趨化因子CXCL16對膿毒癥小鼠生存率、組織損傷及炎癥反應的影響①

李佳熹 曹 炬 （重慶醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院，重慶 400016）

膿毒癥是一種由宿主對感染的反應失調(diào)引起的危及生命的器官功能障礙，也是患者進入ICU 常見的重要原因，具有較高的發(fā)病率和病死率［1-4］。膿毒癥發(fā)病機制與全身炎癥網(wǎng)絡效應、基因的多態(tài)性、免疫功能障礙、器官組織損傷以及宿主對不同感染病原微生物的異常反應等多因素相關，與機體多系統(tǒng)、多器官病理生理改變密切相關，目前還沒有有效的治療方法來提高患者的生存率［5-6］。因此，探究CXCL16 在膿毒癥中的病理過程及其作用，對膿毒癥的治療及預后有著重要的意義。血清CXC趨化因子配體16（CXC chemokine ligand 16，CXCL16）是趨化因子家族中的一員，是以膜蛋白結合形式及可溶性蛋白形式兩種方式存在的跨膜蛋白，具有清道夫受體和促進炎癥細胞浸潤的作用［7］。有研究表明CXCL16 可誘導急性胰腺炎小鼠的腺泡細胞壞死，并且近年來CXCL16 作為壞死性胰腺炎的檢測指標［8-9］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)CXCL16 可發(fā)揮其炎癥因子功能參與心衰的發(fā)生發(fā)展，并且高水平表達的CXCL16與心衰的嚴重程度密切相關［10-11］。但CXCL16在膿毒癥中的表達水平及病理過程中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在通過探究CXCL16 在小鼠膿毒癥中的表達水平與免疫病理過程中的作用，為膿毒癥的診斷、治療及預后提供新的理論依據(jù)及應用價值。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物選取SPF 級C57BL/6 小鼠，雄性，8～10 周齡，體質(zhì)量22～24 g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供；CXCL16、IL-6、TNF-α 和IFN-γ 的ELISA試劑盒購自R＆D systems；CXCL16重組蛋白及Anti-CXCL16蛋白購自R＆D systems 公司；TRIzol試劑盒購自TaKaRa 公司；Fc 封閉抗體、細胞染色buffer、Ly6G 單克隆抗體、F4/80 單克隆抗體、CD11b單克隆抗體購自美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立 在C57BL/6 小鼠腹腔內(nèi)注射甲苯噻嗪（4.5 mg/kg）和氯胺酮（90 mg/kg）進行麻醉。麻醉后固定其四肢及口舌，進行腹腔盲腸穿刺結扎術（CLP），引起腹腔感染，引發(fā)小鼠膿毒癥［12］。沿小鼠腹部中間位置切開2.5 cm，暴露盲腸，在近盲腸底部1/2 處用3/0 型號手術縫合線結扎，使用22 號針穿刺盲腸，擠出少量糞便，保證盲腸與腹腔相通，隨即將盲腸放回腹腔，確認無糞便與切口接觸，逐層縫合切口，消毒，建立CLP 模型。皮下注射生理鹽水（5 ml/100 g）進行復蘇。

1.2.2 實驗分組及處理 將C57BL/6 小鼠隨機分為Sham 組、Control 組、CLP 組、Sham+CXCL16 組、Sham+PBS 組、CLP+CXCL16 組、CLP+PBS 組、CLP+Anti-CXCL16 組 和CLP+IgG 組，每 組20 只；CLP+CXCL16 組和CLP+PBS 組在完成CLP 后立即向小鼠腹腔內(nèi)分別注射CXCL16 重組蛋白0.5 μg 和等量PBS；CLP+Anti-CXCL16組和CLP+IgG 組在完成CLP后立即向小鼠腹腔內(nèi)分別注射CXCL16 抗體蛋白10 μg 和 等 量IgG 蛋 白；Sham 組 不 做 任 何 操 作；Control 組僅打開小鼠腹腔且不做CLP 處理；CLP 組按照手術步驟進行CLP手術。

