瘦素對(duì)哮喘大鼠肺組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響①

苗菲菲 劉兆瑋 田 鵬 張 紅 張長(zhǎng)庚 （衡水市人民醫(yī)院，衡水 053000）

支氣管哮喘簡(jiǎn)稱哮喘，是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為特點(diǎn)的氣道慢性炎癥性呼吸系統(tǒng)疾病，具有較高的患病率和致死率［1-2］。近年來(lái)，隨著氣候改變、霧霾、空氣污染等環(huán)境因素的改變，哮喘發(fā)的生率和病死率呈上升趨勢(shì)，并越來(lái)越受到社會(huì)的關(guān)注［3-4］。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，機(jī)體氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，氧化應(yīng)激產(chǎn)物增加，可引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡和組織損傷，并造成氣道炎癥加重及氣道重塑改變，從而參與哮喘發(fā)生過(guò)程［5-6］，故氧化應(yīng)激反應(yīng)在哮喘中的作用也受到研究者的日益重視。瘦素可表達(dá)于支氣管上皮細(xì)胞、氣道平滑肌細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等組織細(xì)胞，是一種脂肪性細(xì)胞因子樣蛋白多肽，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答反應(yīng)［7-8］。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者體內(nèi)瘦素及其受體表達(dá)與哮喘病情進(jìn)展關(guān)系密切［9-10］，然而針對(duì)外源性地給予瘦素對(duì)哮喘癥狀影響的相關(guān)報(bào)道較少。本研究建立哮喘大鼠模型，外源性給予瘦素及瘦素拮抗劑，探究其對(duì)哮喘大鼠支氣管肺組織氧化應(yīng)激及細(xì)胞凋亡的影響，以期為闡明瘦素與哮喘病程的關(guān)系提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性SD 大鼠，體質(zhì)量200～220 g，6～7周育齡，購(gòu)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部［SCXK（京）2015-0006］，所有大鼠飼養(yǎng)于衡水市人民醫(yī)院動(dòng)物房，飼養(yǎng)條件：自然光照，自由飲食、飲水，溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，噪音低于80 分貝，保持動(dòng)物房環(huán)境及鼠籠清潔、透氣。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)衡水市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合3R原則。

1.1.2 主要試劑與儀器 瘦素（貨號(hào)：CYT-683，以色列ProSpec-Tany 公司）；IL-6 ELISA 試劑盒（批號(hào)LS-F37731，上?？道噬锟萍加邢薰荆?；TNF-α ELISA 試劑盒（批號(hào)：DM-M57136，上海篤瑪生物科技有限公司）；HE 染色試劑盒（貨號(hào)：LMO105，上海聯(lián)邁生物工程有限公司）；TUNEL 染色試劑盒（貨號(hào)：WLA029a，沈陽(yáng)萬(wàn)類生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（貨號(hào)：S311，上海研卉生物科技有限公司）；丙二醛（MDA）試劑盒（貨號(hào)：YX-C-A401，武漢益普生物科技有限公司）；Kelch樣環(huán)氧氯丙烷樣相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-like associated protein 1，Keap1）抗體、核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子（nuclear transcription factor E2 related factor，Nrf2）抗體、血紅素氧合酶（heme oxygenase，HMOX-1）抗體、B 細(xì)胞淋巴瘤-2 基因（Bcl-2）抗體（貨號(hào)分別為：ab119403、ab62352、ab223349、ab196495，美國(guó)Abcam 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、胰蛋白酶（貨號(hào)分別為P0768、P0231，美國(guó)Pierce 公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)：T1597，日本TaKaRa）；手動(dòng)輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)（型號(hào)：RM2125RTS，德國(guó)Leica 公司）；光學(xué)顯微鏡（型號(hào)：SMZ745，日本尼康公司）；蛋白電泳儀、半干轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：1659001、Trans-Blot SD，美國(guó)Bio-Rad 公司）；凝膠成像儀（型號(hào)：GIS-500，杭州Miulab公司）。

