過(guò)敏性哮喘患者外周血循環(huán)TFR細(xì)胞的變化及臨床意義①

季 拓 龔 芳 呂蓓麗 申衛(wèi)紅 白仲虎 金 堅(jiān) （江南大學(xué)生物工程學(xué)院，無(wú)錫 214122）

過(guò)敏性哮喘是指由過(guò)敏原引起以免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）水平升高為主要特征的慢性呼吸道炎癥反應(yīng)，流行病學(xué)調(diào)查顯示過(guò)敏性哮喘患者占哮喘患者的50%以上，且隨著工業(yè)化的推進(jìn)、過(guò)敏原的增多，其發(fā)病率逐年提升［1-2］。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為過(guò)敏性哮喘主要受2 型輔助性T 細(xì)胞（T helper 2 cell，TH2）免疫反應(yīng)主導(dǎo)［3］。近年來(lái)一些新T 細(xì)胞亞群如輔助型T細(xì)胞17（helper T cell 17,TH17）、輔助型T 細(xì)胞9（helper T cell 9,TH9）、調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regula?tory T cell，TREG）在哮喘炎癥中的作用也逐漸被認(rèn)識(shí)［1，4］。本課題組對(duì)濾泡輔助性T 細(xì)胞（follicular helper T cells,TFH）開展了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)哮喘中TFH細(xì)胞異?；罨l(fā)生極化偏移，其中TFH2 細(xì)胞亞群通過(guò)分泌細(xì)胞因子IL-21、IL-4 促進(jìn)B 細(xì)胞向漿細(xì)胞分化、Ig 類別轉(zhuǎn)換和IgE 親和力成熟等環(huán)節(jié)，使得IgE水平異常增高從而加重哮喘炎癥［5-10］。

濾泡調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T follicular regulatory cell，TFR）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類負(fù)向調(diào)控生發(fā)中心體液免疫反應(yīng)的最主要CD4＋T 細(xì)胞亞群，TFR兼具TREG細(xì)胞及TFH細(xì)胞的雙重特性［11］：不僅表達(dá)TREG細(xì)胞特征分子如特異轉(zhuǎn)錄因子叉頭翼狀轉(zhuǎn)錄因子3（Foxp3）、細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4）和Blimp-1，而且表達(dá)TFH細(xì)胞標(biāo)志物如程序性死亡受體1（PD-1）、趨化性細(xì)胞因子受體5（CXCR5）、特異轉(zhuǎn)錄因子B 細(xì)胞淋巴瘤基因6（Bcl-6）和Ki67 等［12-13］。TFR細(xì)胞在次級(jí)淋巴器官生發(fā)中心通過(guò)抑制TFH細(xì)胞和B 細(xì)胞的過(guò)度活化，維持生發(fā)中心抗體生成的免疫平衡［14］。由于TFR細(xì)胞定位于淋巴濾泡，且淋巴組織取材的困難一度遲滯臨床研究。2014 年，外周血循環(huán)TFR（circulating TFR，cTFR）細(xì)胞一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便引起了眾多學(xué)者關(guān)注，相繼有越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道在多種自身抗體相關(guān)疾病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中cTFR細(xì)胞數(shù)量或功能變化，且cTFR細(xì)胞數(shù)量與疾病相關(guān)自身抗體水平高度相關(guān)［15-18］。然而，cTFR在過(guò)敏性哮喘發(fā)病中的作用尚未明確。本研究通過(guò)檢測(cè)過(guò)敏性哮喘患者的外周血cTFR細(xì)胞比例及其相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的變化，旨在探討cTFR在過(guò)敏性哮喘中的作用及可能機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 招募江南大學(xué)附屬醫(yī)院2021 年1 月至2021 年12 月收治的25 例過(guò)敏性哮喘患者，采集臨床資料（表1）。過(guò)敏性哮喘患者選擇標(biāo)準(zhǔn)參照全球哮喘防治創(chuàng)議（the global initiative for asthma，GINA）和2020 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)哮喘學(xué)組制定的《支氣管哮喘防治指南》［19］，即有胸悶、喘息、咳嗽的臨床癥狀，有可逆性氣流受限的客觀證據(jù)，且排除其他可導(dǎo)致哮喘樣癥狀的疾??；暴露于過(guò)敏原環(huán)境可誘發(fā)或加重癥狀；過(guò)敏原SPT 或IgE 中至少有一項(xiàng)陽(yáng)性。所有病例在入選前一周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素或其治療哮喘的藥物，無(wú)其他慢性病史且一周內(nèi)無(wú)急性感染。選擇同期在醫(yī)院體檢的健康志愿者為對(duì)照，均無(wú)慢性疾病以及過(guò)敏史，皮膚過(guò)敏原點(diǎn)刺試驗(yàn)為陰性，血清過(guò)敏原特異性抗體為陰性。兩組受試者的性別、年齡的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得江南大學(xué)附屬醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象均簽署知情同意書。

