女貞子多糖聯(lián)合布地奈德在哮喘幼鼠模型中的免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用研究①

吳振奎 鐘麗花 劉延霞 劉玉玲 （海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院兒科，?？?571100）

哮喘是一種常見(jiàn)的慢性肺部炎癥性疾病，其特征為氣道高反應(yīng)性、可變性氣流受限和支氣管重塑［1-2］。盡管哮喘發(fā)病機(jī)制和治療手段研究越來(lái)越深入，但全球哮喘發(fā)病率仍不斷上升。哮喘作為目前9 歲兒童最常見(jiàn)慢性疾病之一，其患病率備受關(guān)注［3］。目前哮喘治療主要以藥物為主，可分為控制患者病情和緩解癥狀兩類。長(zhǎng)期口服或靜脈注射糖皮質(zhì)激素可引起免疫抑制和庫(kù)欣綜合征等副作用。吸入普通劑量的糖皮質(zhì)激素通常不會(huì)引起不良反應(yīng)［4］。但吸入糖皮質(zhì)激素后，約有80%～90%藥物沉積于咽部并被吞入胃腸道，最終沉積的糖皮質(zhì)激素會(huì)引起咽部或全身不良反應(yīng)。因此，有必要尋找其他有效藥物替代或減少糖皮質(zhì)激素用量，從而減少患者不良反應(yīng)。

目前認(rèn)為CD4+T淋巴細(xì)胞失衡引起的細(xì)胞因子異常釋放是引起氣道損傷、反應(yīng)性增強(qiáng)、重塑的主要原因［5-6］。CD4+T細(xì)胞根據(jù)功能不同可分為輔助性T（T helper，Th）細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（T regulatory cell，Treg）。Treg 主要調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答和其他免疫細(xì)胞功能，從而將涉及T 細(xì)胞的免疫應(yīng)答限制在一個(gè)適當(dāng)范圍，以避免損傷機(jī)體［7］。Treg 有多種亞型，其中CD4+CD25+Treg 可抑制Th 細(xì)胞，目前已在哮喘研究領(lǐng)域得到廣泛關(guān)注［8］。除Treg 外，自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞作為一種特殊的內(nèi)生淋巴細(xì)胞，同樣在對(duì)哮喘治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用，NK 細(xì)胞可通過(guò)與樹(shù)突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）作用并分泌炎癥因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用［9］。

此外，研究發(fā)現(xiàn)炎癥細(xì)胞可產(chǎn)生活性氧（reac?tive oxygen species，ROS），內(nèi)源性和外源性ROS 與氣道炎癥和哮喘嚴(yán)重程度有關(guān)［10］。由于抗氧化物是對(duì)抗氧化應(yīng)激所必需的，尋找具有抗氧化活性的哮喘治療藥物具有極大前景［11］。

女貞子屬木犀科，呈無(wú)葉綠素表型，因其金色葉子而被廣泛用作園藝灌木［12］。女貞子雖具有較高觀賞價(jià)值和環(huán)保價(jià)值，但其治療潛力尚不明確。LIU 等［13］在環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制模型中發(fā)現(xiàn)，女貞子多糖（Ligustrum vicaryiL. fruit polysac?charide，LVFP）具有免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用。鑒于尚無(wú)關(guān)于LVFP 在兒童哮喘中作用的報(bào)道，本研究擬通過(guò)建立哮喘幼鼠模型研究LVFP 對(duì)免疫和氧化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 SPF 級(jí)6 周齡BALB/c 小鼠（20～22 g）購(gòu)自常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司；馬斯亮藍(lán)G-250購(gòu)自中國(guó)索萊寶有限公司；卵清蛋白（OVA）、Giemsa染色液購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；氫氧化鋁購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；FITC-CD16、PE-CD56、FITC-CD11c、PE-CD86（B7-2）、FITC-CD4 及PECD25 購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司；IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IFN-γ及TGF-β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences Pharmmgen；RIPA 強(qiáng)裂解液、BCA 檢測(cè)試劑盒、封閉液、一抗及二抗稀釋液、ECL 發(fā)光顯影液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；一抗NLRP3（ab214185）、硝基絡(luò)氨酸（ab183392）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2，ab13533）、Optic Atrophy 1（OPA1，ab157457）、線粒體融合蛋白2（mitofusin 2，Mfn2）、動(dòng)力蛋白相關(guān)蛋白1（dynamin-re?lated protein 1，DRP1，ab184247）、線粒體分裂蛋白1（mitochondrial fission protein 1，F(xiàn)is1，ab71498）及β-actin（ab179467）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；傅里葉變換紅外光譜儀IRTracer-100 購(gòu)自日本島津公司；高壓離子色譜（high-performance ion chromatography，HPIC）系統(tǒng)（Dionex ICS-5000+HPIC）、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific 公司；高效凝膠過(guò)濾色 譜（high-performance gel filtration chromatography，HPGFC）系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Waters 公司；流式細(xì)胞儀FC500、臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；FinePointeTMRC氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測(cè)系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)BUXCO 公司；一抗多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Biotek公司。

