Apelin/APJ 在人支氣管上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及地膽頭對(duì)其影響的研究①

賈盼紅 熊曉嫚 李 琪 周向東③ 唐歡歡 王 杰

（海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，?？?570102）

細(xì)菌內(nèi)毒素脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）能夠誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞產(chǎn)生大量炎癥因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的分泌，形成“炎癥瀑布”，進(jìn)而損傷機(jī)體［1-2］。目前針對(duì)“炎癥瀑布”的治療，除了使用皮質(zhì)醇激素外，中醫(yī)藥對(duì)抑制炎癥瀑布效應(yīng)也具有獨(dú)特的效果。本課題組前期發(fā)現(xiàn)苦味類(lèi)中藥可抑制炎癥因子釋放［3］，地膽頭（Ele?phantopus scaber Linn）是長(zhǎng)江以南常用的民間中藥，味苦，具有清熱解毒、利尿消腫、抑菌等功效［4］。在本課題組前期實(shí)驗(yàn)及臨床觀(guān)察中已證實(shí)地膽頭能夠有效抑制社區(qū)獲得性肺炎（community-acquired pneumonia，CAP）的炎癥因子釋放，有效改善CAP 癥狀，縮短治療時(shí)間［5］。

Apelin 是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一種肽類(lèi)激素，是G 蛋白偶聯(lián)受體APJ（apelin receptor）的內(nèi)源性配體［6-7］。Apelin 通過(guò)減少線(xiàn)粒體ROS 觸發(fā)的氧化損傷、線(xiàn)粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及由NF-κB 和NLRP3 炎癥小體激活所誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)來(lái)預(yù)防LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）［8］。因此，Apelin 對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI/急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）有保護(hù)作用。然而，迄今為止，Apelin/APJ 在人體肺組織及支氣管上皮細(xì)胞中的表達(dá)定位以及調(diào)控尚未得到研究。此外，地膽頭對(duì)Apelin/APJ 的作用，以及地膽頭發(fā)揮抗炎作用是否與Apelin/APJ 相關(guān)，目前也無(wú)相關(guān)研究。因此，本研究采用人支氣管上皮細(xì)胞急性細(xì)胞肺損傷模型，觀(guān)察Apelin/APJ定位表達(dá)，探討外源性Apelin-13治療對(duì)支氣管上皮細(xì)胞炎癥因子的影響。另外，本研究用地膽頭干預(yù)LPS 致急性肺損傷細(xì)胞模型，探討地膽頭對(duì)急性肺損傷治療作用以及對(duì)Apelin/APJ的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人支氣管上皮細(xì)胞16HBE 購(gòu)自上海弘順生物科技有限公司。

1.1.2 主要試劑 DMEM 高糖培養(yǎng)基（武漢普諾賽公司）；胎牛血清（上海YEASEN）；RIPA 裂解液、TEMED、Western 封閉液、PVDF 膜（0.22μm）、PVDF浸潤(rùn)活化泡液、ECL免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK8試劑盒、脂多糖LPS（biosharp 公 司）；Human IL-1β Quantikine ELISA Kit、Human IL-6 Quantikine ELISA Kit、Human TNF-α Quantikine ELISA Kit（上海酶聯(lián)）；Apelin、APJ 一抗、Anti-GAPDH 抗體、HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠抗體（美國(guó)Abcam 公司）；SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit、ALL-in-oneTMqPCR Primer（中國(guó)易錦生物有限公司）。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 恒溫水浴箱（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；酶標(biāo)儀（SynergyHTX 公司，美國(guó)）；全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（中國(guó)天能公司）；Mx3OO5P 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（Stratagene 公司，美國(guó)）；10 cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿、6 孔板、12 孔板、96 孔板、200 μl PCR 管、無(wú)RNA 酶的吸頭（Axygen 公司，美國(guó)）；共聚焦激光顯微鏡（FV1000）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、傳代、凍存及復(fù)蘇 16HBE 細(xì)胞用DMEM 高糖培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，置于5%CO2和37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h 后換液，細(xì)胞融合至70%～80%時(shí)，終止消化，按1∶3的比例接種到培養(yǎng)皿中進(jìn)行傳代培養(yǎng)或接種到孔板中提取16HBE 細(xì)胞培養(yǎng)上清液、總蛋白及RNA繼續(xù)后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 地膽頭提取液制備 地膽頭采集于海南省儋州市那大鎮(zhèn)城郊，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心易國(guó)輝研究員鑒定為菊科類(lèi)地膽頭草，取地膽頭粉480 g，用95%乙醇熱回流旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)共得22 g 浸膏，提取率4.5%。取地膽頭浸膏10 mg，使用DMSO 50μl溶解，超聲振蕩1 h，使浸膏完全溶解，用9.5 ml完全培養(yǎng)基配制地膽頭母液濃度為1 mg/ml。再分別配制20、40、80μg/ml地膽頭液。

