基于響應(yīng)面優(yōu)化杜仲多糖提取工藝的研究

朱 琳，郝曉亮，徐園園，田曉溪

（遼寧科技大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 鞍山 114051）

杜仲具有利尿、降壓、消炎、強(qiáng)身健體的功效，杜仲的葉和皮富含《中國藥典》中提到的多化糖合物，具有多種抗氧化成分，因此，杜仲在中藥材中用途非常廣泛，對于腰膝酸軟、畏寒怕冷、高血壓、風(fēng)濕病，尤其是現(xiàn)代社會中，對于各種腰椎疾病、骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)疼痛、風(fēng)濕痹痛，都可以起到很好的治療效果[1-3]。

多糖在抗癌抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等方面有很大的功效。本文先考察單因素乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間對多糖提取率的影響，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件，對杜仲多糖的食品研究，醫(yī)藥研究等方面的效益增加有著重要價(jià)值[4-5]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲來源于市售，葡萄糖、苯酚、硫酸等均為分析純，由遼寧科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-250B 超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司生產(chǎn)；UV-2000 紫外可見分光光度計(jì)，上海分析儀器總廠生產(chǎn)；JM-A1003 電子天平，諸暨市超澤衡器設(shè)備有限公司生產(chǎn)；多功能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；HH-2恒溫水浴鍋：金壇市城東新瑞儀器廠生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)過程

1.3.1 杜仲粉的預(yù)處理

將杜仲放入多功能粉碎機(jī)內(nèi)進(jìn)行粉碎，重復(fù)3 次粉碎操作，過濾后置于干燥器中備用。

1.3.2 杜仲多糖提取

精確稱量0.5 g預(yù)處理后的杜仲粉，以不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑，按工藝研究中的不同參數(shù)設(shè)定提取時(shí)間，提取結(jié)束后過濾得到杜仲粗多糖，記錄過濾后的溶液體積。

1.3.3 多糖含量與提取率的測定

準(zhǔn)備2 支10 mL 容量瓶，標(biāo)號1、2，取杜仲粗多糖1.0 mL于1 號容量瓶中，去離子水定容后超聲，取超聲后的樣液0.125 mL 于2 號容量瓶中，加入0.875 mL 去離子水，超聲，去離子水補(bǔ)至2 mL，再次超聲。超聲后的樣液中加入1.0 mL濃度為5%的苯酚，搖勻超聲后快速加入5.0 mL的濃硫酸，超聲后放入已設(shè)定40℃水浴鍋中水浴加熱15 min，取出后迅速冷卻至室溫，用2.0 mL 蒸餾水做空白調(diào)節(jié)透過率，調(diào)節(jié)在波長490 nm 處使用預(yù)熱好的分光光度計(jì)測定其吸光度，記錄，結(jié)合其余條件計(jì)算提取率。

1.4 杜仲多糖提取試驗(yàn)

1.4.1 單因素試驗(yàn)

將杜仲在粉碎機(jī)內(nèi)粉碎。取杜仲粉末0.5 g 于磨口錐形瓶中，加入配好超聲后的乙醇溶液，加入根據(jù)設(shè)計(jì)得出后的料液比，在不同提取時(shí)間下提取多糖。試驗(yàn)結(jié)束后分別對不同試驗(yàn)得出得吸光度和剩余體積進(jìn)行計(jì)算，得出多糖的提取率，初步確定各個(gè)因素的影響程度及較好的提取條件[6-7]。

（1）料液比的篩選。料液比分別設(shè)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，提取時(shí)間30 min、70%乙醇溶液，得出不同料液比對多糖提取率的影響。

（2）乙醇濃度的篩選。乙醇濃度分別設(shè)為50%、60%、70%、80%、90%，在料液比1∶50（選擇最優(yōu)料液比）、超聲提取30 min，得出不同乙醇濃度對多糖提取率的影響。

（3）超聲提取時(shí)間的篩選。超聲提取時(shí)間分別設(shè)為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，在料液比1∶50（選擇最優(yōu)料液比）、乙醇濃度60%（選擇最優(yōu)乙醇濃度），得出不同提取時(shí)間對多糖提取率的影響。

1.4.2 多糖含量的測定

多糖含量測定采用苯酚——硫酸法[3]，在490 nm波長處，將濃度（mg/mL）設(shè)為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，作直線回歸，結(jié)果見圖1。

