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    基于微生物16SrRNA測(cè)序技術(shù)對(duì)ICR小鼠傳代后腸道菌群變化的分析

    2022-07-25 06:42:06張璐瑤顓清芮傅祥偉侯云鵬
    關(guān)鍵詞:雄性乳酸菌菌群

    張璐瑤 孟 琳 顓清芮 傅祥偉,3 侯云鵬*

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物學(xué)院/農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院/畜禽育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室,北京 100193;3.新疆農(nóng)墾科學(xué)院 省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,新疆 石河子 832000)

    哺乳動(dòng)物胃腸道內(nèi)定植了1 014種細(xì)菌,這些細(xì)菌基因總和是宿主基因數(shù)目的 100 多倍,因此也被稱為寄主體內(nèi)的“隱形器官”。近年來(lái)關(guān)于哺乳動(dòng)物腸道微生物的研究表明,腸道微生物可以通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)分泌和神經(jīng)等方式參與機(jī)體的能量代謝、物質(zhì)吸收、免疫調(diào)節(jié)等多項(xiàng)生命活動(dòng)。作為宿主體內(nèi)控制代謝的隱形器官,腸道微生物失調(diào)可能造成多種代謝紊亂疾病,如肥胖,Ⅱ型糖尿病,脂肪肝和動(dòng)脈粥樣硬化等。此外,腸道菌群易受宿主年齡、性別以及飲食等應(yīng)激性環(huán)境因素的影響。

    小鼠腸道中存在大量的微生物菌群,這些微生物菌群結(jié)構(gòu)復(fù)雜種類繁多,參與宿主的代謝,在宿主的消化吸收和免疫調(diào)控方面均發(fā)揮了重要作用,對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育有很大影響。ICR品系小鼠以多產(chǎn)為目標(biāo)進(jìn)行選育,由美國(guó)癌癥研究所(Institute of cancer research)分送各國(guó)飼養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)小鼠ICR。ICR品系小鼠毛色白化,同時(shí)具有適應(yīng)性強(qiáng),體格健壯,繁殖力強(qiáng),生長(zhǎng)速度快,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等特點(diǎn),是常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室模式動(dòng)物。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室和我國(guó)的從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)管理的研究者發(fā)現(xiàn),經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間和多代次的近親擴(kuò)繁,ICR品系小鼠隨著繁殖代次的增加會(huì)出現(xiàn)一些生長(zhǎng)和繁殖性能異常的狀況。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn),ICR品系小鼠傳代后新生子代的生長(zhǎng)速度顯著降低,各年齡段體重顯著降低,體長(zhǎng)顯著降低等現(xiàn)象。

    隨著基因組技術(shù)和二代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,研究微生物群落結(jié)構(gòu)也實(shí)現(xiàn)了從傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)基提取法到使用高通量測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)變。其中,16SrRNA測(cè)序已經(jīng)成為研究微生物群落組成及其分布的重要手段。16SrRNA測(cè)序技術(shù)是通過(guò)比對(duì)細(xì)菌 16SrRNA 序列對(duì)細(xì)菌進(jìn)行快速種屬鑒定的一種方法。與此同時(shí)16SrRNA測(cè)序技術(shù)還可以對(duì)樣品中的優(yōu)勢(shì)物種以及一些未知的物種進(jìn)行檢測(cè)和分類,獲得樣品中的微生物組成并計(jì)算出它們的相對(duì)豐度。此外,16SrRNA測(cè)序還可以通過(guò)差異菌群進(jìn)行差異代謝通路預(yù)測(cè)分析,預(yù)測(cè)腸道微生物的變化帶來(lái)的代謝差異表型等。由此,猜測(cè)ICR品系雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異??赡芘c其腸道微生物的改變有關(guān)。為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異常和其腸道微生物的關(guān)系,分別收集F0、F1、F2和F3代18周雄鼠的大腸內(nèi)容物,每組收集6個(gè)重復(fù),通過(guò)16SrRNA測(cè)序技術(shù),研究ICR雄性小鼠傳代之后腸道菌群的變化。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    1

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    1

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    試驗(yàn)動(dòng)物

    清潔級(jí)雌性ICR小鼠20只,雄性ICR小鼠10只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)7周齡,體重25~30 g。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室,小鼠繁殖飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食、飲水。小鼠繁殖飼料具體營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)(表1),從華阜康實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司購(gòu)買。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)格按照相關(guān)參數(shù)進(jìn)行控制:小鼠自由采食和飲水,供應(yīng)充足,墊料每周更換一次。光照控制在12 h∶12 h(北京時(shí)間8:00~20:00光照),溫度控制在20~25 ℃,濕度為45%~55%。

    表1 飼料配方Table 1 Feed formula

    1.2 試驗(yàn)方法

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    .