1.2 方法

1.2.1 大鼠哮喘模型建立及分組給藥 參照文獻(xiàn)［11］采用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）致敏并用霧化吸入法誘發(fā)大鼠支氣管哮喘模型，具體操作方法為：將大鼠置于氣霧裝置內(nèi)，用4%OVA 生理鹽水進(jìn)行恒壓噴霧引喘，觀察大鼠的哮喘潛伏期（即從噴霧開(kāi)始到哮喘發(fā)作的時(shí)間），一般不超過(guò)150 s，超過(guò)150 s 者認(rèn)為不敏感，不予選用，將預(yù)選合格的40 只大鼠隨機(jī)分為模型組、瘦素組（10μg/kg）、瘦素拮抗劑組（3 μg/kg）及陽(yáng)性對(duì)照組（布地奈德，1 mg/只），10 只/組。各組大鼠于兩側(cè)大腿外側(cè)肌內(nèi)注射4%OVA 生理鹽水0.2 ml，腹腔注射0.5 ml 4%OVA+4%氫氧化鋁凝膠0.5 ml 致敏，1 次/周，共進(jìn)行4 次致敏，若大鼠出現(xiàn)呼吸喘促、喘息、哮鳴音、甚則搔鼻、打噴嚏及鼻處有白色黏性分泌物表明造模成功，另取10只正常大鼠，于相同時(shí)間、相同方法給予等量生理鹽水作為正常對(duì)照組。各組大鼠均于造模成功后開(kāi)始給藥，瘦素組及瘦素拮抗劑組參照文獻(xiàn)［11-12］設(shè)置劑量并通過(guò)腹腔注射給予相應(yīng)劑量的瘦素及瘦素拮抗劑溶液，陽(yáng)性對(duì)照組參照文獻(xiàn)［13］設(shè)置劑量，并通過(guò)噴霧給予布地奈德0.5 ml，正常對(duì)照組和模型組腹腔注射生理鹽水0.2 ml，各組大鼠均于給藥后1 h 按預(yù)選條件噴霧4%OVA 生理鹽水激發(fā)哮喘，各組大鼠均給藥致敏4周，1次/2 d。

1.2.2 各組大鼠一般行為觀察及肺功能檢測(cè) 各組大鼠均于末次引喘后24 h 觀察大鼠的神態(tài)、活動(dòng)情況、呼吸狀況、皮毛狀態(tài)、口鼻等部位分泌物、咳嗽（或氣喘）等肺系疾病的特異性癥狀體征的變化。完成一般行為觀察后，用現(xiàn)配的4%戊巴比妥鈉溶液（1 ml/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉，置于固定板，進(jìn)行氣管插管，用動(dòng)物肺功能測(cè)定儀測(cè)定大鼠的吸氣阻力（Ri）、呼氣阻力（Re）、肺通氣順應(yīng)性（Cldyn）。

1.2.3 標(biāo)本采集 各組大鼠在肺功能檢測(cè)后，立即經(jīng)氣管注入4 ℃含酚紅（D-Hanks）的緩沖液5 ml，輕輕按摩胸部20～30 s 后，回收支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF），共3 次（回收率＞90%），將回收后的BALF 于4 ℃、2 500 r/min 下離心10 min，取上清液保存于-20 ℃冰箱。處死大鼠，取完整左右兩肺。剪取部分左肺用組織勻漿器勻漿、離心分離取上清液于-20 ℃冰箱中保存，剩余左肺及右肺組織迅速置于4%多聚甲醛中固定24 h。

1.2.4 大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量及肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD、MDA 含量檢測(cè) 取

1.2.3中-20 ℃冰箱保存的BALF上清液及肺組織勻漿液，于4 ℃冰箱解凍后，取BALF上清液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)IL-6、TNF-α 含量。取肺組織勻漿液，按試劑盒說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)肺組織中SOD、MDA含量。