1.2 方法

1.2.1 LVPF 提取與純化 將干燥的女貞子研磨成粉，40 目篩過(guò)濾，粉末溶于丙酮（粉末與丙酮比例為1∶3），振蕩24 h去除脂質(zhì)，3 000 r/min 離心5 min，棄上清，烘干，加入一定量蒸餾水（8∶11）50 ℃、250 w超聲提取80 min，棉花過(guò)濾，3 000 r/min 離心3 min去除殘?jiān)?0%乙醇沉淀濃縮上清，95%乙醇重復(fù)此過(guò)程，去上清，加入蒸餾水溶解提取物，3 000 r/min離心3 min 去除殘?jiān)?。采用DM101 大孔吸附樹(shù)脂去除色素。Sevage 試劑（氯仿/正丁醇體積比為4∶1）去除蛋白至考馬斯亮藍(lán)G-250 檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)變色反應(yīng)。將多糖冷凍干燥24 h，得到冷凍LVPF 粉末。采用透析袋（3 500 D）連續(xù)2 d 去除多糖中的小分子，每12 h 更換1 次蒸餾水，Sephadex G-200 柱層析法純化LVFP。

1.2.2 LVFP 分析與鑒定 LVFP 與純溴化鉀粉混合后置于瑪瑙研缽中，紅外線燈下均勻研磨，傅里葉變換紅外光譜儀檢測(cè)。HPIC 檢測(cè)LVFP 單糖，將5 mg LVFP 溶 解 于1 ml 2 mol/L 三 氟 乙 酸，121 ℃水解2 h，0.45μm 微孔濾膜過(guò)濾。在ICS-5000 離子色譜儀上采用CarboPac-PA20 柱和脈沖安培檢測(cè)器進(jìn)行單糖色譜分離，調(diào)整離子色譜分離條件并檢測(cè)8 種單糖標(biāo)準(zhǔn)品（巖藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖和果糖）混合物，0.5 ml/min恒流梯度洗脫［13］。采用HPGFC 進(jìn)行多糖分子質(zhì)量分析，多糖樣品在液相中溶解，微孔濾膜過(guò)濾。用于繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的分子量分別為135 350 D、36 800 D、9 750 D、2 700 D和180 D。

