DKK-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的研究進(jìn)展①

王穎旎 武 平 余澤蕓 羅 云 （成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，成都 610075）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性全身性的自身免疫性疾病，早期可出現(xiàn)骨侵蝕，逐漸惡化引發(fā)關(guān)節(jié)損害，導(dǎo)致患者關(guān)節(jié)功能受損、生活質(zhì)量下降，其致殘率高達(dá)60%～80%［1-3］。RA發(fā)病機(jī)制尚不明確，婦女、吸煙者和有家族史者最易受影響［4］。近年來，骨代謝機(jī)制及其與RA相關(guān)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)已成為研究熱點(diǎn)，骨骼質(zhì)量及結(jié)構(gòu)完整性受骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)影響。RA 骨丟失是由于破骨細(xì)胞吸收骨量與成骨細(xì)胞形成骨量失衡所致［5］。研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路是成人關(guān)節(jié)軟骨與退行性軟骨組織的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，參與細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育和干細(xì)胞維護(hù)等生物學(xué)過程。經(jīng)典Wnt傳導(dǎo)通路受到多種細(xì)胞因子調(diào)節(jié)，同時與破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞及滑膜成纖維細(xì)胞密切相關(guān)，在RA 骨代謝中扮演重要角色［1，6］。Dickkopf-1（DKK-1）作為Wnt/β-catenin 途徑的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子受到廣泛關(guān)注，在RA骨代謝機(jī)制中尤為重要，可作為調(diào)節(jié)Wnt信號通路的潛在治療靶點(diǎn)，從而對RA 患者的骨丟失起保護(hù)作用。本文主要探討Wnt信號通路及其負(fù)調(diào)蛋白DKK-1 在RA 中的作用，以及DKK-1 在RA 治療中的研究進(jìn)展，以期為RA的臨床治療提供新思路。

1 DKK-1蛋白結(jié)構(gòu)及生物學(xué)特征

DKK-1 屬于富含半胱氨酸蛋白（Dickkopf）家族，1998 年發(fā)現(xiàn)于非洲蟾蜍胚胎細(xì)胞中，并對胚胎中頭頸部形成的誘導(dǎo)有顯著影響［7］。缺乏DKK-1可導(dǎo)致頭部和四肢發(fā)育不足［8］。位于人類10 號染色體10q11 上的DKK-1 基因，其編碼的分泌性糖蛋白內(nèi)含266 個氨基酸，包括31 個氨基酸組成的N 端信號肽段、2 個半胱氨酸富集區(qū)（Cys-1、Cys-2）以及具有糖基化作用的C 端，全長為3 377 nt［9］。DKK 家族由225～350 個氨基酸殘基組成，主要含DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4 4 種分泌蛋白。其中DKK-1/2/4 主要參與經(jīng)典Wnt 信號通路調(diào)控，DKK-1/4 對經(jīng)典Wnt 信號通路主要起拮抗作用，DKK-1 的作用稍強(qiáng)，DKK-2 則根據(jù)細(xì)胞環(huán)境對Wnt 信號通路起激動或拮抗作用，DKK-3 盡管不參與經(jīng)典Wnt 信號通路的調(diào)控，但對腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著重要影響，能負(fù)性調(diào)節(jié)β-catenin 及其下游信號通路，抑制腫瘤增長與遷移，加速腫瘤細(xì)胞凋亡［10］。而DKK-1 可加強(qiáng)滑膜成纖維細(xì)胞血管生成和軟骨降解活性，導(dǎo)致滑膜血管生成和軟骨破壞［11］。

因此，DKK-1 作為Wnt 信號通路的主要負(fù)調(diào)蛋白，其過度表達(dá)可影響成骨細(xì)胞活性，加速骨破壞進(jìn)程，在骨代謝方面起著重要作用。

2 Wnt/β-catenin信號通路

Wnt 基因首先在果蠅胚胎發(fā)育研究中被發(fā)現(xiàn)，也有研究發(fā)現(xiàn)鼠類乳腺癌病毒誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中克隆出一種原癌基因-Int-1 基因與果蠅胚胎無翅基因?yàn)橥椿?，故將兩者命名為Wnt［12-14］。Wnt/β-catenin 信號通路是復(fù)雜的蛋白信號網(wǎng)絡(luò)，主要分為經(jīng)典Wnt信號通路和非經(jīng)典Wnt信號通路。目前研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路在細(xì)胞生長分化、腫瘤發(fā)育及骨代謝等方面都有特殊的影響［15-16］。DKK-1 主要作用于經(jīng)典Wnt 信號通路，起到拮抗該通路作用。經(jīng)典Wnt 通路的激活由β 蛋白（β-catenin）轉(zhuǎn)換而來，可促進(jìn)新骨生成，Wnt配體與靶細(xì)胞表面的低密度脂蛋白相關(guān)受體蛋白5/6（LRP5/6）家族、卷曲蛋白（Frizzled）家族相結(jié)合，形成二聚體，激活經(jīng)典Wnt 通路［17］。當(dāng)經(jīng)典Wnt 通路被激活時，β-catenin在細(xì)胞內(nèi)大量積聚，通過核易位與轉(zhuǎn)錄因子（TCF）/淋巴增強(qiáng)因子（LEF）結(jié)合，并激活基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而影響成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞［18-19］。當(dāng)Wnt 通路受到抑制時，骨形成受到影響，導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和變形。

