miR-210 介導(dǎo)CH25H 免疫信號(hào)通路調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞增殖和凋亡新機(jī)制研究①

吳福順 宋 瑤 張 雪 金京春 （延邊大學(xué)附屬醫(yī)院免疫科，延邊 133000）

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是一種與年齡相關(guān)的退行性疾病，主要表現(xiàn)為軟骨組織遭到破壞、滑膜炎癥、骨贅形成等，同時(shí)伴有疼痛、短暫晨僵和骨擦音等臨床癥狀，嚴(yán)重影響患者生活和工作［1］。目前研究表明骨關(guān)節(jié)形成由多因素導(dǎo)致，microRNAs（miRNAs）在多種疾病中均發(fā)揮重要生理調(diào)控作用，其在OA 發(fā)生發(fā)展過程中既有上調(diào)表達(dá)又有下調(diào)表達(dá)，最新一項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)miRNA-138-5p可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖改善OA 炎癥環(huán)境［2］。OA 同時(shí)由免疫信號(hào)調(diào)節(jié)失衡造成大量炎癥因子分泌所導(dǎo)致［3］。miR-210已被證實(shí)有調(diào)控細(xì)胞增殖作用，但其是否通過調(diào)控免疫相關(guān)信號(hào)通路發(fā)揮抗炎促增殖作用鮮有報(bào)道。本研究旨在明確miR-210 對(duì)OA 軟骨細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)控的新機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 12 只10 周齡SD 雄性大鼠購(gòu)自延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；0.25%胰酶（03-052-1A/B）購(gòu)自Biological 公司；0.2%Ⅱ型膠原酶混合液（BJ-X0541）購(gòu)自邦景公司；胎牛血清（F8318）、DMEM（D6429）購(gòu)自Sigma公司；Weigert染液（JA1021）、番紅O染液（JA1987）購(gòu)自佳維斯公司；IL-6（ab233706）、MMP-3（ab285407）、CH25H（ab214295）、山 羊 抗 兔IgG（ab150077）、DAB（ab64238）購(gòu)自Abcam 公司；TRIzol（15596026）、氯仿（10296028）購(gòu)自Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 12 只SD 大鼠隨機(jī)分為sham 組和OA 組，每組6 只。所有大鼠均飼養(yǎng)于23 ℃、相對(duì)濕度55%、噪音85 分貝以下環(huán)境中，每12 h 通風(fēng)換氣1 次。每天加水2 次，每天更換1 次墊料，室內(nèi)光線陰暗。所有大鼠均按照延邊大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)要求規(guī)范飼養(yǎng)和操作。

1.2.2 Hulth 法構(gòu)建OA 大鼠模型 3%戊巴比妥（30 mg/kg）麻醉大鼠，后肢膝關(guān)節(jié)處采用Hulth 法造模［4］。具體步驟：OA組大鼠后肢兩側(cè)切開2 cm左右切口，剝離并切斷交叉韌帶和內(nèi)側(cè)副韌帶，剝離整個(gè)半月板，不損傷膝關(guān)節(jié)軟骨面，隨后縫合消毒。sham 組大鼠僅進(jìn)行皮膚切開術(shù)后立即縫合。術(shù)后均注射青霉素抗感染，連續(xù)注射3 d，分籠單獨(dú)飼養(yǎng)。

1.2.3 分離原代軟骨細(xì)胞 取大鼠后肢膝關(guān)節(jié)消毒，超凈臺(tái)內(nèi)剪碎膝關(guān)節(jié)軟骨，采用含0.25%胰酶和0.2%Ⅱ型膠原酶混合液玻璃皿內(nèi)消化4 h。無菌濾網(wǎng)過濾，4 ℃、1 000 r/min 離心5 min，采用含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.2.4 HE染色 取SD大鼠后肢關(guān)節(jié)脫鈣處理，石蠟包埋，切片，脫蠟，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸乙醇分化5 s；去離子水洗片、氨水處理后水洗，伊紅染色5 min，水洗，乙醇、二甲苯處理，烘干樹脂封片。

1.2.5 番紅O-固綠染色 取SD 大鼠后肢關(guān)節(jié)脫鈣處理，石蠟包埋，切片后脫蠟。Weigert 染液染色5 min，酸性乙醇分化液分化15 s，洗片后固綠染液染色5 min，洗片，番紅O染液染色2 min，洗片、乙醇脫水，二甲苯透明，樹脂封片。

1.2.6 免疫熒光 將軟骨細(xì)胞鋪至含0.1%膠原涂層的玻璃蓋玻片，待細(xì)胞密度達(dá)60%左右采用預(yù)冷的甲醇和丙酮混合液（1∶1）進(jìn)行固定，1%TritonX-100/PBS 中透化，洗片擦干后加入IL-6 和MMP-3（1∶1 000）抗體4 ℃孵育過夜。次日4%多聚甲醛固定4 h，含15%蔗糖的PBS孵育4 h，去離子水清洗玻片，激光共聚焦掃描分析切片。