    2

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    1

    動(dòng)物建模方式

    所有小鼠均在清潔級(jí)鼠房飼養(yǎng)一周以適應(yīng)環(huán)境,將這些小鼠作為F0代記錄。隨后,標(biāo)記耳號(hào)(耳號(hào)按繁殖代次標(biāo)記為:F0:10XX)并記錄后,每籠按照雌雄比2∶1進(jìn)行合籠。雌鼠明顯懷孕后,取出單籠飼養(yǎng)。產(chǎn)仔記為F1代,及時(shí)記錄產(chǎn)仔數(shù)與出生體重(注意初產(chǎn)雌鼠易食仔,需及時(shí)查看處理;若雌鼠流產(chǎn)導(dǎo)致妊娠失敗也需記錄)。幼鼠F1代21日齡時(shí)斷奶,標(biāo)記耳號(hào)并記錄性別與離乳體重,將飼料剝碎放入幼鼠籠內(nèi)便其采食。35日齡(性成熟)時(shí),取體況良好的F1代雄鼠與雌鼠1∶2交配進(jìn)行下一代繁殖實(shí)驗(yàn),此時(shí)應(yīng)注意避免近親交配,產(chǎn)仔標(biāo)記為F2代。處理過(guò)程與上述F0代時(shí)處理相同。以此類推,F(xiàn)2代雄鼠和雌鼠1∶2交配后產(chǎn)生的后代記為F3代,以此類推,將其后代分別標(biāo)記為F1:11XX,F(xiàn)2:12XX,F(xiàn)3:13XX,F(xiàn)4:14XX, F5:15XX。

    1

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    2

    .

    2

    腸道微生物樣本收集

    小鼠處死后,取大腸中的內(nèi)容物于無(wú)菌凍存管中,分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周 雄鼠的大腸內(nèi)容物,每組收集6個(gè)重復(fù)。標(biāo)記好后立即投入液氮中迅速冷凍。待所有樣本收集完成后,轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱中保存。

    1

    .

    2

    .

    3

    腸道微生物樣本DNA提取

    大腸內(nèi)容物標(biāo)本解凍以后,按照Fast DNA SPIN Soil Kit (MP Biomedicals,Santa Ana,CA)說(shuō)明書(shū)的操作說(shuō)明進(jìn)行樣本DNA提取,提取細(xì)菌DNA。所有樣品全部提取完成后,放入干冰中送檢,使用Qiime平臺(tái)進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。后續(xù)的細(xì)菌DNA擴(kuò)增和數(shù)據(jù)分析均由北京奧維森科技有限公司承擔(dān)。

    1

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    2

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    4

    細(xì)菌DNA擴(kuò)增

    對(duì)腸道微生物樣本的16SrRNA V3~V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物為(F:ACTCCTACGGGAGGCAGCAG R:GGACTACHVGGGTWTCTAAT 北京奧維森科技有限公司)。選擇Premix Taq 試劑。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系如下:94 ℃預(yù)變性5 min; 94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min, 28個(gè)循環(huán); 72 ℃延伸7 min。然后使用1%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)樣本質(zhì)量進(jìn)行定量檢測(cè),最終選擇DNA濃度>50 mg/L、總量>3 ng的24份樣品進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。

    1

    .

    2

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    5

    細(xì)菌16SrRNA測(cè)序分析

    使用16SrRNA的高可變區(qū)QIIME測(cè)序技術(shù),對(duì)樣品的16SrRNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果以“Fast-q”格式存儲(chǔ)。同時(shí),使用Mi-seq測(cè)序得到Pair-End(PE)雙端序列數(shù)據(jù),對(duì)測(cè)得的數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析,經(jīng)過(guò)一系列的篩選,拼接和去冗余處理等,最終得到優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)。質(zhì)控分析過(guò)程中,需要使用Trimmomatic (V0.36),Pear (V0.96),F(xiàn)lash (V1.20),Vsearch (V2.7.1)等相關(guān)軟件。

