TLR4、PCSK9、ox-LDL 在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中的表達(dá)及對并發(fā)頸動脈硬化的預(yù)測價值

張素真 趙旭輝 郝世瑞 劉丹丹 （邢臺市人民醫(yī)院，邢臺 054000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是臨床常見自身免疫性結(jié)締組織疾病，年輕女性多發(fā)，可累及多系統(tǒng)、多器官，其中心腦血管系統(tǒng)最易受累［1］。據(jù)統(tǒng)計顯示，SLE 患者心腦血管疾病發(fā)病率約是正常人的5 倍［2］。但如何簡單、有效監(jiān)測SLE患者心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程以指導(dǎo)臨床完善治療方案仍是困擾臨床的重點、難點。近年研究證實，頸動脈硬化（carotid atherosclerosis，CA）發(fā)生發(fā)展與心腦血管疾病發(fā)生具有高度相關(guān)性［3-4］。因此，從CA相關(guān)病理生理層面或可為臨床監(jiān)測SLE并發(fā)心腦血管疾病提供新視角。氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，基礎(chǔ)試驗表明，其能通過多種生物學(xué)效應(yīng)激發(fā)動脈硬化［5］；Toll樣受體4（TLR4）是一種模式識別受體，在不同炎癥損傷條件下，其作為膜表面信號轉(zhuǎn)導(dǎo)介質(zhì)啟動細(xì)胞中信號傳導(dǎo)并激活細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)［6］；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9（PCSK9）是肝臟合成分泌的一種蛋白酶，參與脂質(zhì)代謝、炎癥相關(guān)信號通路激活等多個病理生理過程，其在CA 患者及動物模型中均可觀察到高水平狀態(tài)［7-8］?；赥LR4、PCSK9、ox-LDL均是當(dāng)前研究與炎癥、脂質(zhì)代謝相關(guān)熱點，本研究嘗試分析上述物質(zhì)在SLE 患者中表達(dá)及對CA 的預(yù)測價值，旨在為臨床完善CA 患者心腦血管疾病“未病先治”的防治機(jī)制提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1 一般資料 選取邢臺市人民醫(yī)院2017 年6 月至2020 年5 月116 例SLE 患者，根據(jù)有無CA 分為CA 組（30 例）與無CA 組（86 例），另選擇同期健康體檢者58 例作為健康對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合SLE 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；經(jīng)超聲診斷確診是否存在CA，且入組前未經(jīng)CA 相關(guān)治療；健康對照組體健，無可能影響本研究結(jié)果疾?。换颊?、家屬知情理解簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴嚴(yán)重腎功能缺陷、中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、心臟損傷、溶血性貧血、血管炎者；有腫瘤疾病或腫瘤疾病史者；近期應(yīng)用他汀類藥物者；現(xiàn)癥感染者。

1.1.2 實驗試劑及儀器 外周血單個核細(xì)胞（PBMC）分離試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；PCSK9 酶聯(lián)免疫試劑盒購自上海朗頓生物科技有限公司；ox-LDL 酶聯(lián)免疫試劑盒購自成都華神生物技術(shù)有限責(zé)任公司；飛利浦彩色多普勒超聲診斷儀（Philips EPIQ 7C型），探頭型號L12-3。

1.2 方法

1.2.1 TLR4、PCSK9 和ox-LDL 檢測 采用抗凝真空管采集肘空腹靜脈血2 ml，采用淋巴細(xì)胞分離液分離PBMC，磷酸鹽緩沖液洗滌2 遍，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×106個/ml，檢 測PBMC 中TLR4 蛋 白 相 對 表 達(dá)量。另采用促凝膠真空管采集清晨空腹肘靜脈血2 ml，離心（半徑10 cm，轉(zhuǎn)速3 500 r/min，時間15 min），采集上層血清，采用酶聯(lián)免疫試劑盒測PCSK9和ox-LDL水平。操作均由資深檢驗技師參考試劑盒說明書步驟規(guī)范完成。