1.2.7 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞按5 000個(gè)/孔接種至96孔板，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。sh-miR-210、NC-miR-210、mimics-miR-210 Lipofectamine3000 轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞成功后，分別在0 h、12 h、24 h、36 h 和48 h 時(shí)20μl/孔加入CCK-8反應(yīng)液37 ℃孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處吸光度。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù) 按照1.2.7轉(zhuǎn)染細(xì)胞。軟骨細(xì)胞接種至6 孔板，細(xì)胞密度生長(zhǎng)至60%左右收集細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC 避光孵育10 min，再加入10μl碘化丙啶染液避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀分析。

1.2.9 免疫組化 關(guān)節(jié)脫鈣處理，石蠟切片脫蠟至水，修復(fù)抗原，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加入CH25H一抗、二抗，DAB顯色，細(xì)胞核復(fù)染，脫水，切片掃描儀掃描分析。

1.2.10 RT-PCR 采用TRIzol和氯仿用提取RNA，RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄為性質(zhì)穩(wěn)定的cDNA，qRT-PCR儀檢測(cè)目的基因相對(duì)表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃退化10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸35 s。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Tab.1 PCR primer sequences

1.2.11 Western blot 調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml，細(xì)胞匯合度達(dá)70%時(shí)收集細(xì)胞，冰上裂解30 min，4 ℃、8 000 g 離心吸取上清，提取總蛋白，蛋白定量后計(jì)算，加入上樣緩沖液，100 ℃煮5 min，SDS-PACE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF 膜，脫脂牛奶封閉，加入IL-6、MMP-13 和CH25H 一抗孵育過夜，次日加入二抗孵育，PBS 清洗，ECL 發(fā)光儀發(fā)光拍照。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0軟件進(jìn)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-210 在OA 體內(nèi)外模型中表達(dá)下調(diào) HE染色結(jié)果顯示，與sham 組相比，OA 組大鼠軟骨細(xì)胞顯著肥大且排列無序（圖1A）；番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，OA 組大鼠軟骨組織出現(xiàn)明顯骨侵蝕（圖1A）。免疫熒光鑒定軟骨細(xì)胞標(biāo)志物Ⅱ型膠原表達(dá)，結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞胞漿和胞膜處分布Ⅱ型膠原（P＜0.05，圖1B）。RT-PCR 結(jié)果顯示，OA 組大鼠軟骨組織和IL-1β 的刺激軟骨細(xì)胞內(nèi)miR-210 表達(dá)均顯著降低（P＜0.05，圖1C、D）。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果均提示miR-210與OA密切相關(guān)。

圖1 大鼠軟骨組織染色及miR-210表達(dá)Fig.1 Staining of cartilage and miR-210 expression of rats

2.2 miR-210 促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖 sh-miR-210、NC-miR-210 和mimics-miR-210 分別轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞，RT-PCR 結(jié)果顯示，sh-miR-210 顯著降低軟骨細(xì)胞miR-210 表達(dá)，mimics-miR-210 顯著增加軟骨細(xì)胞miR-210 表達(dá)（P＜0.05，圖2A）；CCK-8 結(jié)果顯示，軟骨細(xì)胞增殖能力隨著miR-210 表達(dá)沉默而降低，隨著miR-210 過表達(dá)而增強(qiáng)（P＜0.05，圖2B）；細(xì)胞凋亡趨勢(shì)則與之相反（P＜0.05，圖2C）。

圖2 miR-210對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of miR-210 on proliferation of chondrosto?cytes of rats

2.3 miR-210 抑制免疫細(xì)胞因子IL-6 和MMP-13 表達(dá) 免疫熒光結(jié)果顯示，IL-6 和MMP-13 在IL-1β 刺激的軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)均顯著增加，mimics-miR-210轉(zhuǎn)染后可抑制軟骨細(xì)胞IL-6 和MMP-13 表達(dá)，sh-miR-210 顯著增加IL-6 和MMP-13 表達(dá)（P＜0.05，圖3A、B）；RT-PCR 和Western blot 結(jié)果提示IL-6 和MMP-13 在OA 模型組軟骨組織中顯著增高（P＜0.05，圖3C、D）。提示miR-210 通過抑制細(xì)胞因子IL-6和MMP-13表達(dá)對(duì)OA軟骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

圖3 miR-210對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞IL-6和MMP-13表達(dá)的影響Fig.3 Effects of miR-210 on IL-6 and MMP-13 expressions in chondrocyte of rats

2.4 miR-210 抑制軟骨細(xì)胞CH25H 表達(dá) CH25H可導(dǎo)致代謝紊亂參與OA 發(fā)生，Western blot 證實(shí)CH25H 在IL-1β 刺激的軟骨細(xì)胞內(nèi)表達(dá)顯著增高（P＜0.05，圖4A）；Western blot（圖4A、B）和RT-PCR（圖4C）結(jié)果顯示，CH25H 表達(dá)隨著miR-210 沉默而增加，隨著miR-210 過表達(dá)而降低（P＜0.05）。提示CH25H在OA發(fā)生過程中受miR-210調(diào)控。