    將序列按照相對(duì)豐度排序,排列順序從高到低。所有序列依據(jù)不同的相似度進(jìn)行OTU劃分,對(duì)大于97%相似水平的OTU進(jìn)行生物信息分析。結(jié)合QIIME(version 1.9.1)平臺(tái),參考16S細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù), kSilva2(Release128/132 http:∥www.arbsilva.de),RDP(V16 http:∥rdp.cme.msu.edu/),Greengene(Release13.5 http:∥greengenes.secondgenome.com/)采用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析。最后通過(guò)序列比對(duì)獲得每個(gè)OTUs的物種分類信息。使用PICRUSt對(duì)OTUs豐度標(biāo)準(zhǔn)化,并將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)化的OTUs對(duì)應(yīng)到相應(yīng)的基因進(jìn)化樹(shù),從而得到相應(yīng)的KEGG信息,并用STAM P對(duì)得到的KEGG進(jìn)行差異分析。

    1

    .

    2

    .

    6

    統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS分析軟件中的獨(dú)立樣本

    t

    檢驗(yàn)對(duì)小鼠的體重,微生物多樣性以及特定菌種差異分析。

    P

    <0.05為顯著性差異,

    P

    <0.01為極顯著性差異,

    P

    >0.05為差異不顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同繁殖代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重分析

    為了探究不同代次ICR品系小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育情況,在0、3、5和18周4個(gè)時(shí)期分別取F1、F2、F3、F4和F5 代雄性小鼠進(jìn)行稱重,每組樣本數(shù)不低于20只。統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示,在0、3、5和18周,小鼠的體重隨著代次的積累均呈下降趨勢(shì),且差異顯著,說(shuō)明ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加,體重顯著降低。

    *P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,ns差異不顯著(P>0.05)。下同。* Represents P<0.05, ** Represents P<0.01, *** Represents P<0.001, ns represents significant difference at 0.05 level。The same below.圖1 不同代次ICR雄性小鼠在相同周齡的體重比較Fig.1 Comparison of body weight of ICR male mice of different generations at the same age

    2.2 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物測(cè)序分析

    為探究ICR雄性小鼠隨著繁殖代次的增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)發(fā)育異常和其腸道菌群關(guān)系,分別收集F0、F1、F2和 F3 代 18周雄鼠的大腸內(nèi)容物,每組收集6個(gè)重復(fù),對(duì)16S的V3~V4可變區(qū)進(jìn)行16SrRNA測(cè)序。根據(jù)16SrRNA的測(cè)序結(jié)果,采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析,參考16 s細(xì)菌和古菌核糖體數(shù)據(jù)庫(kù)Silva,共產(chǎn)生 1 786 個(gè) OTU,經(jīng)過(guò)抽平處理剩余1 729個(gè)。如圖2(a)示,F(xiàn)0代有OTUs 有1 276個(gè),其中特殊OTUs 有87個(gè);F1代有OTUs 有1 258個(gè),其中特殊OTUs 有113個(gè);F2代有OTUs 有1 173個(gè),其中特殊OTUs 有47個(gè);F3代有OTUs 有1 195個(gè),其中特殊OTUs 有47個(gè)。為了更好的顯示多個(gè)樣本之間的距離關(guān)系,將加權(quán)與未加權(quán)的unifrac樣本距離矩陣用熱力圖表現(xiàn)出來(lái),如圖2(b)所示,聚類結(jié)果表明F0、F1、F2和 F3 代各組間微生物群落物種有明顯差異。

    圖2 不同代次ICR雄性小鼠腸道微生物測(cè)序分析Fig.2 Intestinal microbial sequencing analysis of different generations of male ICR mice

    2.3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性指數(shù)分析

    通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品OTU總數(shù)和每個(gè)OTU的相對(duì)豐度進(jìn)行樣品多樣性指數(shù)的計(jì)算。不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較結(jié)果見(jiàn)圖3。在分析Alpha 多樣性的過(guò)程中,通常使用Shannon-Wiener指數(shù)來(lái)反映樣本中微生物多樣性,Shannon指數(shù)利用各樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的微生物多樣性指數(shù)構(gòu)建曲線,反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。如圖3(b)所示,隨樣本序列數(shù)的增加,曲線逐漸趨于平坦,說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠反映樣本中絕大多數(shù)微生物的信息,測(cè)序分析預(yù)測(cè)結(jié)果可信度較高。Chao1和Observed-species指數(shù)根據(jù)所測(cè)得OTUs的數(shù)量來(lái)預(yù)測(cè)樣品中微生物種類,兩者值越大,物種越豐富;由圖3(c)可知,F(xiàn)0、F1、F2和F3的chao1指數(shù)分別為922.035±78.932 8、821.1 625±72.941 8、757.502 5±19.1 453和613.325±106.878 7,各組兩兩比較均有顯著差異(