1.2.5 大鼠肺組織HE 及TUNEL 染色觀察 取1.2.3 中4%多聚甲醛中固定24 h 的左右兩肺組織，進(jìn)行常規(guī)透明、浸蠟、包埋后，切成5μm 厚的切片，取左肺組織切片，根據(jù)HE 染色試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色、脫水、透明后封片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察組織病理變化。取右肺組織切片，進(jìn)行脫蠟、脫水、封閉后，添加TUNEL 工作液室溫下孵育1 h，隨后加入抗熒光猝滅劑封片，在共聚焦顯微鏡下觀察切片中細(xì)胞凋亡情況，采用Image-pro plus 軟件系統(tǒng)定量檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率（%）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 Western blot 法檢測(cè)肺組織中Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白相對(duì)表達(dá)水平 取1.2.5 中剩余肺組織，以組織勻漿器勻漿、離心后取上清液，試劑盒提取蛋白，BCA 蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白總濃度后，取50 μg 蛋白上樣，進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜反應(yīng)，TBST溶液清洗后，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉1 h，TBST 清洗3 次，加入一抗［Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2、β-actin（內(nèi)參）］，稀釋倍數(shù)分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶2 000），4 ℃搖床室溫孵育過(guò)夜，TBST 清洗后加入HRP 羊抗兔二抗（稀釋倍數(shù)1∶2 000），37 ℃搖床室溫孵育1 h，TBST 清洗3 次后，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色，以凝膠成像儀觀察條帶并拍照，并以Image J軟件分析各組蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS22.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩組間比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般行為檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠呼吸節(jié)律整齊、均勻，口唇顏色紅潤(rùn)，口、鼻等部位無(wú)異常分泌物出現(xiàn)。模型組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息、哮鳴音、搔鼻、打噴嚏現(xiàn)象，且大多數(shù)大鼠口、鼻處有白色黏性分泌物。瘦素組大鼠出現(xiàn)呼吸減慢和節(jié)律不齊、四肢癱軟、腹肌痙攣、行動(dòng)遲滯或俯伏不動(dòng)現(xiàn)象。瘦素拮抗劑組及陽(yáng)性藥物組大鼠呼吸漸復(fù)平穩(wěn)、節(jié)律漸復(fù)均勻，極個(gè)別大鼠口、鼻處有白色黏性分泌物出現(xiàn)，偶爾有搔鼻、打噴嚏現(xiàn)象。

2.2 各組大鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠Ri、Re升高（P＜0.05），Cldyn降低（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠Ri、Re 升高（P＜0.05），Cldyn 降低（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽(yáng)性藥物組大鼠Ri、Re 降低（P＜0.05），Cldyn升高（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽(yáng)性藥物組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠肺功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s，n=10）

表1 各組大鼠肺功能比較（±s，n=10）Tab.1 Comparison of lung function of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Cldyn/（ml·cm-1）0.23±0.04 0.12±0.031）0.04±0.021）2）0.17±0.031）2）3）0.18±0.041）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug Ri/（cm·s·ml-1）1.81±0.21 3.06±0.241）3.95±0.251）2）2.58±0.221）2）3）2.53±0.231）2）3）Re/（cm·s·ml-1）1.80±0.19 3.09±0.251）3.97±0.261）2）2.18±0.231）2）3）2.20±0.241）2）3）

2.3 各組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 及肺組織SOD、MDA 含量檢測(cè)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量增多（P＜0.05），肺組織中SOD 含量減少（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量增多（P＜0.05），肺組織中SOD 含量減少（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽(yáng)性藥物組大鼠BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α，肺組織中MDA 含量減少（P＜0.05），肺組織中SOD 含量增多（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽(yáng)性藥物組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α含量比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6 and TNF-α contents in BALF of rats in each group（±s，n=10）

表2 各組大鼠BALF中IL-6、TNF-α含量比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of IL-6 and TNF-α contents in BALF of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

MDA/（cmmol·ml-1）2.21±0.20 6.53±0.231）8.39±0.251）2）4.08±0.221）2）3）4.13±0.211）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug IL-6/（ng·ml-1）169.91±20.89 692.06±25.261）890.58±29.041）2）369.13±23.121）2）3）359.02±22.131）2）3）TNF-α/（ng·ml-1）106.99±15.48 546.24±20.191）840.18±23.081）2）325.33±18.241）2）3）306.63±18.301）2）3）SOD/（cU·ml-1）20.05±1.48 12.53±1.091）8.02±1.011）2）16.08±1.221）2）3）16.13±1.211）2）3）

2.4 各組大鼠肺組織HE 染色檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肺組織出現(xiàn)支氣管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理?yè)p傷；瘦素組大鼠支氣管壁炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理?yè)p傷程度明顯增高；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑及陽(yáng)性藥物組大鼠上述病理?yè)p傷減輕，見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠肺組織HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of rats in each group（×200）

2.5 各組大鼠肺組織TUNEL 染色及細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果 正常對(duì)照組大鼠肺組織染色均勻；與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞棕黃色顆粒物質(zhì)沉積增多，凋亡細(xì)胞比例升高（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞棕黃色顆粒物質(zhì)及凋亡細(xì)胞比例升高（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑及陽(yáng)性藥物組大鼠肺組織支氣管上皮細(xì)胞棕黃色顆粒物質(zhì)及凋亡細(xì)胞比例降低（P＜0.05），瘦素拮抗劑組與陽(yáng)性藥物組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)圖2、表3。