圖4 miR-210對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞CH25H蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of miR-210 on CH25H protein expression in chondrocyte of rats

2.5 CH25H 部分抵消miR-210 對(duì)軟骨細(xì)胞的促增殖作用 為探索CH25H作用于miR-210的位置，采用IL-1β 刺激軟骨細(xì)胞，隨后共同轉(zhuǎn)染mimics-miR-210和CH25H 過表達(dá)質(zhì)粒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-210 對(duì)軟骨細(xì)胞的促增殖作用被部分抵消（P＜0.05，圖5A）；共同轉(zhuǎn)染sh-miR-210和shRNA-CH25H質(zhì)粒后，sh-miR-210抑制細(xì)胞增殖的作用可被shRNA-CH25H 部分恢復(fù)（P＜0.05，圖5B）。

圖5 CH25H 可部分抵消miR-210 對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞增殖能力的影響Fig.5 CH25H partially counteracts effect of miR-210 on proliferation capacity of chondrocytes of rats

3 討論

軟骨細(xì)胞是軟骨組織中維持關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)的重要因素，研究證實(shí)軟骨細(xì)胞大量凋亡和免疫因子異常表達(dá)是OA 發(fā)生的重要因素［5］。OA 是老年人常見的一類骨科疾病，同時(shí)好發(fā)于運(yùn)動(dòng)員等運(yùn)動(dòng)量大導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷的人群［6］。研究報(bào)道m(xù)RNA 在多種細(xì)胞調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，同時(shí)參與OA 發(fā)生發(fā)展，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確［7］。mRNA 通過調(diào)控細(xì)胞增殖分化和凋亡等作用參與多種疾病發(fā)生發(fā)展，是治療多種疾病的熱門候選靶點(diǎn)［8］。大量研究證實(shí)，多種mRNA參與OA發(fā)生過程，如miR-31-5p在OA 患者外周血中表達(dá)顯著增高，體外實(shí)驗(yàn)表明miR-31-5p 對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和分化起負(fù)調(diào)控作用，說明miR-31-5p 可促進(jìn)OA 發(fā)生［9］。此外，miR-495通過抑制PI3K/AKT 信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和老化而發(fā)揮促OA 發(fā)生作用，同時(shí)miR-27a 在OA 中的表達(dá)與上述mRNA 相反，呈下降趨勢(shì)，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)增加miR-27a 表達(dá)可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，抑制其凋亡［10-12］。提示mRNA 在OA 發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-210 在OA 大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織和IL-1β 誘導(dǎo)的體外軟骨細(xì)胞中表達(dá)均顯著降低。miR-210 已被證實(shí)對(duì)多種細(xì)胞起促增殖作用，但其對(duì)軟骨細(xì)胞增殖的影響如何尚不清楚。本研究通過增殖活力實(shí)驗(yàn)和流式檢測(cè)觀察轉(zhuǎn)染sh-miR-210、mimics-miR-210 對(duì)軟骨細(xì)胞增殖和凋亡能力的影響，發(fā)現(xiàn)軟骨細(xì)胞增殖能力隨著miR-210 表達(dá)沉默而降低，隨著miR-210過表達(dá)而增強(qiáng)。IL-6和MMP-13是促進(jìn)OA 發(fā)生的免疫細(xì)胞因子，在OA 中大量分泌和表達(dá)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-210 能夠顯著降低OA標(biāo)志細(xì)胞因子IL-6和MMP-13表達(dá)，證實(shí)miR-210參與OA 發(fā)生并發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用，但并未明確其具體作用方式。進(jìn)一步查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，CH25H 是參與OA 發(fā)生的經(jīng)典免疫因子，可通過影響CH25HCYP7B1-RORα信號(hào)軸調(diào)控OA代謝，誘發(fā)OA［14］。

CH25H 是一類重要免疫調(diào)控因子，在多種疾病中異常表達(dá)可導(dǎo)致患者機(jī)體代謝紊亂，為疾病發(fā)生提供有利條件［15］。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎中，CH25H 促進(jìn)重要免疫因子IL-1β/TNF-α/IL-6 表達(dá)，導(dǎo)致患者代謝紊亂，促進(jìn)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展［16］。免疫因素對(duì)OA 同樣重要。本研究顯示，miR-210 顯著抑制CH25H在體外軟骨細(xì)胞中表達(dá)，同時(shí)過表達(dá)CH25H可部分抵消miR-210 對(duì)軟骨細(xì)胞的促增殖作用，說明二者相互作用，但具體機(jī)制尚不清楚，將是下一步研究重點(diǎn)。

綜上所述，本研究明確miR-210在OA 體內(nèi)模型中表達(dá)顯著下調(diào)，可能通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖對(duì)OA 發(fā)生起促進(jìn)作用，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)miR-210 可能通過抑制免疫因子CH25H 發(fā)揮促軟骨細(xì)胞增殖作用。以上結(jié)果初步探討了miR-210 在OA 發(fā)生中起重要作用，為下一步研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為OA 發(fā)病機(jī)制提供了新的理論依據(jù)。