方法刺激大鼠2個月后，發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)死亡、呼吸急促、喘息及飲食活動量減少等癥狀，肺部解剖發(fā)現(xiàn)肺泡融合、間隔斷裂及破壞等與文獻［14］相似的病理癥狀，提示造模成功。中醫(yī)藥治療COPD 治則豐富、療效確切、毒副作用少［15］。田燕歌等［8］發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥經(jīng)典方—BYF 可改善COPD 肺泡結(jié)構(gòu)損傷。本研究發(fā)現(xiàn)BYF干預(yù)治療COPD 大鼠后，大鼠死亡、呼吸急促等癥狀及肺泡結(jié)構(gòu)損傷顯著緩解，證實BYF 可能為治療COPD 的潛在藥物。但其分子及基因調(diào)控機制還不甚明確，本研究對此進行繼續(xù)探究。

免疫功能失衡及炎癥反應(yīng)，是引起COPD 患者呼吸氣流受限、肺功能下降、肺組織炎癥損傷的重要因素［16］。曹玉雪等［17］發(fā)現(xiàn)COPD 患者外周血及小氣道中T淋巴細胞數(shù)量與氣流受限及炎癥反應(yīng)的嚴重程度成正比，且T 淋巴細胞中的CD8+T 亞型可使肺組織中巨噬及中性粒等細胞聚集，導(dǎo)致肺泡破裂及肺部彈力組織破壞。WANG 等［18］在COPD 患者外周血中，檢測到可引起炎癥細胞遷移而發(fā)揮促炎效應(yīng)的Th17 細胞增多，而具有抑制炎癥反應(yīng)、維持免疫平衡的Treg細胞減少，并認為Treg與Th17細胞比例失衡，可能與COPD 患者肺功能降低及惡化關(guān)系密切。本研究也檢測到COPD 大鼠肺功能降低，肺泡灌洗液炎癥細胞數(shù)量及肺組織IL-6、TNF-α 分泌顯著高于正常對照組，能反映免疫功能的CD8+/CD4+、Th17/Treg、RORγt/FOXP3也顯著升高，提示模型組大鼠出現(xiàn)肺功能下降、免疫功能下降、肺組織炎癥損傷現(xiàn)象。ZHAO 等［9］發(fā)現(xiàn)BYF 可通過調(diào)節(jié)Th17/Treg 比例，改善免疫功能紊亂現(xiàn)象。本研究發(fā)現(xiàn)COPD 大鼠經(jīng)BYF 治療后，肺功能和免疫功能得以改善，肺組織炎癥損傷得到緩解，提示BYF 治療COPD作用，可能與調(diào)節(jié)免疫、降低炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Notch 通路可介導(dǎo)炎癥及免疫反應(yīng)，參與COPD疾病發(fā)展進程。林德華等［19］認為抑制Notch信號通路表達，可改善COPD 免疫紊亂和炎癥損傷；QIU 等［20］發(fā)現(xiàn)抑制COPD 患者Notch 途徑，可減緩COPD 炎癥損傷、阻斷肺泡細胞凋亡。本研究也檢測到COPD大鼠肺組織中Notch mRNA 及蛋白表達均顯著高于正常對照組，提示Notch 通路激活可能是引起COPD大鼠免疫失衡及肺組織炎癥損傷的關(guān)鍵通路。VALCOURT 等［6］用雙熒光素酶實驗證實miR-34a 可靶 向 負 調(diào) 控Notch。VELASCO-TORRES 等［21］在COPD 女性患者血清中檢測到miR-34a 表達下調(diào)及Notch 濃度升高，提示miR-34a 下調(diào)可能參與COPD病理過程。本研究發(fā)現(xiàn)COPD 大鼠肺組織miR-34a表達降低，進一步抑制miR-34a 后，大鼠Notch 介導(dǎo)的炎癥損傷及免疫反應(yīng)途徑也進一步加重，提示miR-34a缺失，Notch 表達上調(diào)，可能是引起COPD 大鼠炎癥反應(yīng)及免疫功能失衡的重要原因。BYF 作用后可上調(diào)miR-34a 表達，下調(diào)Notch 表達，且上述作用可被miR-34a antagomir 逆轉(zhuǎn)，提示BYF 改善大鼠炎癥反應(yīng)及免疫功能失衡作用，可能是通過調(diào)控miR-34a/Notch軸來實現(xiàn)。

綜上所述，BYF 可能通過上調(diào)miR-34a 表達，抑制Notch通路激活，改善COPD 大鼠炎癥反應(yīng)及免疫功能失衡。但COPD 炎癥反應(yīng)及免疫功能失衡機制復(fù)雜，BYF 也可能通過其他通路發(fā)揮作用，有待后續(xù)研究。