因此，經(jīng)典Wnt 信號通路在骨細(xì)胞的分化和成熟中發(fā)揮重要作用，激活該信號通路可加快骨細(xì)胞的分化速度，促進(jìn)新骨生成，而抑制該信號通路可加速細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞甚至畸形，所以維持Wnt信號通路的功能正常在骨代謝相關(guān)疾病中尤為重要。

3 DKK-1/Wnt與RA

3.1 DKK-1 與RA 的相關(guān)性 RA 是臨床常見的自身免疫性疾病，其病程進(jìn)展中的骨代謝異?？梢鸸敲訝€和骨缺失。目前研究發(fā)現(xiàn)過度分泌的炎癥細(xì)胞因子持續(xù)刺激滑膜細(xì)胞，引發(fā)胞內(nèi)蛋白激酶持續(xù)被激活，導(dǎo)致滑膜細(xì)胞功能障礙，是RA 關(guān)節(jié)僵硬、畸形的主要原因［20］。有研究發(fā)現(xiàn)，在RA 炎癥高峰期，骨侵蝕部位有DKK-1 蛋白表達(dá)，在RA 中DKK-1 是抑制骨生成而造成骨質(zhì)流失和骨破壞的重要指標(biāo)［21-22］。國內(nèi)臨床流行病學(xué)研究表明，RA 患者血清中DKK-1 表達(dá)較健康人顯著升高［23］。RA 患者血清中DKK-1 上升，與骨結(jié)構(gòu)改變、骨密度降低、關(guān)節(jié)損傷相關(guān)［24］。國外臨床研究同樣顯示，DKK-1在血清中水平越高，RA患者關(guān)節(jié)功能越差［25］；DKK-1含量與疾病活動度呈正相關(guān)［24］。JUAREZ 等［26］研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1 的差異表達(dá)在RA 早期中被檢測到，表明DKK-1 過度表達(dá)可能是RA 進(jìn)展中一個關(guān)鍵因素，并發(fā)生在疾病早期。同樣在TNF 驅(qū)動的RA 模型中，DKK-1 拮抗劑可防止骨侵蝕并增加骨膜骨形成，提示中和DKK-1 生物活性可能抑制RA 骨侵蝕［23］。

上述研究表明，血清中DKK-1 水平與骨結(jié)構(gòu)改變、骨密度降低、關(guān)節(jié)損傷相關(guān)；DKK-1 血清水平越高，RA 患者關(guān)節(jié)功能越差，其在成人骨量及關(guān)節(jié)重塑方面起著負(fù)面作用。因此，通過抑制DKK-1 的表達(dá)，支持骨修復(fù)的合成代謝微環(huán)境的生成，或可成為治療RA的靶點(diǎn)之一。

3.2 DKK-1 對Wnt 的調(diào)控機(jī)制 經(jīng)典Wnt 信號通路對骨代謝起關(guān)鍵作用，與骨發(fā)育、骨組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)等密切相關(guān)，該通路的激活可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使成骨細(xì)胞分化［27］。DKK-1 屬于Dickkopf 家族，其基因散在分布于Wnt通路組件的上游，可通過與LRP5/6 結(jié)合，阻止Wnt-Frz-LRP5/6 復(fù)合物的形成，阻礙Wnt 信號通路的激活，抑制新骨形成［28-29］（見圖1）。骨內(nèi)微環(huán)境處于動態(tài)平衡狀態(tài)，DKK-1過度表達(dá)可導(dǎo)致骨內(nèi)微環(huán)境失衡，抑制成骨細(xì)胞進(jìn)一步分化，導(dǎo)致骨生成障礙，加速骨丟失，即在炎癥過程中，骨生成被抑制。DKK-1 是成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨生成過程的重要負(fù)調(diào)蛋白，通過對Wnt/β-catenin 信號通路的負(fù)調(diào)節(jié)作用而封鎖成骨細(xì)胞的分化，同時通過與骨保護(hù)素/核因子受體激活劑/前體細(xì)胞表面受體軸的“交互對話”效應(yīng)，促進(jìn)破骨細(xì)胞的成熟，打破骨代謝的平衡穩(wěn)態(tài)，加重骨破壞［30-31］。因此，通過下調(diào)DKK-1 的表達(dá)水平來維持骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，可為炎癥等引起的骨丟失提供新診療思路。