1.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及給藥 實(shí)驗(yàn)分6 組（n=8）：正常對(duì)照組（陰性對(duì)照組），模型組（LPS組，10μg/ml），陽(yáng)性對(duì)照組（LPS+Apelin-13 組，1 μmol/L），低、中、高地膽頭組［LPS+ESE（20μg/ml）組、LPS+ESE（40μg/ml）組、LPS+ESE（80μg/ml）組］。

1.2.4 CCK8 測(cè)細(xì)胞活力 將細(xì)胞按照5×104個(gè)/孔（100 μl）接種于96 孔板，設(shè)6 組，培養(yǎng)24 h 后將20、40、80μg/ml地膽頭提取液及Apelin-13（1μmol/L）各20μl 分別加入對(duì)應(yīng)組，設(shè)4 個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)箱孵育3 h，將20 μl 10 μg/ml LPS 分別加入LPS 組、20、40、80μg/ml 地膽頭組及Apelin-13 組，再次放入培養(yǎng)箱孵育16 h，每組每孔各加CCK8 10 μl，2 h 后酶標(biāo)儀下測(cè)吸光度，設(shè)置450 nm，重復(fù)3次。按以下公式計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組OD 值/空白組OD值×100%。

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光、激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)Apelin/APJ 蛋白表達(dá)定位情況 細(xì)胞分組同

1.2.3 培養(yǎng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min。吸干殘留液，滴加山羊血清工作液在室溫孵育1 h。棄血清，再加入兔抗多克隆抗體（1∶100）過(guò)夜。第2 天取出用PBS 清洗，加入FITC山羊抗兔二抗。避光37 ℃孵育1 h。各組均加入DAPI。用抗熒光減滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡下采集分析圖像。

1.2.6 ELISA 檢測(cè)細(xì)胞上清液IL-1β、IL-6、TNF-α的含量 細(xì)胞分組同1.2.3，將20、40、80 μg/ml 地膽頭提取液及Apelin-13（1 μmol/L）各20μl 加入對(duì)應(yīng)組，培養(yǎng)箱孵育3 h，將10μg/ml 20μl LPS 分別加入LPS 組、20、40、80 μg/ml 地膽頭組及Apelin-13組，再次放入培養(yǎng)箱孵育16 h。嚴(yán)格按照其說(shuō)明書(shū)操作，450 nm波長(zhǎng)處測(cè)OD值。

1.2.7 Western blot 法檢測(cè)Apelin、APJ 蛋白表達(dá)細(xì)胞分組及藥物干預(yù)分別同1.2.3和1.2.6。每孔加RIPA 裂解液，細(xì)胞刮刮取細(xì)胞。4 ℃12 000 r/min離心。取上清液。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。煮沸法使蛋白質(zhì)變性。配制SDS-PAGE 凝膠。經(jīng)SDS-PAGE 電泳分離，切膠、轉(zhuǎn)膜，室溫下在搖床上脫脂奶粉封閉液封閉2 h，PBST 洗滌，4 ℃孵育一抗12 h，二抗液室溫孵育2 h。天能系統(tǒng)曝光捕獲圖片，Image J分析條帶灰度值。

1.2.8 RT-PCR 檢測(cè)Apelin、APJ mRNA 水平 按1.2.3進(jìn)行細(xì)胞分組，PBS清洗貼壁細(xì)胞后加入裂解液，使RNA 充分溶解。藥物干預(yù)同1.2.6，采用Sim?ply P 總RNA 提取試劑盒提取RNA。按SureScriptTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照All-in-oneTMqPCR Primer 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并設(shè)置空白對(duì)照組，保證各復(fù)孔之間的Ct值差異不超過(guò)1，引物購(gòu)自GeneCopoeiaTM公司。根據(jù)2-ΔΔCt法分析目的基因的表達(dá)情況，ΔΔCt=ΔCt實(shí)驗(yàn)組-ΔCt對(duì)照組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，統(tǒng)計(jì)分析用Graphpad prism8 軟件進(jìn)行。應(yīng)用SPSS22.0 軟件進(jìn)行單因素方差分析。蛋白灰度值分析采用Image J軟件。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均采用±s表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Apelin/APJ 蛋白在氣道上皮細(xì)胞及炎癥損傷模型表達(dá)、定位 在正常對(duì)照組中，Apelin/APJ 表達(dá)于細(xì)胞膜，在給予LPS刺激時(shí)，細(xì)胞膜Apelin/APJ熒光強(qiáng)度明顯變亮。而后給予地膽頭提取液（20μg/ml）刺激細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞膜Apelin/APJ 蛋白表達(dá)量明顯增多，提示Apelin/APJ 系統(tǒng)在急性炎癥損傷期間被激活，參與急性炎癥損傷調(diào)節(jié)（圖1）。