1.1.2 材料 Ficoll-PaqueTMPREMIUM 購(gòu)自GE Healthcare（貨 號(hào)17-1440-02）；PBS 購(gòu) 自CORNING（貨號(hào)21-040-CV）；DMSO 購(gòu)自Sigma（貨號(hào)D2650）；FBS 購(gòu)自Biological Industries（貨號(hào)BI04-001-1A）；細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Quanto Bio（貨號(hào)C191016）。流式抗體見(jiàn)表2。

1.2 方法

1.2.1 PBMCs 和血清的分離 采集健康志愿者和哮喘患者空腹靜脈血4 ml，置于含有EDTA 抗凝劑的真空采血管中，F(xiàn)icoll 密度梯度離心法分離PBMCs。用1 ml 含10% DMSO 的FBS 將2.5×106個(gè)PBMCs 置于細(xì)胞凍存管中，轉(zhuǎn)入凍存盒并置于-80 ℃冰箱過(guò)夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐進(jìn)行長(zhǎng)期凍存。采集健康志愿者和哮喘患者空腹靜脈血5 ml，置于含促凝劑的真空采血管中，3 000 r/min，離心10 min，分離血清，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血cTFR細(xì)胞比例 復(fù)蘇PBMCs，取1×106個(gè)PBMCs，重懸于50 μl 含2%FBS 的PBS 中，根據(jù)說(shuō)明書加入熒光抗體（CD3-AF532、CD19-SB436、TCRγδ-BV480、CD4-BV750、CD8a-BV570、CD25-PE、CD127-APC-R700、CXCR5-APC、CD45RA-AF488），4 ℃避光孵育45 min。孵育完成后用PBS 洗滌2 次，細(xì)胞重懸于100 μl 含2%FBS 的PBS 中，加入1 μl 7-AAD，避光孵育5 min。38 通道光譜流式細(xì)胞儀Cytek NL-CLC-3000 上檢測(cè)，使用FlowJo v10.6.2 軟件進(jìn)行流式數(shù)據(jù)分析。參考國(guó)內(nèi)華中科技大學(xué)的劉爭(zhēng)教授團(tuán)隊(duì)的圈門策略，將cTFR細(xì)胞定義為CD3+CD4+CD25highCD127lowCXCR5+CD45RAlow［20］。

1.2.3 流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)法檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平 根據(jù)細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書，檢測(cè)血清5 種CD4+T 細(xì)胞相關(guān)炎癥因子水平。具體步驟如下：在孔板中加入微球，抽濾去除孔中液體；在孔板中加入樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，避光震蕩孵育60 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；在孔板中加入二抗，避光震蕩孵育30 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；在孔板中加入藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素，避光震蕩孵育20 min；抽濾孔板中液體，洗液洗滌3 次；每孔加入100 μl 讀數(shù)液，混勻吸入流式管中，使用MECKMAN Navios流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 組間數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS23.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用t檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)。指標(biāo)間相關(guān)性采用Spearman 秩相關(guān)分析。數(shù)據(jù)以±s表示。使用GraphPad Prism 8軟件和RStudio進(jìn)行數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果

2.1 過(guò)敏性哮喘患者外周血cTFR細(xì)胞比例變化使用Cytek 全光譜流式細(xì)胞儀，對(duì)過(guò)敏性哮喘患者和健康志愿者外周血cTFR細(xì)胞進(jìn)行分析，圈門策略如圖1A。結(jié)果顯示，過(guò)敏性哮喘組中cTFR細(xì)胞顯著低于健康對(duì)照組［（0.42±0.08）vs（0.91±0.12），P＜0.01］（圖1B、C）。

圖1 健康對(duì)照組和過(guò)敏性哮喘組cTFR細(xì)胞比較Fig.1 Comparison of cTFR cells between healthy control group and allergic asthma group

2.2 過(guò)敏性哮喘患者血清細(xì)胞因子變化 使用流式細(xì)胞微球芯片捕獲技術(shù)，對(duì)過(guò)敏性哮喘患者和健康志愿者CD4+T 細(xì)胞相關(guān)血清細(xì)胞因子進(jìn)行分析（圖2A）。結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組相比，過(guò)敏性哮喘組IL-10［（10.03±5.71）vs（23.00±9.95），P＜0.001］和IFN-γ［（9.26±4.52）vs（15.88±2.39），P＜0.05］顯著降低，IL-4［（15.67±8.03）vs（6.28±3.41），P＜0.001］、IL-5［（16.25±6.16）vs（6.87±3.28），P＜0.01］和IL-13［（77.41±33.15）vs（31.64±15.53），P＜0.01］顯著升高（圖2B）。

圖2 過(guò)敏性哮喘患者血清細(xì)胞因子變化Fig.2 Changes of serum cytokines in patients with allergic asthma