圖1 WNT/DKK-1的作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of action of WNT/DKK-1

3.3 Wnt與RA 的相關(guān)性 經(jīng)典Wnt信號通路影響骨骼發(fā)育及控制軟骨和骨轉(zhuǎn)換過程，對骨代謝的動態(tài)平衡調(diào)節(jié)至關(guān)重要，RA 的骨丟失正是由于這種平衡被打破所致［5］。故在RA 骨平衡方面，激活Wnt信號通路可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的成熟及分化，封鎖破骨細(xì)胞功能，從而使侵蝕骨得到修復(fù)［32］。此外Wnt 信號通路也參與RA 炎癥反應(yīng)，成纖維樣滑膜細(xì)胞（fibroblast-like synoviocytes，F(xiàn)LS）是RA 最重要的病理特征，在RA患者滑膜的FLS內(nèi)有許多與骨侵蝕相關(guān)的炎癥因子，促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)降解，導(dǎo)致軟骨和骨的持續(xù)性破壞。Wnt 信號通路不僅可以通過調(diào)節(jié)FLS 中纖維連接蛋白的表達(dá)，也能引起炎癥因子如IL-1、IL-6、TNF-α 等表達(dá)，介導(dǎo)RA 炎癥反應(yīng)。而炎癥反應(yīng)可以激活Wnt 信號通路，SAITO 等［33］研究表明，RA 炎癥得到控制后，該信號通路中負(fù)調(diào)控因子數(shù)量明顯減少。MATZELLE 等［34］發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)骨糜爛的修復(fù)發(fā)生在炎癥消退的背景下，并伴隨Wnt 信號通路的改變。

RA 作為炎癥關(guān)節(jié)疾病，其病情進(jìn)展與滑膜的慢性炎癥密切相關(guān)，F(xiàn)LS 產(chǎn)生的炎癥因子可引起不同程度骨質(zhì)破壞。因此，經(jīng)典Wnt 信號通路不僅在RA 骨代謝方面有著極大影響，也在炎癥機(jī)制方面與RA關(guān)系密切。

4 關(guān)于DKK-1的靶向治療

在RA 骨破壞過程中，Wnt/β-catenin 信號通路在關(guān)節(jié)損傷及修復(fù)過程中起關(guān)鍵作用，如何使骨內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)定成為治療RA 的關(guān)鍵。近年來，越來越多的有關(guān)RA 治療的研究指向經(jīng)典Wnt 信號通路的負(fù)調(diào)蛋白-DKK-1。

4.1 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)治療 POLZER 等［35］的研究中，通過對RA小鼠進(jìn)行抗DKK-1抗體治療后，發(fā)現(xiàn)抗DKK-1抗體可防止骨糜爛，促進(jìn)骨贅形成，激發(fā)骨重塑。目前西醫(yī)針對DKK-1 的靶向治療多采用生物療法，研究表明生物治療能夠減緩骨破壞，抑制RA 的放射學(xué)進(jìn)展，這種效應(yīng)可能與Wnt 信號有關(guān)［36］。而生物治療多集中在TNF-α 抑制劑，IL-1 受體拮抗劑（IL-1Ra）及anti-IL-6 單克隆抗體。在研究中，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DKK-1 缺失的小鼠模型中DKK-1 表達(dá)的減少可引起骨量顯著增加，DKK-1 抗體可使RA 小鼠的骨溶解轉(zhuǎn)換為骨生成，而TNF-α 抑制劑可使患者血清中DKK-1 水平顯著降低［28，37-38］。ADAMI 等［37］發(fā)現(xiàn)在anti-TNF-α 治療6 個月后RA 患者血清中DKK-1 含量減少（大多數(shù)患者采用阿達(dá)木單抗和賽妥珠單抗治療，較少患者采用依那西普，英夫利昔單抗和高利單抗治療）。FASSIO 等［38］發(fā)現(xiàn)予以RA患者TNF-α 抑制劑--賽妥珠單抗（CMZ）治療2 個月后，RA 患者血清DKK-1 含量快速下降，骨吸收減少，骨形成增加。表明在以TNF-α為靶點(diǎn)的抗TNF-α療法中，患者血清中DKK-1 水平均顯著降低，關(guān)節(jié)疼痛減輕，提示抗TNF-α 治療不僅具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛作用，還能提升RA 患者成骨能力，改善骨內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，減少骨丟失，延緩骨破壞進(jìn)程。其次，在BRIOT 等［39］為期一年的前瞻性開放研究中也發(fā)現(xiàn)，接受抗IL-6 單克隆抗體托西珠單抗（TCZ）和甲氨蝶呤（MTX）治療后的RA 患者，血清DKK-1 水平顯著下降，骨形成標(biāo)志物升高。即IL-6 可通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的激活和分化來促進(jìn)全身骨吸收，而TCZ 作為IL-6 受體抑制劑，可通過顯著減少骨髓中破骨細(xì)胞前體的數(shù)量來防止全身性骨丟失，抑制骨吸收，骨形成標(biāo)志物升高。還有WANG 等［40］在研究中采用TNF-α抑制劑英夫利昔單抗（infliximab）和IL-1受體拮抗劑阿那白滯素（IL-1Ra）治療RA 患者，觀察到RA 患者血清中DKK-1 含量顯著下降。表明IL-1Ra作為內(nèi)源性的IL-1抑制劑，可與IL-1受體競爭，阻止IL-1 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制IL-1 介導(dǎo)的滑膜炎癥和關(guān)節(jié)破壞。另外，ZHANG 等［41］發(fā)現(xiàn)重組人DKK-1 多表位DNA 疫苗可誘導(dǎo)特異性抗體，可有效中和DKK-1 生物學(xué)活性，減輕CIA 小鼠的骨損傷，也可能為RA 治療提供一種新的方法。