1.2.2 超聲檢測 采用彩色多普勒超聲診斷儀自頸動脈開始，由上而下探查雙側(cè)頸總動脈、內(nèi)外動脈分叉處、內(nèi)動脈顱外段，記錄頸動脈內(nèi)膜中層厚度（IMT），若IMT＞0.9 則為管壁內(nèi)膜中層增厚，若IMT≥1.3則已形成斑塊，即為CA。

1.2.3 觀察指標(biāo) ①對比3 組一般資料；②分析TLR4、PCSK9、ox-LDL 與SLE 疾病活動度（SLEDAI）評分關(guān)系。SLEDAI 評分標(biāo)準(zhǔn)：基本不活動為0～4分；輕度活動為5～9 分；中度活動為10～14 分；重度活動為15 分及以上；③分析CA 組、無CA 組TLR4、PCSK9、ox-LDL 與IMT 相關(guān)性；④分析TLR4、PCSK9、ox-LDL 與SLE 并 發(fā)CA 的 關(guān) 系；⑤分 析TLR4、PCSK9、ox-LDL對SLE并發(fā)CA預(yù)測價值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS25.0處理數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以例數(shù)描述，采用χ2檢驗，計量資料采取Bartlett 方差齊性檢驗與Kolmogorov-Smirnov 正態(tài)性檢驗，均確認(rèn)具備方差齊性且近似服從正態(tài)布，以±s描述，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩組間比較采用LSD-t檢驗；Pearson 相關(guān)性系數(shù)、Logistic 回歸模型分析變量間關(guān)系；預(yù)測效能分析采用受試者工作特征（ROC）曲線，獲取曲線下面積（AUC）、置信區(qū)間（95%CI）、敏感度、特異度及cut-off 值，不同預(yù)測方案間AUC 值比較采用MedCalc 軟件分析，進(jìn)行DeLong 檢驗，聯(lián)合診斷實施Logistic 二元回歸擬合，返回預(yù)測概率logit（p），將其作為獨立檢驗變量。均采用雙側(cè)檢驗，α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 3組患者年齡、性別、吸煙史、飲酒史差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；3組患者BMI、IMT、TLR4蛋白相對表達(dá)量、血清PCSK9、ox-LDL水平及高血壓、高脂血癥發(fā)生率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CA組與無CA組比較，SLE病程、SLEDAI評分、糖皮質(zhì)激素用量差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 3組一般資料比較Tab.1 Comparison of three groups of general data

2.2 TLR4、PCSK9、ox-LDL 與SLEDAI 評 分 相 關(guān)性 Pearson相關(guān)性分析顯示，CA組、無CA組PBMC中TLR4 蛋白相對表達(dá)量（r=0.766、0.631）、血清PCSK9（r=0.702、0.554）、ox-LDL（r=0.753、0.592）與SLEDAI 評分呈正相關(guān)（P＜0.05），且CA 組相關(guān)性更為顯著，見圖1。

圖1 CA 組、無CA 組TLR4、PCSK9、ox-LDL 與SLEDAI評分相關(guān)性Fig.1 Correlation between TLR4，PCSK9，ox-LDL and SLEDAI scores in CA group and no-CA group

2.3 CA 組、無CA 組TLR4、PCSK9、ox-LDL 與IMT相關(guān)性 Pearson 相關(guān)性分析顯示，CA 組、無CA 組PBMC 中TLR4 蛋白相對表達(dá)量（r=0.854、0.692）、血 清PCSK9（r=0.820、0.749）、ox-LDL（r=0.849、0.709）與IMT 呈正相關(guān)（P＜0.05），且CA 組相關(guān)性更為顯著，見圖2。

圖2 CA 組、無CA 組TLR4、PCSK9、ox-LDL 與IMT相關(guān)性Fig. 2 Correlation between TLR4，PCSK9，ox-LDL and IMT in CA group and no-CA group

2.4 TLR4、PCSK9、ox-LDL 與SLE 并 發(fā)CA 的 關(guān)系 Logistic 回歸分析顯示，將SLE 病程、SLEDAI 評分、IMT、糖皮質(zhì)激素用量等其他因素調(diào)整后，PBMC中TLR4、血清PCSK9、ox-LDL與SLE并發(fā)CA顯著相關(guān)（P＜0.05），見表2。

