高分子脲醛緩釋肥料降解菌的篩選及降解酶性質(zhì)初探

王 芳 胡培毅 向 陽(yáng) 郄浩然 仝迎芳 劉子超郭仕偉 郭建峰 劉亞青*

(1.中北大學(xué) 化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，太原 030051； 2.納米功能復(fù)合材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030051； 3.山西省高分子復(fù)合材料工程技術(shù)研究中心，太原 030051)

脲醛(UF)肥料是高分子聚合材料的1種，由不同長(zhǎng)度鏈的聚合物組成。全球每年有30多萬(wàn)t脲醛用做樹(shù)脂、粘合劑、絕緣材料和用于綠色植物、草坪或生物修復(fù)過(guò)程的控釋氮肥。脲醛肥料是最早的緩釋肥料，可在自然環(huán)境中逐步降解，緩慢釋放所含氮肥。脲醛肥料中氮等肥料的精準(zhǔn)受控釋放是肥效增高的關(guān)鍵，溫度、水分、pH等理化因素都會(huì)影響其降解過(guò)程以及肥效。

其他高分子聚合材料，如聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)的生物降解是環(huán)境保護(hù)研究的熱點(diǎn)。已有研究表明黃粉蟲(chóng)的幼蟲(chóng)(

Tenebrio

molitor

Linnaeus

)可以降解PE等塑料材料，其腸道中特定微生物以及微生物分泌的降解酶是降解塑料的主要酶。土壤中富含多種微生物，理論上，土壤中可能存在一些微生物，會(huì)影響高分子脲醛緩釋肥料(PSRF)的降解過(guò)程。有研究表明脲醛緩釋肥與土壤中微生物具有復(fù)雜的相互作用：一方面土壤中的微生物參與降解脲醛肥料，提高氮源的釋放速度；另一方面緩釋復(fù)合肥對(duì)土壤中微生物有促進(jìn)作用，可以提高土壤微生物種類(lèi)和含量，減弱對(duì)微生物生存環(huán)境的脅迫。Ikeda等研究發(fā)現(xiàn)洋蔥和甜菜中細(xì)菌多樣性的近30%的差異是由于施肥條件造成的，而且2種植物的群落結(jié)構(gòu)在脲醛肥料作用下單向移動(dòng)。微生物降解高分子聚合材料的難易程度主要取決于聚合物分子的大小和結(jié)構(gòu)、微生物的種類(lèi)以及微生物的生活環(huán)境條件。對(duì)聚合物而言,一般可被微生物降解的化學(xué)結(jié)構(gòu)順序?yàn)?脂肪族酯鍵、肽鍵>氨基甲酸酯>脂肪族醚鍵>亞甲基。此外，相對(duì)分子質(zhì)量大、分子結(jié)構(gòu)排列規(guī)整、疏水性大的聚合物,不利于微生物的生長(zhǎng)和作用，也就不利于生物降解。高分子聚合材料的結(jié)構(gòu)依據(jù)分子在空間排列的規(guī)整性可分為結(jié)晶型、部分結(jié)晶型和無(wú)定型(非晶態(tài))三類(lèi)；高分子材料中除了晶態(tài)結(jié)構(gòu)外還有無(wú)定型(非晶態(tài))結(jié)構(gòu)。與無(wú)定型區(qū)域相比，高分子材料的晶體結(jié)構(gòu)區(qū)域結(jié)構(gòu)更致密更難降解；與因光、熱等物理因素部分降解的片段相比，不溶性高分子聚合材料從頭降解更難降解。脲醛高分子材料在光、熱、水分等因素作用下可以先將大分子降解為小分子片段，降解后的中小分子片段比較容易被微生物利用。Jahns等篩選出了能夠生物降解脲醛高分子緩釋肥經(jīng)部分降解后的小分子中間物，如亞甲基脲、二甲基三脲、異丁烯二脲和丁烯二脲。菌種