1.2.3 生存率實驗 觀察CLP模型小鼠經(jīng)CXCL16重組蛋白、Anti-CXCL16 抗體蛋白和PBS 處理后的生存率。小鼠生存率實驗完成于重慶醫(yī)科大學動物實驗中心，保證各組小鼠生存環(huán)境溫度（20～26 ℃）、濕度（40%～70%）、光照及喂養(yǎng)條件相同，連續(xù)觀察14 d，每天觀察2次，記錄小鼠生存情況。

1.2.4 ELISA 檢測小鼠體內(nèi)CXCL16、IL-6、TNF-α和IFN-γ 表達量 血清樣本取自血液離心后上清液，腹腔灌洗液樣本取自5 ml PBS 反復沖洗3 次小鼠腹腔后的灌洗液，組織蛋白取自按照TRIzol 說明書提取的小鼠肝、肺、腎組織勻漿蛋白。ELISA 反應孔中加入0.1 ml 的樣品，室溫孵育2 h，洗滌后加入0.1 ml 酶標抗體，室溫孵育2 h。隨后，加底物液顯色，孵育30 min后，加入終止液，測定吸光值。

1.2.5 檢測小鼠血清生化指標 收集小鼠血清樣本，檢測肝臟功能生化指標谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transami?nase，AST）；腎功能指標尿素（Urea）、肌酐（Creati?nine）。血清樣本于采集后7 d 內(nèi)檢測，保證無溶血現(xiàn)象，按照儀器操作要求進行檢測。

1.2.6 炎癥細胞檢測及流式細胞術分選炎癥細胞 收集小鼠腹腔灌洗液5 ml，1 500 r/min 離心5 min，PBS洗2次后重懸，臺盼藍排斥試驗測定細胞存活率，用血液分析儀計數(shù)細胞數(shù)量。取500μl 腹腔灌洗液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml 染色Buffer 重懸；1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入紅細胞裂解液300 μl，避光靜置3 min，加入等量PBS停止裂解，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，1 ml 染色Buffer 洗2 次后，加入1 ml 染色Buffer 重懸；重懸液分組，每組分別加入1 μl Fc 封閉抗體，依次加入CD11b 單克隆抗體、F4/80 單克隆抗體、Ly6G 單克隆抗體及同型對照后上機檢測。

1.2.7 HE 染色觀察組織的損傷情況和病理評分收取肝、肺、腎臟組織約200 g，4%甲醛固定，石蠟包埋，4μm 切片后用蘇木精和伊紅染色（HE），并由病理醫(yī)師使用BH2 Olympus 顯微鏡（Olympus）隨機分組分析。根據(jù)下列參數(shù)對肺進行評分：支氣管炎、水腫、間質(zhì)炎癥、肺泡內(nèi)炎癥，以及肺表面匯合性炎癥浸潤的百分比，每個參數(shù)的等級從0（陰性）到4（嚴重）；根據(jù)下列參數(shù)對肝臟、腎臟進行評分：血栓數(shù)量、膿腫數(shù)量、炎癥程度、壞死程度，每個參數(shù)的等級從0（陰性）到3（嚴重）。肺、肝臟、腎臟病理評分總和表示為所有參數(shù)的評分之和。

1.3 統(tǒng)計學處理 分析采用GraphPad Prism 5.01版本完成（GraphPad Software，San Diego，CA）。組間比較采用Mann WhitneyU檢驗，生存研究采用Kaplan Meier分析和Log-Rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。實驗均重復3次。

2 結果

2.1 CXCL16 在小鼠膿毒癥中的表達情況 由圖1可知，Control 組和Sham 組小鼠中血清CXCL16 濃度表達正常且無顯著性差異，CLP 組小鼠血清中CXCL16 的表達水平顯著升高，提示CLP 模型構建成功；與Control 組比較，腹腔灌洗液和肺、腎組織勻漿蛋白中，CLP 組的CXCL16 表達水平顯著升高。差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 膿毒癥小鼠中CXCL16的表達水平Fig.1 Expressions of CXCL16 in spesis mice