表2 TLR4、PCSK9、ox-LDL與SLE并發(fā)CA的關(guān)系Tab.2 Relationship between TLR4，PCSK9，ox-LDL and SLE concurrent CA

2.5 TLR4、PCSK9、ox-LDL 對SLE 并發(fā)CA 的預(yù)測價值 根據(jù)CA 組與無CA 組PBMC 中TLR4 蛋白相對表達(dá)量、血清PCSK9、ox-LDL 水平繪制ROC 曲線，將PBMC 中TLR4 蛋白相對表達(dá)量、血清PCSK9、ox-LDL 進(jìn)行綜合回歸，建立Logistic 預(yù)測/診斷評估模型，再依據(jù)所得回歸系數(shù)β，歸一化加權(quán)計算并對應(yīng)處理各樣本資料，并據(jù)其進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用的ROC 分析，獲取聯(lián)合預(yù)測AUC 為0.919，大于TLR4 蛋白相對表達(dá)量、血清PCSK9、ox-LDL 水平單獨預(yù)測（P＜0.05），見表3、圖3。

表3 TLR4、PCSK9、ox-LDL對SLE并發(fā)CA的預(yù)測價值Tab.3 Predictive value of TLR4，PCSK9 and ox-LDL for concurrent CA in SLE

圖3 TLR4、PCSK9、ox-LDL對SLE并發(fā)CA的預(yù)測價值Fig.3 Predictive value of TLR4，PCSK9 and ox-LDL for concurrent CA in SLE

3 討論

SLE 主要病理生理特征是外周血內(nèi)分布大量自身抗體，并造成器官、組織損傷。近年隨SLE治療理念及技術(shù)不斷進(jìn)步，此病早期病死率得到顯著降低，但隨著患者生存期延長，并發(fā)CA 趨勢愈發(fā)突顯，且一項涉及879 例SLE 患者的橫斷面調(diào)查研究顯示，CA 患病率為9.7%，提示加強(qiáng)SLE 并發(fā)CA 監(jiān)測對防范其并發(fā)癥發(fā)生具有重要價值［10］。

血脂代謝異常在SLE 患者中較為常見，學(xué)者曹小燕等［11］研究表明，SLE 患者血脂水平變化與其疾病活動有關(guān)。其他研究顯示，降壓藥及激素類藥物的應(yīng)用及肝腎臟等器官免疫損傷均會提高脂代謝紊亂風(fēng)險，引起SLE患者血脂代謝異常［12-13］。ox-LDL是LDL 內(nèi)蛋白質(zhì)成分被氧自由基修飾后形成的一種過氧化物，可通過強(qiáng)化內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子及炎性介質(zhì)基因表達(dá)活性，刺激血管平滑肌細(xì)胞活化、增殖及誘導(dǎo)血小板聚集等多種生物學(xué)途徑造成血管內(nèi)皮功能紊亂，啟動CA 發(fā)生的病理過程［14］。本研究也發(fā)現(xiàn)，SLE 患者血清ox-LDL 水平高于健康群體，且并發(fā)CA 患者升高更為顯著（P＜0.05），與以往研究結(jié)果近似［15］。眾所周知，慢性炎癥持續(xù)刺激是動脈硬化發(fā)病的主要啟動機(jī)制之一，且近年有研究指出，先天性免疫及炎癥反應(yīng)的交互作用可在一定程度上促進(jìn)血管損傷的發(fā)生發(fā)展［16］。TLR4 是Ⅰ型跨膜糖蛋白家族主要成員，是第一個被認(rèn)識的人類TLR，也是最具典型特性的TLR，其主要表達(dá)在樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等與宿主防御相關(guān)細(xì)胞的表面，在先天性免疫、炎癥及動脈硬化間發(fā)揮橋梁作用［17-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，在SLE 及SLE 合并CA 患者中TLR4 蛋白相對表達(dá)量與血清ox-LDL 水平變化特征一致，隨此疾病發(fā)生發(fā)展逐漸升高。另外，有體外試驗發(fā)現(xiàn)，ox-LDL 存在條件下，巨噬細(xì)胞表面TLR4蛋白表達(dá)顯著升高［20］。推測ox-LDL、TLR4 可能在SLE 及SLE 合并CA 病理變化中存在一定關(guān)聯(lián)性。進(jìn)一步Pearson 相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PBMC 中TLR4 蛋白相對表達(dá)量、血清ox-LDL 與SLEDAI 評分呈正相關(guān)（P＜0.05），上述推測得到證實，說明二者均與SLE 活動度有關(guān)。分析主要是因SLE 活躍期，抑制性T 細(xì)胞作用減弱，B 淋巴細(xì)胞增殖分化，并大量生成抗體，與對應(yīng)抗原結(jié)合后形成免疫復(fù)合物繼而造成全身炎癥反應(yīng)，同時在免疫復(fù)合物、促炎細(xì)胞因子等共同誘導(dǎo)下啟動“炎癥反應(yīng)瀑式”效應(yīng)激活中性粒細(xì)胞生成ox-LDL 等活性氧化產(chǎn)物，與TLR4 等炎癥介質(zhì)互相作用加劇SLE 患者動脈損傷，形成惡性循環(huán)［21-24］。