Ralstonia

paucula

能夠產(chǎn)生降解亞甲基脲的MDUase；菌種

Burkholderia

sp.能夠產(chǎn)生降解MDU(亞甲基脲)、DMTU(二甲基三脲)的MDUase；菌種

Rhodococcus

erythropolis

能夠產(chǎn)生降解IDU(異丁烯二脲)的IDUase；菌種

Rhodococcus

sp.能夠產(chǎn)生降解CDU(丁烯二脲)的CDUase.以上微生物能夠利用脲醛小分子中間代謝物作為生長(zhǎng)所需的唯一氮源。但是，目前對(duì)于不能熱解的、水不溶性的脲醛大分子肥料尚無(wú)生物降解的相關(guān)報(bào)道，而對(duì)不易自然降解的大分子進(jìn)行從頭降解微生物及相關(guān)酶是更徹底的、源頭性生物降解，對(duì)生物降解的研究更有意義。已有研究篩選得到亞甲基脲等中間代謝物的降解菌及降解酶，然而脲醛高分子肥料的微生物降解過(guò)程尚未進(jìn)行研究。因此，本研究擬以含磷和鉀元素的脲醛高分子緩釋肥料(PSRF)為研究對(duì)象(圖1)，利用SEM、激光粒度分布、乙酰丙酮分光光度法和鉬酸銨分光光度法，研究高分子脲醛緩釋肥料中不易熱解的、不溶性高分子團(tuán)聚顆粒部分的生物降解過(guò)程，以期為脲醛緩釋肥的生物從頭降解途徑提供及應(yīng)用參考。

圖1 高分子脲醛緩釋肥料(PSRF)的合成途徑[21]Fig.1 Synthesis of polymer urea-formaldehyde slow-release fertilizer (PSRF)[21]

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1

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1

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1

菌株和PSRF肥料樣品本研究中使用的菌株

P.

rubens

23229 分離自中北大學(xué)連續(xù)2年施用PSRF肥料(每年施肥1次，每次種植時(shí)施用11.84 g肥料)的盆栽(長(zhǎng)120 cm×寬40 cm×深28 cm)土壤(土壤深度為20 cm)樣品，現(xiàn)為本實(shí)驗(yàn)室保存菌株。所使用的含氮磷鉀生物降解高分子脲醛緩釋肥料(PSRF肥料)由山西省高分子復(fù)合材料工程技術(shù)研究中心提供。

1

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1

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2

培養(yǎng)基和主要試劑

無(wú)機(jī)鹽母液的配制：FeCl·4HO 1.8 g，CoCl·6HO 0.25 g，NiCl·6HO 0.01 g，CuCl·2HO 0.01 g，MnCl·4HO 0.70 g，ZnCl0.1 g，HBO0.5 g，NaMoO·2HO 0.03 g， NaSeO·5HO 0.01 g，蒸餾水1 L。配制好后放于冰箱4 ℃保存，使用時(shí)取1 mL定容到1 L作為無(wú)機(jī)鹽溶液使用。

復(fù)合維生素母液的配制：生物素0.1 g，煙酸0.35 g，鹽酸硫胺素0.3 g，對(duì)氨基苯甲酸0.2 g，鹽酸吡多胺0.1 g，泛酸鈣0.1 g，維生素B0.05 g，蒸餾水1 L。配制好后放于冰箱4 ℃保存，使用時(shí)取7.5 mL定容到1 L作為復(fù)合維生素溶液使用。

篩選培養(yǎng)基：PSRF 10 g、無(wú)機(jī)鹽溶液1 mL、復(fù)合維生素溶液7.5 mL、蒸餾水1 000 mL。

察氏培養(yǎng)基(Czapek)：硝酸鈉3 g、磷酸氫二鉀1 g、MgSO·7HO 0.5 g、KCl 0.5 g、硫酸亞鐵0.01 g、蔗糖30 g、蒸餾水1 000 mL。

磷酸緩沖液的配制(0.2 mol/L pH 7.0)：A液(NaHPO·HO 3.161 g)，B液(NaHPO·HO 2.760 g)，分別溶于蒸餾水，定容至100 mL；A液與B液按61∶39體積比混合。

戊二醛溶液(2.5%)：取25%戊二醛水溶液10 mL和磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L pH 7.0) 50 mL，用蒸餾水定容至100 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1

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2

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1

PSRF降解菌富集篩選

土壤采集：采集施用過(guò)高分子緩釋肥料PSRF的土壤，用取樣鏟將表層土壤3 cm左右的浮土除去，采取深度5～10 cm處的土壤，裝入預(yù)先滅菌的采樣袋中，混合均勻。稱(chēng)取5 g土壤，溶解于1 000 mL蒸餾水中，接入含有肥料PSRF的液體篩選培養(yǎng)基中(篩選過(guò)程中設(shè)置了3個(gè)重復(fù))，置于28 ℃恒溫智能生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d。將對(duì)PSRF富集的菌液按10～10倍梯度稀釋后，分別涂布于篩選平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)4～5 d。挑選PSRF降解菌株，在篩選平板上多次劃線直至得到純菌落。