圖1 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose solution

多糖提取率計(jì)算公式：

式中：C——由葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到的多糖含量；V——提取液定容體積，mL；W——樣品取樣質(zhì)量，g。

1.4.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

用料液比1：50，提取時(shí)間為30 min，乙醇溶液濃度為60%作為基本條件，改變單因素中的不同水平，比較不同因素條件下對提取液中多糖類化合物的影響并檢測杜仲中多糖的提取率的大小。

1.4.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

綜合單因素試驗(yàn)的結(jié)果，使用Design-Expert 8.0.6 軟件設(shè)計(jì)響應(yīng)面，以多糖提取率作為響應(yīng)值，對不同乙醇濃度、料液比及提取時(shí)間3個(gè)因素做出改變，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)[8]。

1.4.5 正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)表Tab.1 The rthogonal test table

2 試驗(yàn)結(jié)果討論與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對杜仲多糖提取率的影響

由圖2 知，多糖的提取率隨著提取時(shí)間的延長呈先增大后減小的趨勢，在30 min 左右時(shí)，提取已經(jīng)較為完全。后續(xù)提取率的下降可能由于超聲儀器長時(shí)間工作導(dǎo)致的升溫使多糖的內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。

圖2 提取時(shí)間對多糖提取率的影響Fig.2 The effect of extraction time on polysaccharide extraction rate

2.1.2 料液比對杜仲多糖提取率的影響

由圖3 知，料液比的增大，杜仲多糖提取率逐漸增大，當(dāng)料液比為1∶50時(shí)，達(dá)到最大，此后有小幅度降低，分析可能由于料液比的增大導(dǎo)致后續(xù)過濾的困難。

圖3 料液比對多糖提取率的影響Fig.3 The effect of material liquid ratio on polysaccharide extraction rate

2.1.3 乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響

由圖4知，當(dāng)乙醇濃度由50%上升到60%，提取率迅速增大，然后雖然乙醇濃度增加，但提取率呈下降的趨勢，可能由于乙醇濃度的增加導(dǎo)致多糖的活性和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

圖4 乙醇濃度對多糖提取率的影響Fig.4 The effect of ethanol concentration on polysaccharide extraction rat

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

響應(yīng)面的設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面的設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 The design and the results of the response surface

經(jīng)過多元回歸模擬分析，得到杜仲多糖提取率的預(yù)測值（Y）對編碼1.22A2-0.30B2-0.27C2-0.005AB-0.01AC-0.005B C+0.095A+0.19B-0.085C，對該回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果的方差分析Tab.3 The variance analysis of the response surface results

由表3 分析可知，模型P＜0.05，上述回歸模型差異顯著，說明杜仲多糖提取率的擬合方程可靠性很好，在擬合方程一次項(xiàng)A、B、C 中，A 的P值＜0.001，效果極顯著，可得出乙醇濃度對多糖的提取率相比于提取時(shí)間和料液比對多糖的提取率影響較大。

圖7 料液比和乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響Fig.7 Effects of solid liquid ratio and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharide

根據(jù)響應(yīng)面法對提取參數(shù)與杜仲多糖提取率之間的關(guān)系分析三維響應(yīng)面圖，隨著乙醇濃度的增加和液料比的增加，多糖的提取率逐漸增加到一定值時(shí)，多糖的提取率開始下降。

圖8 提取時(shí)間和乙醇濃度對杜仲多糖提取率的影響Fig.8 The effect of extraction time and ethanol concentration on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

隨著提取時(shí)間和乙醇濃度的增加，多糖的提取率逐漸增加。

圖9 提取時(shí)間和料液比對杜仲多糖提取率的影響Fig.9 The effect of extraction time and material liquid ratio on extraction rate of Eucommia ulmoides polysaccharides

隨著提取時(shí)間的增加和料液比的增加，多糖的提取率呈先增大后減小的趨勢

3 結(jié)論

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，進(jìn)一步進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，對提取杜仲中多糖物質(zhì)進(jìn)行分析，優(yōu)化工藝條件最后得出提取率最高的工藝為料液比為1∶60，乙醇濃度60%，提取40 min，多糖的提取率為44.53%。本研究為獲得經(jīng)濟(jì)、簡單、穩(wěn)定、可行的杜仲多糖提取工藝提供了參考依據(jù)，為杜仲多糖的醫(yī)藥、食品等產(chǎn)品的研發(fā)提供資料支撐。