由于RA 關(guān)節(jié)僵硬畸形與炎癥密切相關(guān)，以上生物療法選用促炎因子抑制劑，如TNF-α 抑制劑，IL-1 受體拮抗劑及anti-IL-6 單克隆抗體等，通過抑制相關(guān)炎性因子降低血清中DKK-1 水平，阻止骨破壞，從而抑制關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)性損傷，激發(fā)骨重塑。研究表明，生物療法對改善RA 患者關(guān)節(jié)的疼痛腫脹、僵硬畸形等方面具有一定的療效。但是，生物療法毒副作用較大，患者需要長期治療，易引起肝腎功能、胃腸系統(tǒng)損害，以及價格昂貴等弊端，多數(shù)患者難以負(fù)擔(dān)。因此，臨床急需尋找安全有效的治療方法。

4.2 中醫(yī)中藥治療 中醫(yī)在RA 的治療中有其獨(dú)特優(yōu)勢，有研究表明，中醫(yī)治療RA 具有良好的抗炎鎮(zhèn)痛療效及免疫調(diào)節(jié)作用，能延緩病情發(fā)展，具有毒副作用小，價格低廉等特點(diǎn)，是一種理想治療方法［42-45］。楊鋒等［46］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活血化瘀中藥可下調(diào)DKK-1 表達(dá)，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號通路來增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性以促使新骨生成。李波等［44］通過分析清熱活血方藥對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠Wnt/βcatenin 信號通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)清熱活血方藥可以有效下調(diào)CIA大鼠滑膜DKK-1表達(dá)和血清DKK-1 含量，在CIA 大鼠骨破壞過程中發(fā)揮骨保護(hù)作用。那仁滿都拉等［47］采用具有清熱、止痛、消腫功用的蒙藥森登-4湯觀察CIA 大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)改變，發(fā)現(xiàn)高劑量蒙藥森登-4 湯能顯著下調(diào)大鼠爪關(guān)節(jié)DKK-1 蛋白表達(dá)，有明顯的骨破壞抑制作用。蔡敘東等［45］認(rèn)為破骨細(xì)胞是參與RA 骨破壞的主要細(xì)胞，斷藤益母湯對破骨細(xì)胞的活性具有抑制功效，且藥物濃度越高，抑制功效越顯著。斷藤益母湯可通過影響Wnt/β-catenin 信號通路，上調(diào)Wnt3a、β-catenin 蛋白表達(dá)，下調(diào)DKK-1 蛋白表達(dá)、抑制破骨細(xì)胞成熟，延緩RA 的骨破壞進(jìn)程。上述研究表明，清熱活血化瘀藥物能夠通過調(diào)節(jié)血清DKK-1 含量，作用于Wnt/β-catenin 通路，減緩RA 患者骨破壞進(jìn)程。