2.2 CXCL16 對小鼠生存率的影響 由圖2 可知，PBS、CXCL16重組蛋白對Control組小鼠生存情況無影 響（P＜0.05）；與CLP+PBS 組 相 比，經(jīng)0.5 μg CXCL16 重組蛋白處理后的小鼠生存率顯著降低，追加CXCL16 重組蛋白劑量至1.0 μg 時，小鼠生存率進一步降低。為保證標本采集順利，在后續(xù)實驗中CLP+CXCL16 組 均 采 用0.5 μg CXCL16 蛋 白 處理，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖2 CXCL16重組蛋白注射后膿毒癥小鼠的Kaplan-Meier曲線Fig.2 Kaplan-Meier curves of spesis mice after CXCL16 recombinant protein injection

2.3 CXCL16 對膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥細胞的影響由圖3可知，與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16組腹腔灌洗液中的白細胞數(shù)量明顯增加，并且24 h 白細胞數(shù)量高于6 h，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。提示CXCL16 持續(xù)促進炎癥細胞產(chǎn)生，主要由中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞組成。

圖3 CXCL16對膿毒癥小鼠體內(nèi)炎癥細胞的影響Fig.3 Effects of CXCL16 on inflammatory cells in sepsis mice

2.4 CXCL16 對膿毒癥小鼠體內(nèi)相關炎癥因子的影響 由圖4 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組小鼠血清IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ、IL-10 濃度升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）；與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16 組小鼠血清和腹腔灌洗液中IL-6、IL-8、TNF-α、IFN-γ 表達水平顯著升高，IL-10 表達水平降低，提示CXCL16 進一步促進炎癥因子產(chǎn)生，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05，P＜0.01）。

圖4 CXCL16對膿毒癥小鼠血清中炎癥因子的影響Fig.4 Effects of CXCL16 on inflammatory cytokines in serum of sepsis mice

2.5 CXCL16 對膿毒癥小鼠肝肺腎組織損傷的影響 由圖5 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組肝、肺、腎臟組織損傷加重，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）；與CLP+PBS 組比較，CLP+CXCL16 組肝、肺、腎臟組織損傷明顯加重，充血程度及炎癥浸潤程度顯著增加，正常組織輪廓減少，病理評分更高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01，P＜0.001）。

圖5 膿毒癥小鼠肝、肺、腎組織病理形態(tài)HE 及病理評分（×100）Fig.5 Pathological morphology of liver，lung and kidney in septic mice HE and pathological scores（×100）

2.6 CXCL16 對血清標記物的影響 由圖6 可知，與Control 組相比，CLP+PBS 組血清肝腎功能指標ALT，AST，Creatinine 和Urea 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與CLP+PBS 組相比，CLP+CXCL16 組血清標志物ALT、AST、Creatinine 和Urea含量顯著升高（P＜0.001），并且24 h 表達水平高于6 h，提示肝腎功能降低，損傷加重。

圖6 CXCL16對肝腎功能血清標記物的影響Fig.6 Effects of CXCL16 on serum markers of liver and kidney function

2.7 Anti-CXCL16 抗體蛋白對膿毒癥小鼠的治療效果 由圖7 可知，與CLP+IgG 組相比，CLP+Anti-CXCL16 組生存率明顯升高，存活時間更長，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；組織損傷明顯減輕，充血及炎癥浸潤程度降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；血清標志物ALT、LDH、Urea 表達水平降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖7 Anti-CXCL16 抗體蛋白對膿毒癥小鼠的影響Fig.7 Effects of anti-CXCL16 on sepsis mice