1

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2

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2

降解微生物菌落形態(tài)特征觀察

肉眼觀察降解菌在固體篩選培養(yǎng)基(PSRF)上的菌落形狀、顏色、透明度、隆起和邊緣特征等。挑取菌種于載玻片上，用光學(xué)顯微鏡(SK 160，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司，中國(guó))進(jìn)行進(jìn)一步觀察。

1

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2

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3

ITS 基因序列鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

采用omega HP真菌DNA提取試劑盒(E.Z.N.A.TM High Performance (HP) Fungal DNA Kit)法提取菌體總DNA。利用ITS1/ITS4(真菌)引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′和ITS4：5′-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3′擴(kuò)增所篩菌株的序列，將所獲得的擴(kuò)增片段利用 DNAMAN 軟件進(jìn)行拼接，使用Contig Express拼接測(cè)序結(jié)果，并去除兩端不準(zhǔn)的部分。測(cè)序結(jié)果與 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA-X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1

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2

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4

抗熱解PSRF(rPSRF)肥料的制備

稱(chēng)取100 g PSRF于500 mL三角瓶中，加入200 mL去離子水，置于25 ℃下水浴攪拌30 min，使用中速濾紙進(jìn)行過(guò)濾；棄去濾液，將剩余的PSRF用2 L去離子水洗2次，加入500 mL去離子水重懸，于75 ℃水浴攪拌30 min，使用中速濾紙進(jìn)行過(guò)濾；棄去濾液，將剩余的PSRF用2 L去離子水洗2次，加入500 mL去離子水重懸，于100 ℃水浴攪拌30 min，使用0.45 μm的濾膜進(jìn)行抽濾，用100 mL去離子水水洗2次；最后將過(guò)濾器上的PSRF在40 ℃干燥箱中烘干，備用。

1

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2

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5

無(wú)菌發(fā)酵液的制備

分別在察氏培養(yǎng)基(Czapek)和PSRF篩選培養(yǎng)基中接種產(chǎn)紅青霉，28 ℃ 100 r/min震蕩培養(yǎng)10 d，取發(fā)酵液在轉(zhuǎn)速4 000 r/min，4 ℃的條件下，離心10 min，棄去沉淀，將上清液過(guò)0.45 μm的混合濾膜，得到無(wú)菌的Czapek發(fā)酵液以及PSRF發(fā)酵液。

1

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2

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6

微生物及酶從頭降解性能研究

以熱處理過(guò)的抗熱解高分子肥料(rPSRF)為唯一碳源和氮源，分別接種產(chǎn)紅青霉或無(wú)菌發(fā)酵液于30 ℃共培養(yǎng)7 d，rPSRF肥料降解分組見(jiàn)表1：

表1 本研究rPSRF肥料降解分組
Table 1 Anti-pyrolytic PSRF fertilizers used in this study

組別Group處理方式Processing mode空白對(duì)照 CK20 g rPSRF肥料+200 mL無(wú)菌水產(chǎn)紅青霉組 Penicillium rubens group20 g rPSRF肥料+200 mL無(wú)菌水+微量元素0.2 mL、維生素1.5 mL+產(chǎn)紅青霉菌種2 mLCzapek發(fā)酵液 Czapek fermented liquid group20 g rPSRF肥料+200 mL Czapek無(wú)菌發(fā)酵液PSRF發(fā)酵液 PSRF fermented liquid group20 g rPSRF肥料+200 mL PSRF無(wú)菌發(fā)酵液

以上樣品每24 h取一次樣，檢測(cè)pH、甲醛、磷含量以及電導(dǎo)率。連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d。甲醛含量的檢測(cè)采用乙酰丙酮分光光度法。磷含量檢測(cè)采用鉬酸銨分光光度法。電導(dǎo)率用電導(dǎo)率儀(DDSJ-308F，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司，中國(guó))測(cè)定。

1

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2

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7

降解顆粒粒度分布檢測(cè)