圖1 Apelin/APJ 蛋白在氣道上皮細(xì)胞及炎癥損傷模型表達(dá)、定位Fig.1 Expression and localization of Apelin/APJ protein in airway epithelial cells and inflammatory injury model

2.2 Apelin-13 及地膽頭提取物對(duì)氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞活力的影響 與正常對(duì)照組比較，LPS 誘導(dǎo)后細(xì)胞活力明顯下降（P＜0.05）；與LPS組對(duì)比，Apelin-13干預(yù)后氣道上皮細(xì)胞活力明顯增高（P＜0.05）。地膽頭干預(yù)后氣道上皮細(xì)胞活力明顯提高，且濃度越高細(xì)胞活力增高越明顯（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 Apelin-13 及地膽頭提取物對(duì)氣道上皮細(xì)胞細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effects of Apelin-13 and extract of Elephantopus scaber Linn on viability of airway epithelial cells

2.3 Apelin-13 及地膽頭提取物對(duì)氣道上皮細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與正常對(duì)照組相比，LPS 模型組IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌顯著增加（P＜0.05）；與LPS 組對(duì)比，地膽頭干預(yù)后氣道上皮細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α 分泌明顯減少（P＜0.05），且濃度越高分泌越減少，80 μg/ml 地膽頭抑制炎癥因子釋放優(yōu)于Apelin-13組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 地膽頭對(duì)IL-1β、IL-6、TNF-α的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Effects of elephantopus scaber linn on IL-1β，IL-6，TNF-α（±s，n=8，pg/ml）

表1 地膽頭對(duì)IL-1β、IL-6、TNF-α的影響（±s，n=8，pg/ml）Tab.1 Effects of elephantopus scaber linn on IL-1β，IL-6，TNF-α（±s，n=8，pg/ml）

Note：Compared with negative control group，1）P＜0.05；compared with LPS group，2）P＜0.05；compared with LPS+Apelin-13，3）P＜0.05.

TNF-α 24.50±1.90 67.30±2.501）36.80±2.702）40.20±1.402）36.90±1.702）30.20±2.302）3）Groups Negative control LPS（10μg/ml）LPS＋Apelin-13（1μmol/L）LPS＋ESE（20μg/ml）LPS＋ESE（40μg/ml）LPS＋ESE（80μg/ml）IL-1β 62.23±7.60 96.37±8.501）79.43±6.402）83.62±5.702）78.32±8.202）69.65±6.702）3）IL-6 3.52±0.11 5.08±0.221）3.74±0.322）4.03±0.272）3.76±0.552）3.57±0.182）3）

2.4 地膽頭提取物對(duì)Apelin/APJ mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響 與正常對(duì)照組相比，LPS（10 μg/ml）可使細(xì)胞Apelin/APJ mRNA 轉(zhuǎn)錄增高（P＜0.05）；與LPS 組相比，給予Apelin-13、地膽頭干預(yù)后Apelin/APJ 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步增高（P＜0.05）。結(jié)果表明，LPS 可使Apelin/APJ 轉(zhuǎn)錄上調(diào)，Apelin-13、地膽頭可進(jìn)一步刺激氣道上皮細(xì)胞Apelin/APJ轉(zhuǎn)錄（圖3）。

圖3 地膽頭提取物對(duì)Apelin/APJ mRNA 轉(zhuǎn)錄的影響Fig.3 Effects of extract from Elephantopus scaber Linn on Apelin/APJ mRNA transcription

2.5 地膽頭提取物對(duì)Apelin/APJ蛋白表達(dá)的影響與正常對(duì)照組相比，LPS（10μg/ml）可使支氣管上皮細(xì)胞Apelin/APJ 表達(dá)增高（P＜0.05）；與LPS組相比，給予Apelin-13、地膽頭干預(yù)后Apelin/APJ 的表達(dá)水平進(jìn)一步增高（P＜0.05）。結(jié)果表明：LPS 可使Apelin/APJ 表達(dá)上調(diào)，Apelin-13、地膽頭可進(jìn)一步刺激支氣管上皮細(xì)胞Apelin/APJ表達(dá)（圖4）。

圖4 地膽頭提取物對(duì)Apelin/APJ蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of extract from Elephantopus scaber Linn on Apelin/APJ protein expression