3 討論

膿毒癥是大多重癥監(jiān)護病房患者病死的重要原因。膿毒癥嚴重程度可分膿毒癥、嚴重膿毒癥和膿毒癥休克，常見并發(fā)癥包括休克、急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、全身炎癥反應綜合征和多器官功能不全等。超過70%的膿毒癥患者的死亡發(fā)生在膿毒癥發(fā)病后的3 d，也有多數(shù)死亡發(fā)生在膿毒癥發(fā)病后的幾周，為了降低患者的病死率，膿毒癥早期的臨床檢測指標尤為重要［13-14］。因此研究CX?CL16在膿毒癥中的表達水平及病理過程中的作用，鑒定有效可靠的膿毒癥早期標志物及免疫治療新靶點具有重要意義。

趨化因子具有控制免疫細胞的遷移模式和定位能力，對免疫細胞發(fā)育和穩(wěn)態(tài)所需的細胞遷移、原發(fā)性細胞和體液免疫反應的產(chǎn)生、病理過程中免疫細胞的招募至關重要［15］。CXCL16 作為趨化因子家族中的一員，早期發(fā)現(xiàn)于免疫細胞中，是急性炎癥的重要遞質(zhì)［16-17］。本研究證實，CXCL16 在膿毒癥小鼠中表達水平顯著上調(diào)：全身循環(huán)（血清）和感染局部（腹腔灌洗液和肝、肺、腎組織蛋白），通過促進炎癥反應加重小鼠組織損傷乃至加速死亡。既往研究表明，CXCL16 在腎組織損傷的發(fā)病機制中起著重要作用，CXCL16 可通過CXCL16/ROCK1 信號通路加重缺血-再灌注所致的急性腎損傷［18］。本研究結果顯示，在CXCL16 重組蛋白處理后，膿毒癥小鼠肝、肺、腎組織損傷加重，充血及炎癥浸潤程度增高，與之相應的肝腎功能的血清標記物表達量升高。更有相關研究表明，TNF-α 和INF-γ 能夠刺激CXCL16 的分泌，INF-γ 具有增強誘導CXCL16 的產(chǎn)生的能力［19］。本次研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)CXCL16 重組蛋白處理后的小鼠腹腔灌洗中，白細胞數(shù)目大量增多，其中中性粒細胞、巨噬細胞和淋巴細胞顯著增多，中性粒細胞和巨噬細胞可以通過分泌炎癥因子等途徑促進加重小鼠炎癥反應。

多個對膿毒癥治療的臨床藥物試驗失敗的一部分原因是患者對膿毒癥的反應具有異質(zhì)性，目前除了支持性護理和對癥治療，還沒有能夠治療人類敗血癥的特定藥物［20］。因此，對膿毒癥治療的研究方向?qū)⒅匦玛P注于潛在的先天和適應性免疫紊亂，以促進膿毒癥的恢復和生存［21-22］。早期有相關研究表明，在結腸炎實驗模型中，給予抗CXCL16 抗體可改善結腸炎癥反應［23］。與本次實驗相符的是，經(jīng)過Anti-CXCL16 抗體蛋白治療后，膿毒癥小鼠生存時間延長，病死率降低，病理結果顯示肝、肺、腎組織損傷減輕，肝腎功能標記物降低。有研究表明，目前對膿毒癥的治療研究主要集中在免疫調(diào)節(jié)治療上，主要為逆轉(zhuǎn)持續(xù)的免疫細胞功能障礙，這種免疫細胞功能障礙在急性膿毒癥與病死率密切相關［24］。

綜上所述，本文通過CLP 誘導小鼠模擬膿毒癥形成，結果顯示CXCL16 在膿毒癥小鼠的血清、腹腔灌洗液及肝、肺、腎組織蛋白中顯著高表達，小鼠生存率降低，加重了肝、肺、腎臟組織損傷，其作用機制可能為CXCL16 促進小鼠體內(nèi)炎癥細胞的產(chǎn)生和增加相關炎癥因子的表達水平。同時Anti-CXCL16抗體蛋白具有一定的保護作用，降低病死率及組織損傷，為膿毒癥免疫治療提供新思路。本研究在動物實驗的基礎上可開展臨床實驗，對人類膿毒癥中CXCL16 的表達、相關影響和作用機制做進一步研究。