圖2 各組大鼠肺組織TUNEL染色（×400）Fig.2 TUNEL staining of lung tissue of rats in each group（×400）

表3 各組凋亡細(xì)胞比例比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of apoptotic cells in each group（±s，n=10）

表3 各組凋亡細(xì)胞比例比較（±s，n=10）Tab.3 Comparison of apoptotic cells in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Proportion of apoptotic cells/%10.62±0.22 42.09±0.251）60.03±0.261）2）22.39±0.231）2）3）21.25±0.241）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug

2.6 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達(dá)結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；與瘦素組相比，瘦素拮抗劑組及陽(yáng)性藥物組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋 白 表 達(dá) 升 高（P＜0.05）；瘦素拮抗劑組與陽(yáng)性藥物組相比，上述指標(biāo)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4、圖3。

圖3 各組大鼠肺組織中Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2 蛋白表達(dá)Fig.3 Expressions of Keap1，Nrf2，HMOX-1 and Bcl-2 protein in lung tissue of rats in each group

表4 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Keap1，Nrf2，HMOX-1，Bcl-2 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s，n=10）

表4 各組大鼠肺組織Keap1、Nrf2、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Keap1，Nrf2，HMOX-1，Bcl-2 protein expressions in lung tissue of rats in each group（±s，n=10）

Note：1）P＜0.05 vs normal control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs leptin group.

Bcl-2/β-actin 1.01±0.11 0.49±0.091）0.14±0.101）2）0.79±0.091）2）3）0.81±0.101）2）3）Groups Normal control Model Leptin Leptin antagonist Positive drug Keap1/β-actin 1.02±0.10 0.46±0.081）0.12±0.081）2）0.79±0.091）2）3）0.80±0.091）2）3）Nrf2/β-actin 1.06±0.11 0.48±0.091）0.14±0.081）2）0.78±0.101）2）3）0.79±0.091）2）3）HMOX-1/β-actin 1.09±0.10 0.46±0.091）0.15±0.091）2）0.80±0.101）2）3）0.81±0.091）2）3）

3 討論

哮喘病因復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，而理想的哮喘動(dòng)物模型對(duì)哮喘病因及發(fā)病機(jī)制的研究具有十分重要的意義［14］。OVA 來(lái)源于蛋清，價(jià)格便宜，具有很強(qiáng)的免疫源性，大鼠腹腔注射OVA 一段時(shí)間后，用OVA 霧化致敏，可誘發(fā)大鼠哮喘發(fā)作，此方法是目前國(guó)內(nèi)外常用的動(dòng)物哮喘造模方法［15］。本研究采用OVA 激發(fā)建立大鼠哮喘模型，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠出現(xiàn)呼吸急促、喘息、打噴嚏現(xiàn)象，且口、鼻處有白色黏性分泌物出現(xiàn)，BALF 中炎癥因子IL-6、TNF-α 含量增加，肺功能指標(biāo)Ri、Re增加，Cldyn降低，肺組織出現(xiàn)支氣管周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌、氣道平滑肌增厚、管腔變窄等病理現(xiàn)象，與文獻(xiàn)［16］研究動(dòng)物哮喘癥狀及病理?yè)p傷結(jié)果一致，提示模型組大鼠出現(xiàn)氣道炎癥、通氣受限及支氣管肺組織炎癥損傷，表明大鼠哮喘模型建造成功。