1.2.3 分組、幼鼠哮喘模型建立及LCVP 處理 所有幼鼠在空調(diào)動(dòng)物房中以12 h 光/12 h 暗循環(huán)飼養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。本研究所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)海南現(xiàn)代婦女兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。40只6周齡幼鼠隨機(jī)分為4 組：對(duì)照組（Control）、哮喘組（OVA）、OVA+布地奈德組、OVA+LVFP+布地奈德組。第1～3 天和第14 天腹腔注射200 μl 含0.8 mg氫氧化鋁及50μg OVA的生理鹽水致敏溶液對(duì)幼鼠進(jìn)行致敏，第14、17、20、23 和27 天將幼鼠置于霧化器內(nèi)吸入2%OVA 30 min 激發(fā)哮喘癥狀。除常規(guī)飲食外，Control 組幼鼠采用等體積生理鹽水代替OVA進(jìn)行致敏和激發(fā)，OVA+布地奈德及OVA+LVFP+布地奈德組幼鼠在第14～27天內(nèi)每日分別給予布地奈德（3 μg/d，吸入）或LVFP［（400 mg/（kg·d），灌胃］+布地奈德（3μg/d，吸入）。第28 天測(cè)定所有組幼鼠氣道反應(yīng)性，第29 天腹腔注射戊巴比妥后處死幼鼠，結(jié)扎右肺，0.5 ml 預(yù)冷PBS 灌洗左肺3 次，收集支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），1 000 r/min 離心5 min，收集上清，ELISA 測(cè)定炎癥因子水平，PBS重懸沉淀進(jìn)行炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù)，留取肺組織，Western blot檢測(cè)氧化蛋白水平，-80 ℃保存待用。免疫細(xì)胞分離方法參考文獻(xiàn)［14］。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析DCs、NK 細(xì)胞及Treg 比例 流式細(xì)胞儀測(cè)定骨髓源性樹(shù)突狀細(xì)胞（bone marrow derived DCs，BMDCs）、NK 細(xì)胞及Treg 比例，CXP 軟件2.3 分析。采用FITC-CD11c 和PE-CD86（B7-2）對(duì)BMDCs 進(jìn)行染色，F(xiàn)ITC-CD16 和PE-CD56對(duì)NK細(xì)胞進(jìn)行染色，F(xiàn)ITC-CD4 和PE-CD25 對(duì)Treg進(jìn)行染色。

1.2.5 氣道反應(yīng)性檢測(cè) 氣道阻力與肺順應(yīng)性檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定幼鼠氣道反應(yīng)性。第28 天腹腔注射60 mg/kg 戊巴比妥，行氣管切開(kāi)術(shù)，呼吸頻率設(shè)為160 次/min，吸入10μl 乙酰膽堿，濃度依次增高，分別為0、1、2、4、8 mg/ml，記錄3 min內(nèi)最大氣道阻力。

1.2.6 BALF 炎癥細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定重懸BALF細(xì)胞總數(shù)。Wright-Giemsa染色法鑒別嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。

1.2.7 ELISA測(cè)定BALF中炎癥因子IL-4、IL-5、IL-9、IL-10、IL-13、IFN-γ及TGF-β水平 根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)BALF上清中炎癥因子進(jìn)行測(cè)定，多功能酶標(biāo)儀進(jìn)行吸光度讀數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算濃度。

1.2.8 Western blot 測(cè)定肺組織氧化相關(guān)蛋白表達(dá) 向肺組織中加入一定量RIPA 強(qiáng)裂解液，研磨、超聲至得到肺組織勻漿，4 ℃、15 000 r/min 離心15 min，取上清，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，按1∶4 加入蛋白緩沖液，100 ℃加熱變性5 min。12%SDS-PAGE凝膠電泳分離等量肺組織勻漿蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，室溫封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4 ℃搖床孵育過(guò)夜，次日回收一抗，TBST 洗3 次，5 min/次，加入二抗室溫孵育，TBST 洗3 次，ECL 熒光成像系統(tǒng)中滴加顯影液進(jìn)行蛋白顯影，以β-actin為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分 析，數(shù) 據(jù) 以±s表 示，組 間 比 較 采 用Student'st檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVFP 鑒定 FTIR 觀察LVFP 多糖結(jié)構(gòu)表征，3 331 cm-1處特征寬峰對(duì)應(yīng)于O-H（可能包括N-H）伸縮振動(dòng)，2 920 cm-1處吸收峰對(duì)應(yīng)C-H 伸縮振動(dòng)吸收峰和糖吸收峰，1 587 cm-1處吸收峰表明-OH 彎曲振動(dòng)模態(tài)，1 407 cm-1處峰值由C-H 彎曲振動(dòng)導(dǎo)致，1 069 cm-1處吸收峰表明醇羥基形式C-O 伸縮彎曲振動(dòng)模態(tài)（圖1A）。HPIC 分析LVFP 單糖組成，根據(jù)單糖標(biāo)準(zhǔn)品洗脫時(shí)間、參照標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)多糖中所有單糖進(jìn)行鑒定，確定LVFP 主要由鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖組成，摩爾比為1.73∶7.51∶4.52∶1.59（圖1B、C）。以水溶性物質(zhì)右旋糖酐（分子量依次為180 D、2 700 D、9 750 D、368 000 D 和135 350 D）作為標(biāo)準(zhǔn)品，結(jié)合HPGFC法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定LVFP 分子量為88 974 D，以上結(jié)果與LIU 等［13］報(bào)道基本一致。