    P

    <0.05),隨繁殖代次的增加,chao1指數(shù)顯著下降。由圖3(d)可知,F(xiàn)0、F1、F2和F3的Observed-species指數(shù)分別為654.2±53.52 23、557.675±49.626 3、548.7±18.476 7和384.2±54.112 9,F(xiàn)0、F1和F2間兩兩比較無(wú)顯著差異(

    P

    >0.05),但F3代較前三組有顯著下降(

    P

    <0.001)。辛普森指數(shù) (Simpson) 和香儂指數(shù)(Shannon)的計(jì)算是基于樣品的所有OTU豐度和均勻度及其注釋物種信息進(jìn)行的。辛普森指數(shù)和香儂指數(shù)可以反映樣本的菌群種類數(shù)和每個(gè)菌種占總體群落的比例, Simpson指數(shù)越接近于1,香儂指數(shù)(Shannon)指數(shù)越大,說(shuō)明樣品中的菌群種類越豐富,多樣性水平越高。由圖3(e)可知,F(xiàn)0、F1、F2和F3的香儂指數(shù)(Shannon)分別為5.3 275±0.607 0、5.7 375±0.481 5、4.425±0.484 1和3.5 775±0.417 7,F(xiàn)0和F1比較無(wú)顯著差異(

    P

    >0.05),但隨代次的增加,F(xiàn)2和F3的香儂指數(shù)(Shannon)指數(shù)顯著下降(

    P

    >0.05)。由圖3(f)可知,F(xiàn)0、F1、F2和F3的Simpson指數(shù)分別為0.865±0.075 50、0.902 5±0.069 56、0.877 5±0.044 25和0.815±0.03 697,各組兩兩比較均無(wú)顯著差異(

    P

    >0.05)。綜上,結(jié)果表明隨繁殖代次的增加,腸道菌群Alpha多樣性呈顯著下降趨勢(shì)。

    圖3 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的Alpha多樣性比較Fig.3 Comparison of Alpha diversity of intestinal microbial in different generations of male ICR mice

    2.4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門(mén)水平微生物類群的差異

    不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群門(mén)水平聚類結(jié)果表明各組間微生物群落物種有明顯差異。如圖4(a),在門(mén)水平上,各組的優(yōu)勢(shì)菌群均為厚壁菌門(mén)(Firmicutes)(F0、F1、F2和F3組分別為83.3%,79.0%,81.8%和90.3%)和擬桿菌門(mén)(Bacteroides)(F0、F1、F2和F3組分別為6.0%、5.1%、4.0%和3.2%)。在F0組中擬桿菌門(mén)(Bacteroides)的豐度為6.0%,厚壁菌門(mén)的豐度為83.3%,且在F1組中擬桿菌門(mén)(Bacteroides)的豐度顯著低于F0組(

    P

    <0.01),F(xiàn)2和F3組也顯著低于F0和F1組(

    P

    <0.01)(圖4(b))。此外,如圖4(c),脫鐵桿菌門(mén)(Deferribacteres)在F2和F3組中的豐度也有顯著降低(

    P

    <0.01)。綜上,隨代次積累,ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在門(mén)水平上有很大變化,并且隨代次積累,對(duì)一些特定的菌群,如厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和脫鐵桿菌門(mén)豐度的影響更為深遠(yuǎn)。

    圖4 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中門(mén)水平微生物類群的差異Fig.4 Differences of phylum level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

    2.5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異

    如圖5(a)所示,毛螺菌科-NK4A136組,螺桿菌屬、乳酸球菌、梭菌屬-sencu-stricto-1、瘤胃球菌屬、彎曲桿菌屬、未確認(rèn)的-毛螺菌科、鏈球菌屬、乳酸菌屬、球菌屬、埃希氏菌屬、普氏菌屬和擬桿菌-S24-7組等在各組腸道微生物群中屬水平微生物類群均有差異。在屬水平上,F(xiàn)0、F1和F2 3組的優(yōu)勢(shì)菌群均為乳酸菌屬(

    Lactobacillus

    )(F0、F1和F2組分別為83.1%、62.8%和38.2%),但F3代小鼠的一些未確認(rèn)分類的菌屬占比較高,約為45.3%。此外,如圖5(b)所示,雖然F0、F1和F2三組中乳酸菌屬均為優(yōu)勢(shì)菌群,但各組的乳酸菌屬豐度有顯著差異(