近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，瘦素與哮喘關(guān)系密切，機(jī)體瘦素水平與哮喘嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［9］。陳云峰等［17］發(fā)現(xiàn)外源性給予瘦素可抑制支氣管哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞β2 腎上腺素能受體（β2-AR）表達(dá)，促進(jìn)炎癥因子釋放，并推測(cè)這可能是瘦素參與哮喘肺功能下降進(jìn)程的原因。然而李桂茹等［12］發(fā)現(xiàn)外源性給予瘦素可降低機(jī)械通氣肺損傷中炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，降低肺損傷，與文獻(xiàn)［17］報(bào)道的瘦素促進(jìn)炎癥介質(zhì)、抑制氣道平滑肌細(xì)胞β2-AR 表達(dá)，加重哮喘患者肺功能損傷的結(jié)論相反。本研究給予哮喘大鼠瘦素及瘦素拮抗劑進(jìn)行觀察，從正反兩面驗(yàn)證瘦素與哮喘的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，瘦素組大鼠呼吸加快、四肢癱軟、腹肌痙攣現(xiàn)象加重，BALF 中IL-6、TNF-α 含量及肺功能指標(biāo)Ri、Re 進(jìn)一步增加，Cldyn 進(jìn)一步降低，肺組織支氣管壁炎癥浸潤(rùn)、杯狀細(xì)胞增生及黏液分泌等病變進(jìn)一步加重；瘦素拮抗劑和陽(yáng)性藥物組大鼠上述哮喘癥狀、血清學(xué)指標(biāo)、炎癥指標(biāo)、肺功能指標(biāo)及組織病理?yè)p傷與模型組相比均明顯減輕，表明外源性給予瘦素可加重哮喘癥狀和病理?yè)p傷，而瘦素拮抗劑可改善哮喘癥狀和病理?yè)p傷。然而瘦素加重哮喘進(jìn)程的具體分子生物學(xué)機(jī)制還不甚明確，本研究對(duì)此進(jìn)行繼續(xù)探究。

氧化應(yīng)激反應(yīng)在哮喘病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，KLENIEWSKA 等［18］發(fā)現(xiàn)機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激產(chǎn)物，如活性氧蓄積，可引起生物膜上參與電子轉(zhuǎn)運(yùn)的酶失活以及細(xì)胞溶解，從而產(chǎn)生組織損傷，并證明氧化應(yīng)激過(guò)度反應(yīng)是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。馬南等［19］發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激失衡參與了哮喘的發(fā)展，并推測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 水平可作為哮喘嚴(yán)重程度及控制水平的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠肺組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 含量升高，SOD 活性降低，肺組織凋亡細(xì)胞比例升高，提示哮喘模型大鼠機(jī)體內(nèi)存在氧化應(yīng)激反應(yīng)。Keap1-Nrf2通路與氧化應(yīng)激和凋亡等密切相關(guān)，NAZIMA 等［20］發(fā)現(xiàn)Nrf2 的表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)Nrf2 與Keap1 解離，進(jìn)而通過(guò)提高細(xì)胞抗氧化能力、消除過(guò)氧化產(chǎn)物堆積發(fā)揮抗氧化損傷作用；此外，Nrf2高表達(dá)通過(guò)促進(jìn)抗凋亡因子Bcl-2 表達(dá)發(fā)揮抗凋亡作用。鄭憐玉等［21］發(fā)現(xiàn)黃連素可上調(diào)Nrf2、Keap1 表達(dá)，并激活Nrf2 下游抗氧化蛋白酶HMOX-1 表達(dá)，提高肺組織的抗氧化能力，進(jìn)而降低肺組織氧化損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠Nrf2、Keap1、HMOX-1、Bcl2 蛋白表達(dá)降低，提示哮喘模型組大鼠肺Nrf2-Keap1 通路被抑制，機(jī)體抗氧化應(yīng)激能力減弱，肺組織損傷和細(xì)胞凋亡嚴(yán)重。而與模型組相比，瘦素組大鼠肺組織Nrf2、Keap1、HMOX-1、Bcl-2蛋白表達(dá)進(jìn)一步降低，而氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA 升高、SOD 降低，肺組織細(xì)胞凋亡比例進(jìn)一步增加，表明瘦素具有促進(jìn)哮喘癥狀和病理?yè)p傷進(jìn)程的作用，其可能與抑制Nrf2-Keap1 通路激活，降低機(jī)體抗氧化應(yīng)激反應(yīng)和組織細(xì)胞凋亡作用有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，瘦素拮抗劑組及陽(yáng)性藥物組大鼠Nrf2 通路蛋白表達(dá)、氧化應(yīng)激指標(biāo)、肺組織細(xì)胞凋亡比例均顯著低于模型組，提示瘦素拮抗劑可能通過(guò)激活Nrf2-Keap1 通路表達(dá)促進(jìn)機(jī)體抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，進(jìn)而改善哮喘癥狀和病理?yè)p傷。

綜上所述，瘦素可抑制Nrf2-Keap1通路激活，降低機(jī)體抗氧化應(yīng)激和抗凋亡作用，進(jìn)而加重哮喘進(jìn)程，可能為闡明瘦素參與哮喘病程的機(jī)制提供一定參考。但Nrf2 靶分子調(diào)控機(jī)制復(fù)雜，本研究未設(shè)置通路抑制劑進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，這有待后續(xù)深入研究。