圖1 LVFP結(jié)構(gòu)特征鑒定Fig.1 Structural characterization of LVFP

2.2 LVFP 調(diào)節(jié)哮喘幼鼠DCs、NK 細(xì)胞、Treg 比例與Control 相比，OVA 組、OVA+布地奈德及OVA+LVFP+布地奈德組幼鼠DCs 顯著增多（P＜0.05），而NK 細(xì)胞和Treg 明顯減少（P＜0.05）。與OVA 組相比，單獨(dú)給予布地奈德及LVFP+布地奈德聯(lián)合用藥均可顯著減少DCs（P＜0.05），而NK 細(xì)胞和Treg 增加（P＜0.05），其中，LVFP+布地奈德聯(lián)用效果強(qiáng)于布地奈德單獨(dú)用藥（P＜0.05，圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組幼鼠DCs、NK細(xì)胞及Treg比例Fig.2 Flow cytometric analysis of DCs，NK cells，and Treg of young mice in each group

2.3 LVFP 降低哮喘幼鼠的氣道高反應(yīng)性 與Control組相比，OVA 處理幼鼠在乙酰膽堿濃度為1、2、4 和8 mg/ml 時(shí)均表現(xiàn)出顯著氣道阻性（P＜0.05）。與OVA 組相比，單獨(dú)給予布地奈德及LVFP+布地奈德聯(lián)合用藥在乙酰膽堿濃度為1、2、4 和8 mg/ml 時(shí)氣道阻性顯著降低（P＜0.05），LVFP+布地奈德聯(lián)用效果更為顯著（P＜0.05，圖3）。

圖3 LVFP與布地奈德對(duì)哮喘幼鼠氣道反應(yīng)性的影響Fig.3 Effects of LVFP and budesonide on airway resis?tance of young mice with asthma

2.4 LVFP 抑制哮喘幼鼠氣道炎癥細(xì)胞聚集 與Control 組相比，OVA 處理幼鼠BALF 中嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.05），單獨(dú)給予布地奈德或LVFP 與布地奈德聯(lián)用可明顯逆轉(zhuǎn)該變化（P＜0.05），且LVFP 與布地奈德聯(lián)用效果更強(qiáng)（P＜0.05）。巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞變化與嗜酸性粒細(xì)胞相似（P＜0.05）。與OVA組相比，單獨(dú)給予布地奈德或LVFP 與布地奈德聯(lián)用可顯著減少炎癥細(xì)胞總數(shù)（P＜0.05），且LVFP 與布地奈德聯(lián)用抑制作用更為顯著（P＜0.05，圖4）。

圖4 LVFP 與布地奈德對(duì)哮喘幼鼠BALF 中炎癥因子數(shù)的影響Fig.4 Effects of LVFP and budesonide on immune cell counts in BALF of young mice with asthma

2.5 LVFP 可降低哮喘幼鼠BALF 中炎癥因子水平 與Control組相比，幼鼠經(jīng)OVA處理后，BALF中IL-4、IL-5、IL-13、IL-9、IL-10 和TGF-β 水平顯著升高（P＜0.05），單獨(dú)給予布地奈德或LVFP 與布地奈德聯(lián)用可顯著逆轉(zhuǎn)上述炎癥因子水平變化（P＜0.05），各組IFN-γ水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖5 LVFP與布地奈德對(duì)哮喘幼鼠BALF中炎癥因子水平的影響Fig.5 Effects of LVFP and budesonide on inflammatory factors levels in BALF of young mice with asthma