    P

    <0.05),且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢(shì)。埃希氏菌屬(

    Escherichia

    )(F0、F1、F2和F3組分別為0.015%、0.032%、0.439%和2.41%)在F1、F2和F3代中的豐度有顯著升高(

    P

    <0.01)(圖5c)。綜上,隨代次積累,ICR品系小鼠腸道微生物多樣性在屬水平上有很大變化,并且隨代次積累,產(chǎn)生的影響更為深遠(yuǎn)。

    圖5 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物群中屬水平微生物類群的差異Fig.5 Differences of genus level microflora in the intestinal microbiota of different generations of male ICR mice

    2.6 不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的差異代謝途徑(KEGG)預(yù)測(cè)

    為進(jìn)一步探究ICR子代體重下降的機(jī)制,本研究針對(duì)這一變化出現(xiàn)的差異最明顯的兩個(gè)組,即F0代和F3代的腸道微生物進(jìn)行KEGG差異代謝通路預(yù)測(cè)。如圖6可知,KEGG分析發(fā)現(xiàn)14條代謝途徑有顯著差異,其中,乙醛酸鹽代謝、胰島素信號(hào)通路、苯丙氨酸,色氨酸和酪氨酸生物合成途徑,萜類化合物生物合成途徑,肽聚糖生物合成和糖酵解糖異生作用在F3組中的豐度顯著低于F0組(

    P

    <0.05),結(jié)果顯示F3代氨基酸合成,糖類代謝等多條基礎(chǔ)代謝通路受損。因此,不同繁殖代次ICR雄性小鼠腸道微生物的變化可能對(duì)小鼠的新陳代謝有一定影響。

    圖6 F0和F3組腸道微生物差異生物功能代謝通路預(yù)測(cè)Fig.6 Analysis of metabolic pathway of biological different functions of the fecal microbiota in different generations of male ICR mice

    3 討 論

    3.1 ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低

    本研究采用16SrRNA基因高通量測(cè)序技術(shù)分析ICR雄性小鼠隨著繁殖代次增加出現(xiàn)的生長(zhǎng)異常和其腸道菌群的關(guān)系。通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的深度挖掘和分析,發(fā)現(xiàn)隨代次積累,ICR雄性小鼠腸道微生物多樣性顯著降低,優(yōu)勢(shì)菌門(mén)如擬桿菌門(mén)豐度顯著降低,相關(guān)益生菌門(mén)如脫鐵桿菌門(mén)的豐度也顯著降低,且隨代次的積累逐漸下降。以上結(jié)果顯示腸道菌群的失調(diào)可能是導(dǎo)致ICR雄性小鼠出現(xiàn)生長(zhǎng)異常的原因。大多數(shù)細(xì)菌可被可歸為兩大類,一大類是厚壁菌門(mén),包括葡萄球菌、鏈球菌等;另一大類是擬桿菌門(mén)。有研究表明腸道菌群多樣性會(huì)影響宿主的體重,在對(duì)各組腸道菌群的分析中,不難發(fā)現(xiàn)擬桿菌門(mén)豐度顯著降低,這些變化可能與ICR雄性小鼠體重降低有關(guān)。另外值得注意的是,在針對(duì)屬水平的腸道微生物豐度分析中,發(fā)現(xiàn)隨ICR雄性小鼠繁殖代次的積累,乳酸菌屬豐度顯著降低,且隨代次的積累呈逐漸下降的趨勢(shì)。

    乳酸菌(

    Lactic

    acid

    bacteria

    ,LAB)是一類在動(dòng)物胃腸道中廣泛存在的厭氧或兼性厭氧性細(xì)菌,且此類細(xì)菌利用可發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生大量乳酸等有機(jī)酸,是一類廣譜益生菌。作為益生菌,乳酸菌具有豐富的物種多樣性,包含18個(gè)屬,共200多種。乳酸菌在代謝過(guò)程中可以為宿主供給必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),增強(qiáng)代謝,促進(jìn)其生長(zhǎng)。乳酸菌還可以調(diào)節(jié)腸道環(huán)境酸堿平衡,使其符合淀粉酶和糖化酶等消化酶的最適pH,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。此外,乳酸菌可以改善腸道微環(huán)境,抑制一些有害的致病菌的生長(zhǎng),增強(qiáng)生物體對(duì)疾病的抵抗力?;诖?,本研究認(rèn)為乳酸菌豐度的降低是造成 ICR雄性小鼠子代出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常的一個(gè)重要原因。