PCSK9 是一種具多種生物活性的蛋白酶。學(xué)者研究表明，PCSK9 能通過與LDL 受體胞外段結(jié)合成復(fù)合體而促使胞內(nèi)內(nèi)吞小泡降解繼而阻斷LDL清除過程，致外周血LDL 水平升高［25］。此外，還有研究顯示，PCSK9 除與脂代謝有關(guān)外，同時參與炎癥反應(yīng)有關(guān)信號通路調(diào)節(jié)過程，在膿毒癥小鼠模型中，其功能缺少能通過提高對致病性脂質(zhì)清除能力而緩解全身炎癥反應(yīng)［26］。本研究也發(fā)現(xiàn)，SLE 患者及SLE 合并CA 患者血清PCSK9 水平顯著升高，提示PCSK9 可能亦參與SLE 發(fā)生發(fā)展過程，但其是否與CA 發(fā)生存在直接關(guān)系尚需探究。IMT 是目前臨床評價CA 發(fā)生發(fā)展的主要依據(jù)，因此，選擇IMT 作為媒介，本研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者無論是否發(fā)生CA 血清PCSK9、ox-LDL 水平、TLR4 蛋白相對表達(dá)量均與IMT 呈正相關(guān)（P＜0.05），且發(fā)生CA 時相關(guān)性更強(qiáng)，且血清PCSK9、ox-LDL 水平、TLR4 蛋白相對表達(dá)量是SLE 并發(fā)CA 的相關(guān)因素，客觀說明PCSK9 可能通過調(diào)節(jié)脂代謝及炎癥機(jī)制，并與ox-LDL、TLR4 蛋白共同作用增加SLE 并發(fā)CA 的風(fēng)險。進(jìn)一步ROC分析，結(jié)果顯示，ROC 曲線聯(lián)合預(yù)測AUC 為0.919，大于TLR4 蛋白相對表達(dá)量、血清PCSK9、ox-LDL 水平單獨預(yù)測（P＜0.05），說明TLR4、PCSK9、ox-LDL可從生化層面為臨床評估SLE 并發(fā)CA 風(fēng)險提供預(yù)警信息。但SLE合并CA發(fā)生發(fā)展的病因病機(jī)復(fù)雜，TLR4、PCSK9、ox-LDL 在SLE 合并CA 中的變化特征是否具有典型代表性仍需后期擴(kuò)大樣本范圍進(jìn)一步探究。

綜上可知，SLE 患者TLR4、PCSK9、ox-LDL 水平異常，尤其在并發(fā)CA 患者中，上述指標(biāo)異常程度更顯著，是并發(fā)CA 的危險因素，聯(lián)合檢測可為臨床評估CA發(fā)生風(fēng)險提供參考。