2.6 LVPF 增強(qiáng)哮喘幼鼠肺組織抗氧化能力 與Control 組相比，幼鼠經(jīng)OVA 處理后，肺組織中氧化相關(guān)蛋白Nitrotyrosine 及SOD2 表達(dá)明顯增加（P＜0.05），代表線粒體融合和分裂相關(guān)蛋白OPA1、Mfn2、DRP1 及Fis1 表達(dá)呈不同水平增高（P＜0.05），單獨(dú)給予布地奈德或LVFP 與布地奈德聯(lián)用可顯著抑制上述蛋白表達(dá)（P＜0.05，圖6）。

圖6 LVFP與布地奈德對(duì)哮喘幼鼠肺組織中氧化相關(guān)蛋白的影響Fig.6 Effects of LVFP and budesonide on oxidation related proteins in lung tissues of young mice with asthma

3 討論

目前哮喘主要治療藥物包括支氣管擴(kuò)張劑、糖皮質(zhì)激素、白三烯拮抗劑、單克隆抗體等，但生產(chǎn)成本較高，且控制哮喘癥狀效果不甚滿意［15-16］。此外，約5%～10%嚴(yán)重哮喘患者病情控制不佳，常規(guī)治療難以控制［17］。盡管醫(yī)藥行業(yè)發(fā)展迅速，但新的生物療法并未在哮喘治療中取得理想成果［18］。因此，研究提出可采用藥用植物作為治療哮喘替代或補(bǔ)充方法［19］。BLANC 等［20］研究表明，約24%哮喘患者已采用草藥作為輔助治療。兒童作為哮喘高危人群，為其尋找有效治療藥物引起廣泛關(guān)注。

LVFP 作為女貞子重要活性成分，目前已有研究報(bào)道其具有抗炎、抗氧化、抗癌和調(diào)節(jié)免疫等作用［21］。鄒慧等［22］發(fā)現(xiàn)LVFP 可通過(guò)促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖促進(jìn)小鼠非特異性免疫及細(xì)胞免疫；朱琪等［23］在四氯化碳誘導(dǎo)肝損傷小鼠模型中證實(shí)，LVFP 可通過(guò)調(diào)節(jié)肝臟丙二醛表達(dá)抑制脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)而有效緩解化學(xué)性肝損傷；佘亮亮等［24］研究證實(shí)LVFP在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠睪丸支持細(xì)胞炎癥損傷中具有保護(hù)作用，可抑制細(xì)胞凋亡，并在炎癥過(guò)程中調(diào)節(jié)該細(xì)胞分泌的IL-1β、IL-6和TGF-β 水平。鑒于目前尚無(wú)LVFP 在哮喘中的相關(guān)作用研究，因此本研究首先從女貞子中提取LVFP，并通過(guò)FTIR、HPIC及HPGFC 技術(shù)對(duì)LVFP 表征進(jìn)行鑒定，構(gòu)建OVA 致敏和激發(fā)的哮喘模型，研究LVFP 是否可作為布地奈德的輔助藥物發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及抗氧化作用。

目前研究認(rèn)為支氣管哮喘發(fā)病與細(xì)胞免疫功能紊亂密切相關(guān)。NK 細(xì)胞是一種重要的天然免疫細(xì)胞，近期研究表明與健康對(duì)照組相比，哮喘患者外周血中分離的NK 細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞株的殺傷能力降低，盡管其可分泌大量細(xì)胞毒調(diào)節(jié)因子［25］。研究證實(shí)，過(guò)敏性哮喘患者NK 細(xì)胞亞群明顯減少，提示哮喘發(fā)生與NK 功能抑制有關(guān)［26］。此外，Treg 在平衡炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。Treg可通過(guò)多種抑制機(jī)制負(fù)反饋調(diào)節(jié)T 細(xì)胞，如下調(diào)T 細(xì)胞因子表達(dá)，抑制T 細(xì)胞活化和分化等［27］。吸入無(wú)害的過(guò)敏原時(shí)，DCs 可被上皮細(xì)胞直接激活或間接激活，啟動(dòng)細(xì)胞免疫應(yīng)答。本研究證實(shí)LVFP與布地奈德聯(lián)用可調(diào)節(jié)DCs、NK 細(xì)胞和Treg 比例。與布地奈德單用相比，LVFP 與布地奈德聯(lián)用可顯著減少DCs，提示哮喘幼鼠免疫應(yīng)答得到緩解。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)LVFP+布地奈德聯(lián)用可顯著降低支氣管高反應(yīng)性（P＜0.05），并可顯著減少BALF 中總炎癥細(xì)胞數(shù)和嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)，提示LVFP 與布地奈德聯(lián)用不僅可改善哮喘癥狀，還可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞作用。