產(chǎn)紅青霉菌對(duì)抗熱解肥料降解15 d后，將液體搖勻后取樣15 mL，使用激光粒度分布儀(Bettersize2600，丹東百特儀器有限公司，中國(guó))對(duì)粒度分布進(jìn)行檢測(cè)。

另外取5 mL樣品以0.22 μm的水相濾膜過(guò)濾，使用Zeta電位及激光粒度分析儀(Zeta Plus，布魯克海文儀器公司，美國(guó))進(jìn)行納米粒度分布檢測(cè)。

1

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2

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8

抗熱解肥料降解的顯微觀察

產(chǎn)紅青霉菌組樣品共培養(yǎng)15 d后，挑取殘余PSRF肥料于載玻片上，使用熒光顯微鏡(Axio Vert A 1，卡爾蔡司公司，德國(guó))進(jìn)行觀察。同時(shí)將另一部分肥料置于1.5 mL離心管內(nèi)，加入2.5%的戊二醛溶液(固定液加滿離心管，使樣品完全浸沒(méi)在固定液中)，放置于4 ℃保存，等待SEM使用前的預(yù)處理。

SEM樣品預(yù)處理：倒掉固定液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用1%的鋨酸溶液固定樣品1～2 h；小心取出鋨酸廢液，用0.1 mol/L，pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3次，每次15 min；用梯度濃度(包括30%，50%，70%，80%，90%和95%五種濃度)的乙醇溶液對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min，再用100%的乙醇處理2次，每次20 min。用乙醇與醋酸異戊酯的混合液(

V

(乙醇)∶

V

(醋酸異戊酯)=1∶1)處理樣品30 min，再用純醋酸異戊酯處理樣品1 h或放置過(guò)夜。臨界點(diǎn)干燥。鍍膜，觀察。處理好的樣品以生物電鏡(Nova Nano 450，F(xiàn)EI公司，美國(guó))觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

本研究數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析(匯總統(tǒng)計(jì)、相關(guān)性、方差分析和

t

檢驗(yàn))在Origin 2019 b中進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 PSRF肥料降解菌的篩選及分離

在選擇性培養(yǎng)基上篩選具有潛在降解PSRF功能的菌株的結(jié)果見(jiàn)圖2(a)?？芍壕鋱A形，菌落面平坦，中心呈深綠色，邊緣白色，質(zhì)地絨狀或兼輕微絮狀。光學(xué)電子顯微鏡下觀察到菌絲和分生孢子(圖2(b))，分生孢子面綠色；菌絲體白色，無(wú)滲出液，反面初期為黃綠色或淡黃色；有帚狀枝，分生孢子鏈狀。從形態(tài)上觀察與青霉屬菌種相似。

圖2 PSRF培養(yǎng)基上生長(zhǎng)菌落的形態(tài)(a)和菌體在光學(xué)顯微鏡下圖像(b) (400×)Fig.2 Colony morphology on PSRF media (a) and image of under light microscope (b) (400×)

2.2 菌株鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

利用NCBI-BLAST對(duì)降解菌的ITS rRNA基因進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，分離得到的菌種與

Penicillium

rubens

CBS 129667(序列號(hào)NR_111815.1)相似度最高，去除首尾多余序列后同源性達(dá) 100.00%。采用Geneious和MEGA軟件構(gòu)建篩選菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)如圖3所示。因此，結(jié)合該降解菌菌落形態(tài)、菌體大小和生理生化等特征，確定該菌種為

P.

rubens。菌株送至中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心進(jìn)行專(zhuān)利菌種保藏，保藏號(hào)CGMCC 23229。

紅框區(qū)域是本研究篩選到的菌株P(guān). rubens 23229；圖標(biāo)中0.010表示代表每1 000個(gè)核苷酸/氨基酸中有10個(gè)不同。The red box area is the strain P. rubens 23229 identified in this study. The value 0.010 below the scalebar represents 10 different nucleotides/amino acids per 1 000 nucleotides/amino acids.圖3 PSRF降解菌株基于ITS rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of PSRF degradeted microorganisms based on ITS rRNA gene sequence

2.3 P. rubens 23229對(duì)PSRF抗熱解部分降解的形態(tài)觀察

P.

rubens

23229對(duì)PSRF抗熱解部分降解的形態(tài)觀察結(jié)果見(jiàn)圖4。圖4(a)為PSRF抗熱解肥料的空白組在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果，可以看出肥料平整。