2.3 過(guò)敏性哮喘患者外周血cTFR細(xì)胞和臨床指標(biāo)相關(guān)性 見(jiàn)圖3，對(duì)25 例哮喘患者外周血cTFR細(xì)胞與臨床指標(biāo)血清總IgE、C-反應(yīng)蛋白（CRP）水平、第1 秒用力呼氣容積（FEV1）占預(yù)計(jì)值的百分比FEV1%和嗜酸性粒細(xì)胞EOS絕對(duì)數(shù)，以及細(xì)胞因子的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cTFR與血清總IgE 呈負(fù)相關(guān)（r=-0.56，P＜0.05），與FEV1%呈正相關(guān)（r=0.60，P＜0.05），與血清CRP 以及EOS 無(wú)關(guān)。cTFR與IL-10 呈正相關(guān)（r=0.61，P＜0.05），與IFN-γ、IL-4、IL-5和IL-13無(wú)相關(guān)性。

圖3 cTFR細(xì)胞與過(guò)敏性哮喘臨床指標(biāo)相關(guān)性Fig.3 Correlation between cTFR cells and clinical indica?tors of allergic asthma

3 討論

IgE 調(diào)控是過(guò)敏性哮喘研究領(lǐng)域熱點(diǎn)問(wèn)題，但以往研究多聚焦于IgE正向調(diào)控。TFR細(xì)胞是新發(fā)現(xiàn)的具有抑制功能的一類CD4+T 細(xì)胞亞群，其在抑制生發(fā)中心B細(xì)胞過(guò)度增殖、類別轉(zhuǎn)換及高親和力抗體產(chǎn)生中發(fā)揮重要負(fù)向調(diào)節(jié)作用［21］。CLEMENT 等［14］研究小組揭示TFR細(xì)胞的缺失增強(qiáng)了抗原特異性IgE抗體的產(chǎn)生并加劇了肺部炎癥的實(shí)驗(yàn)，提示TFR細(xì)胞可能在IgE 生成中發(fā)揮重要負(fù)向調(diào)控作用。然而在花生過(guò)敏（灌胃方式）模型小鼠中，TFR細(xì)胞的缺失反而會(huì)導(dǎo)致花生特異性IgE 水平顯著下降，提示在食物過(guò)敏中TFR細(xì)胞可能起正向促進(jìn)作用［22］。由于TFR細(xì)胞位于生發(fā)中心，取材不易，更多團(tuán)隊(duì)將目光聚焦于cTFR。劉爭(zhēng)教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道［20］發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性鼻炎患者的cTFR細(xì)胞顯著降低，且cTFR細(xì)胞與IgE 積聚呈負(fù)相關(guān)。值得關(guān)注的是，過(guò)敏原特異免疫治療（aller?gen specific immunotherapy，AIT）后伴隨cTFR細(xì)胞水平的增高患者臨床癥狀緩解［20］。然而迄今為止，cTFR細(xì)胞在過(guò)敏性哮喘中對(duì)IgE的作用仍然不明確。

本課題組發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘患者外周血cTFR細(xì)胞的比例顯著下降，且與血清總IgE 呈負(fù)相關(guān)，提示cTFR細(xì)胞可能參與負(fù)向調(diào)控IgE 生成。IL-10 是一種多細(xì)胞來(lái)源的抗炎細(xì)胞因子，通過(guò)激活巨噬細(xì)胞抑制炎癥因子的分泌，也可抑制TH2 細(xì)胞功能，減輕氣道炎癥反應(yīng)［23］。小鼠實(shí)驗(yàn)證明生發(fā)中心TFR細(xì)胞可以分泌IL-10 抑制B 細(xì)胞產(chǎn)生IgE［24-25］。課題組通過(guò)檢測(cè)血清細(xì)胞因子水平，發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘患者血清IL-10 水平顯著下降，提示外周血cTFR細(xì)胞可能通過(guò)分泌IL-10 抑制IgE 的產(chǎn)生。TH1 和TH2 免疫失衡是哮喘公認(rèn)的免疫學(xué)機(jī)制。TH1 和TH2 及其相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4、IL-5 和IL-13 等參與過(guò)敏性哮喘的病理過(guò)程［26］。TH1 通過(guò)分泌抗炎因子IFN-γ 抑制嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，緩解過(guò)敏性哮喘發(fā)展；TH2 通過(guò)分泌IL-4 和IL-5 促進(jìn)B 細(xì)胞的增殖活化，誘導(dǎo)B 細(xì)胞合成IgE，分泌IL-13 破壞氣道上皮屏障，誘發(fā)氣道高反應(yīng)性［27］。本課題發(fā)現(xiàn)和以往的報(bào)道一致，過(guò)敏性哮喘患者血清IFN-γ 水平降低，IL-4、IL-5 和IL-13水平顯著提升［28-29］。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)敏性哮喘患者外周血cTFR細(xì)胞顯著減少，cTFR細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-10 降低，并且cTFR細(xì)胞水平和IgE 呈負(fù)相關(guān)，與疾病病情呈正相關(guān)，結(jié)果提示cTFR細(xì)胞可能在哮喘IgE病理性增加中發(fā)揮重要作用。