3 討論

感染性疾病是臨床常見(jiàn)病，呼吸系感染性疾病尤為常見(jiàn)，呼吸系感染性疾病直接參與其他多種呼吸系疾病的進(jìn)展、惡化，是造成全球患者發(fā)病及死亡的主要原因［9］。感染性疾病中生物因素最為常見(jiàn)，細(xì)菌內(nèi)毒素（LPS）可誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等細(xì)胞炎癥因子（IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α）的分泌、釋放，引起ALI“炎癥風(fēng)暴”。臨床上針對(duì)“炎癥風(fēng)暴”炎癥因子釋放的藥物是糖皮質(zhì)激素，雖然激素對(duì)抑制炎癥因子釋放效果明顯，但較多患者存在激素抵抗，高劑量糖皮質(zhì)激素增加患者股骨頭壞死發(fā)病率，因此臨床上針對(duì)呼吸系統(tǒng)感染性疾病治療急需新的治療靶點(diǎn)和策略［10］。另外在介導(dǎo)肺部炎癥和損傷的機(jī)制及途徑等方面已被廣泛研究，但關(guān)于預(yù)防肺部感染和損傷的機(jī)制及途徑研究較少，很少有內(nèi)源性抗肺損傷機(jī)制的報(bào)道［11-12］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)培養(yǎng)支氣管上皮細(xì)胞及LPS構(gòu)建急性肺損傷細(xì)胞模型，首先以細(xì)胞免疫熒光法激光共聚焦技術(shù)觀(guān)察各組細(xì)胞胞內(nèi)Apelin/APJ 分布，闡明Apelin/APJ 蛋白為支氣管上皮細(xì)胞膜上表達(dá)。LPS刺激使支氣管上皮細(xì)胞Apelin/APJ 膜蛋白表達(dá)量明顯增多，提示Apelin/APJ 系統(tǒng)在ALI 期間被激活。其次，ELISA 檢測(cè)不同分組的細(xì)胞炎癥因子釋放水平，結(jié)果顯示LPS 使細(xì)胞炎癥因子表達(dá)明顯增多，Apelin-13 及不同濃度梯度地膽頭組藥物干預(yù)組IL-1β、IL-6、TNF-α 明顯下降，提示Apelin-13 及地膽頭可抑制IL-1β、IL-6、TNF-α 炎癥因子釋放，抑制炎癥損傷。采用Western blot 法明確了Apelin-13 及不同濃度梯度地膽頭組藥物干預(yù)細(xì)胞中Apelin/APJ表達(dá)量相較于對(duì)照組及LPS組增高，再次提示Apelin/APJ參與急性肺損傷調(diào)控。利用qPCR 檢測(cè)細(xì)胞Apelin/APJ 轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果提示Apelin/APJ 系統(tǒng)在急性炎癥損傷期間被激活，參與急性炎癥損傷調(diào)節(jié)。驗(yàn)證了該通路可以抵消炎癥和損傷反應(yīng)，防止失控的肺損傷。同時(shí)也提出中草藥地膽頭抗炎作用與Ape?lin/APJ 通路相關(guān)，與Apelin-13 陽(yáng)性對(duì)照組有類(lèi)似作用。

雖然Apelin-APJ 途徑是ALI 保護(hù)機(jī)制，但Ape?lin 較短的血漿半衰期限制目前的研究應(yīng)用于臨床治療。長(zhǎng)效APJ 受體激動(dòng)劑的開(kāi)發(fā)將克服這一局限。中草藥毒副作用相對(duì)較少，能夠從多種途徑發(fā)揮抗炎性，在新藥研發(fā)領(lǐng)域一直備受關(guān)注［13-14］。本課題組研究證實(shí)地膽頭可有效抑制社區(qū)獲得性肺炎炎癥因子釋放，有效減少患者住院時(shí)間，減輕癥狀，同時(shí)也證實(shí)地膽頭能夠顯著增加AECOPD 治療效果，增強(qiáng)抗氧化能力，明顯改善肺功能。地膽頭抑制炎癥因子釋放。機(jī)制可能與TLR4/NF-κB 通路相關(guān)［15］。目前關(guān)于中草藥抗炎作用的研究，較少涉及分子水平層面上。然而中草藥具有多種有效成分，往往具有多靶點(diǎn)抗炎性，造成研究者及醫(yī)務(wù)工作者對(duì)大多數(shù)中草藥抗炎作用的具體分子機(jī)制了解不夠深入及全面，至今發(fā)表從基因水平研究中草藥抗炎作用的報(bào)道也不多，以致嚴(yán)重阻礙了中草藥在世界范圍內(nèi)的推廣及臨床應(yīng)用［16］。因此運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)方法研究傳統(tǒng)中草藥的抗炎機(jī)制是發(fā)展宏大中醫(yī)藥的必經(jīng)之路，探尋中草藥抗炎新靶點(diǎn)分子機(jī)制，尋找抗炎性強(qiáng)且毒副作用低的抗炎中草藥為大勢(shì)所趨［17］。