也有研究選用由黃芪、白術(shù)、龍膽草等組成的類風(fēng)濕Ⅰ號方觀察經(jīng)治療后的佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠（adjuvant arthritis，AA）血清DKK-1 含量，發(fā)現(xiàn)類風(fēng)濕Ⅰ號可有效下調(diào)DKK-1 表達(dá)，維持Wnt 信號通路平衡［48］。董壯［49］通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)尖葉假龍膽與秦艽配伍可降低CIA 大鼠血清DKK-1 的水平，使之趨向正常。其作用機(jī)制可能是對Wnt/β-catenin 信號通路的調(diào)節(jié)作用，減少骨破壞。上述研究表明，健脾除濕藥物除可顯著緩解RA 患者關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，亦可通過調(diào)節(jié)血清中DKK-1 的含量，作用于Wnt/βcatenin通路，延緩RA骨破壞進(jìn)程。

另外，趙慧等［50］通過觀察由陽和湯化裁而來的補(bǔ)腎通督膠囊對腎虛寒凝型RA 患者DKK-1 的影響，補(bǔ)腎通督膠囊能減少血清DKK-1 含量，減少對Wnt信號通路的拮抗，使骨形成增加。腎主骨生髓，腎虛補(bǔ)督壯骨，則可化氣布精，充養(yǎng)四肢百骸，經(jīng)絡(luò)通而痹證除。即補(bǔ)腎壯骨藥物能減輕DKK-1對Wnt信號通路的傳導(dǎo)阻滯，使骨形成增加。

上述研究表明，中醫(yī)中藥可通過清熱活血化瘀、健脾除濕及補(bǔ)腎壯骨等方面對RA 發(fā)揮治療效果，其主要機(jī)制可能與下調(diào)DKK-1 表達(dá)，調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin 信號通路，從而增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性，促使新骨生成有關(guān)，最終達(dá)到減輕RA 關(guān)節(jié)疼痛腫脹，調(diào)節(jié)免疫，修復(fù)軟骨，延緩關(guān)節(jié)變形等作用。

4.3 針灸治療 中醫(yī)針灸對RA 也有較好的抗炎鎮(zhèn)痛療效及免疫調(diào)節(jié)作用，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究和臨床研究證實(shí)，針灸能延緩RA 病情發(fā)展，改善臨床癥狀［51-53］。但關(guān)于針灸干預(yù)DKK-1 的相關(guān)研究較少，研究多集中在中草藥方面。針灸作為在傳統(tǒng)中醫(yī)理論指導(dǎo)下的一種外治療法，針刺或艾灸相應(yīng)腧穴同樣能起到活血化瘀、健脾除濕、補(bǔ)腎壯骨等作用，且艾灸具有操作簡單方便，毒副作用小，價格低廉，療效好及收效快，患者易于接受等特點(diǎn)。值得進(jìn)一步的思考和探索。

綜上所述，Wnt/β-catenin 信號通路不僅能促使TNF-α、IL-6 等炎癥因子表達(dá)，介導(dǎo)RA 炎癥反應(yīng)，亦可參與RA 骨代謝，對維持骨內(nèi)微環(huán)境穩(wěn)定發(fā)揮重要作用。DKK-1 作為該通路的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，可與LRP5/6 結(jié)合，阻止Wnt-Frz-LRP5/6 復(fù)合物形成，抑制該通路傳導(dǎo)，影響新骨形成，破壞關(guān)節(jié)功能。故下調(diào)DKK-1 的表達(dá)水平以維持骨內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，可能成為延緩RA 患者骨破壞的關(guān)鍵。由于DKK-1 在RA 治療中的高靶向性，西醫(yī)目前針對DKK-1 的靶向治療多集中在TNF-α 抑制劑、IL-1Ra 及anti-IL-6等生物療法上，對RA 患者病情的改善具有一定療效，但因其價格昂貴，且有毒副作用，不宜長期應(yīng)用。中醫(yī)中藥具有清熱活血化瘀、健脾除濕以及補(bǔ)腎壯骨作用，能顯著緩解RA 患者關(guān)節(jié)疼痛等癥狀，并可以通過調(diào)節(jié)血清中DKK-1 的含量，作用于Wnt/β-catenin 通路，使RA 骨侵蝕得到修復(fù)，值得進(jìn)一步研究。針灸亦可起到活血化瘀、健脾除濕、補(bǔ)腎壯骨等作用，且作為外治療法，有獨(dú)特優(yōu)勢，可以長期應(yīng)用于臨床，因此更值得進(jìn)一步研究?？傊?，將DKK-1 作為治療RA 的刺激靶點(diǎn)，對DKK-1 的結(jié)構(gòu)、作用機(jī)制及其對RA 的影響進(jìn)行分析，探討DKK-1在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的研究進(jìn)展，可為臨床治療RA提供新思路。