已知哮喘是一種過(guò)敏性炎癥性呼吸道疾病。慢性哮喘患者持續(xù)表現(xiàn)為慢性炎癥和氧化應(yīng)激［28］。肺上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞不斷被激活，可釋放多種炎癥細(xì)胞因子、炎癥遞質(zhì)和氧化分子，損傷細(xì)胞和組織從而損傷肺功能［29］。因此本研究除檢測(cè)炎癥細(xì)胞數(shù)及淋巴細(xì)胞比例外，還檢測(cè)了BALF 中炎癥因子表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)哮喘狀態(tài)下，幼鼠BALF 中IL-4、IL-5、IL-13、IL-9、IL-10 和TGF-β 水 平 顯 著 升 高，LVFP 與布地奈德聯(lián)用可顯著逆轉(zhuǎn)上述炎癥因子水平變化，發(fā)揮抗炎作用，而IFN-γ 水平未見(jiàn)明顯變化。提示LVFP 與布地奈德聯(lián)用不僅可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞數(shù)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，其還可通過(guò)抑制炎癥因子表達(dá)發(fā)揮抗炎作用。

氧化應(yīng)激方面，本研究選擇硝基酪氨酸作為氧化應(yīng)激指標(biāo)，硝基酪氨酸作為一種亞硝化蛋白產(chǎn)物，其含量可作為過(guò)氧亞硝酸鹽陰離子水平的標(biāo)志［30］。本研究表明，OVA 致敏和激發(fā)可誘導(dǎo)幼鼠體內(nèi)硝基酪氨酸表達(dá)，而LVFP 與布地奈德聯(lián)用則可逆轉(zhuǎn)此作用，表明幼鼠哮喘狀態(tài)下可發(fā)生氧化應(yīng)激，LVFP 與布地奈德聯(lián)用可發(fā)揮抑制作用。此外，作為一種有效的抗氧化劑，SOD2 在OVA 激發(fā)后也顯著增加，而LVFP 與布地奈德聯(lián)用可降低其水平，可能原因?yàn)橄龠M(jìn)SOD2 表達(dá)從而發(fā)揮抗氧化作用，而LVFP 與布地奈德聯(lián)用在幼鼠體內(nèi)與SOD2 發(fā)揮類似作用，為防止過(guò)度過(guò)氧化而SOD2 表達(dá)減少，形成氧化與抗氧化動(dòng)態(tài)平衡。

已有研究報(bào)道，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的線粒體功能障礙可促進(jìn)哮喘患者和動(dòng)物模型炎癥反應(yīng)和氣管重塑［31］。線粒體在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)歷動(dòng)態(tài)分裂/融合循環(huán)，該過(guò)程受線粒體生物標(biāo)志物（包括OPA1、Mfn1/2、DRP1 和Fis1）調(diào)控，維持分裂/融合循環(huán)精確性對(duì)線粒體功能至關(guān)重要［32］。本研究發(fā)現(xiàn)，OVA 激發(fā)可顯著增加融合/分裂蛋白標(biāo)志物OPA1、Mfn2、DRP1 及Fis1表達(dá)，而LVFP與布地奈德聯(lián)用可逆轉(zhuǎn)上述蛋白表達(dá)變化，提示抗氧化應(yīng)激作用中，LVFP 與布地奈德可通過(guò)保護(hù)線粒體功能發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，本研究通過(guò)從女貞子中提取LVFP，OVA 致敏和激發(fā)的哮喘幼鼠模型發(fā)現(xiàn)，LVFP 與布地奈德聯(lián)用通過(guò)改善氣道反應(yīng)性、調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞比例、抑制炎癥因子、氧化及線粒體融合/分裂相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)發(fā)揮保護(hù)作用。提示LVFP 與布地奈德聯(lián)用有望成為治療小兒哮喘、改善癥狀的有效方法。