    3.2 ICR雄性小鼠KEGG差異功能預(yù)測(cè)

    除了益生菌缺失對(duì)腸道菌群多樣性造成的影響之外,腸道菌群還在機(jī)體不同的代謝途徑中發(fā)揮作用。差異菌群導(dǎo)致的代謝異??梢赃M(jìn)一步解釋ICR雄性小鼠子代出現(xiàn)生長(zhǎng)發(fā)育異常表型。結(jié)合KEGG分析表明,隨繁殖代次增加,ICR雄性小鼠的苯丙氨酸,色氨酸和酪氨酸生物合成等氨基酸合成途徑,萜類化合物生物合成途徑,胰島素信號(hào)通路,糖酵解糖異生作用等糖類代謝途徑可能會(huì)出現(xiàn)表達(dá)異常的情況。芳香族氨基酸中的苯丙氨酸、色氨酸屬于必需氨基酸,而酪氨酸是半必需氨基酸。其中苯丙氨酸可以氧化成酪氨酸,并與酪氨酸一起合成重要的神經(jīng)遞質(zhì)和激素,參與機(jī)體糖代謝和脂肪代謝,因此芳香族氨基酸代謝對(duì)機(jī)體的其他兩大代謝途徑有很重要的調(diào)節(jié)作用,芳香族氨基酸代謝失調(diào)將直接導(dǎo)致機(jī)體的代謝功能紊亂。此外,胰島素信號(hào)通路在機(jī)體代謝的調(diào)控方面也有舉足輕重的地位。胰島素是能量代謝的主要調(diào)控激素,胰島素與受體結(jié)合后,激活受體中的蛋白酪氨酸激酶(PI3K),被激活的酪氨酸激酶作用于受體底物,使受體底物發(fā)生磷酸化,隨后激活3種已知的 AKT 異構(gòu)體,最終通過(guò)多種不同的途徑參與到胰島素的代謝調(diào)節(jié)中,促進(jìn)機(jī)體對(duì)能量利用。通過(guò)圖6可以推測(cè)ICR雄性小鼠能量利用率也在逐漸降低。

    3.3 展望

    本研究結(jié)果初步探明ICR雄性小鼠的腸道菌群失衡可能是導(dǎo)致其生長(zhǎng)發(fā)育異常的機(jī)制之一。由于機(jī)體腸道微生物的組成結(jié)構(gòu)復(fù)雜,本研究?jī)H在門(mén)和屬水平對(duì)腸道菌群進(jìn)行了研究,并根據(jù)KEGG分析了可能影響的基礎(chǔ)代謝通路,對(duì)于具體關(guān)鍵微生物和生長(zhǎng)發(fā)育之間的因果關(guān)系值得進(jìn)一步研究。在后續(xù)的研究中,可以考慮對(duì)ICR小鼠進(jìn)行乳酸菌等益生菌的灌胃試驗(yàn),觀察是否可以改善ICR雄性小鼠后代發(fā)育異常和體重下降等異常情況。

    本研究結(jié)果同時(shí)表明,F(xiàn)2代前優(yōu)勢(shì)菌群未發(fā)生明顯改變,建議使用ICR子代進(jìn)行試驗(yàn)研究最好在F2代前,如確需更多子代進(jìn)行研究,建議考慮以非近親繁殖方式的進(jìn)行交配以進(jìn)行擴(kuò)繁和傳代。對(duì)個(gè)體一致性和遺傳表型穩(wěn)定性一要求較高的生物學(xué)試驗(yàn)ICR鼠不建議作為首選,如果實(shí)驗(yàn)室經(jīng)費(fèi)和資源有限,在使用ICR小鼠進(jìn)行繁殖實(shí)驗(yàn)時(shí),須定期引入親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的ICR小鼠進(jìn)行擴(kuò)繁和傳代。

    4 結(jié) 論

    ICR雄性小鼠傳代后腸道微生物多樣性顯著降低,擬桿菌門(mén)和脫鐵桿菌門(mén)豐度顯著降低,乳酸菌屬豐度顯著降低,埃希氏菌屬等致病菌豐度顯著提高。結(jié)合差異代謝通路預(yù)測(cè)分析,隨代次積累ICR雄性小鼠氨基酸合成,糖類代謝等多條基礎(chǔ)代謝通路可能受損,這些變化均可導(dǎo)致ICR雄性小鼠后代發(fā)育異常和體重下降等缺陷。

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