P.

rubens

23229與抗熱解肥料培養(yǎng)基在室溫下共培養(yǎng)10～20 d后，三角瓶中出現(xiàn)白色團(tuán)狀菌絲；挑取部分團(tuán)狀菌絲，在熒光顯微鏡下觀察(圖4(b))。與無(wú)菌的空白組(圖4(a))中只有均勻分布的肥料相比，圖4(d)中可以觀察到肥料上有菌絲纏繞。用生物掃描電鏡進(jìn)一步觀察與

P.

rubens

23229共培養(yǎng)組中rPSRF肥料的碎塊和

P.

rubens

23229互相交錯(cuò)(圖4(c))，圖4(c)中的1和2分別代表rPSRF肥料降解產(chǎn)生的碎塊和

P.

rubens

23229的菌絲，圖4(d)中的3、4分別代表圖4(c)中紅色圓圈放大后的

P.

rubens

23229的菌絲和rPSRF肥料降解產(chǎn)生的小碎屑。以上顯微觀察結(jié)果表明，

P.

rubens

23229能在水不溶性的抗熱解脲醛高分子肥料rPSRF上附著生長(zhǎng)，并通過(guò)生物降解將其從致密的大塊結(jié)構(gòu)分解為小塊甚至更小的碎屑。

(a)PSRF在熒光顯微鏡下放大100倍的圖(CK)；(b)P. rubens 23229對(duì)rPSRF降解在熒光顯微鏡下放大100倍的圖；(c)和(d)P. rubens 23229對(duì)rPSRF降解在生物掃描電鏡下的圖，放大倍數(shù)分別為500和10 000倍。(d)和(c)紅圈區(qū)域的放大圖。1和4表示PSRF被P. rubens 23229降解后產(chǎn)生的碎塊；2和3表示P. rubens 23229生長(zhǎng)產(chǎn)生的菌絲。(a) The 100 fold magnification of PSRF under fluorescence microscope(CK). (b) A 100 fold magnification of the degradation of rPSRF by P. rubens 23229 under fluorescence microscope. (c) and (d) The images of P. rubens 23229 degrading rPSRF under biological scanning electron microscope, with magnification of 500 and 10 000 times, respectively. (d) The enlarged image of the area outlined in red in (c). 1 and 4 represent fragments generated by degradation of PSRF by P. rubens 23229. 2 and 3 are P. rubens 23229 mycelia.圖4 P. rubens 23229 對(duì)rPSRF部分降解的形態(tài)觀察Fig.4 Morphological observation of P. Rubens 23229 on the anti pyrolysis partial degradation of rPSRF

2.4 Penicillium rubens 23229對(duì)PSRF抗熱解部分降解粒度分布

用激光粒度儀檢測(cè)

P.

rubens

23229對(duì)rPSRF部分降解的微米級(jí)顆粒大小分布結(jié)果見(jiàn)圖5(a)?？梢?jiàn)未經(jīng)處理的空白對(duì)照和經(jīng)過(guò)產(chǎn)紅青霉處理的樣品，其顆粒直徑均集中在197.8 μm附近，但分散性有顯著差異。經(jīng)過(guò)

P.

rubens

23229處理的樣品在低于197.8 μm處的累積分布達(dá)到75.83%，對(duì)照組為67.31%，比對(duì)照提高了8.52%，說(shuō)明

P.

rubens

23229存在時(shí)小顆粒數(shù)增加；試驗(yàn)組在大于567.4 μm處的累積分布為0.28%，對(duì)照組為2.18%，比對(duì)照降低了1.90%，說(shuō)明

P.

rubens

23229存在時(shí)肥料大顆粒數(shù)目減少。圖5(a)微米級(jí)顆粒大小分布結(jié)果表明

P.

rubens

23229加強(qiáng)了抗熱解肥料PSRF分解為小顆粒的程度。圖5(b)為加入產(chǎn)紅青霉菌前后抗熱解肥料上清液中小于0.22 μm的納米級(jí)顆粒大小分布圖。從圖中可以看出，與

P.

rubens

23229共培養(yǎng)后，樣品粒度分布較空白對(duì)照朝中軸有一定的收縮趨勢(shì)，其有效直徑為693.7 nm，與對(duì)照(705.2 nm)相比降低了1.63%。圖5(b)納米級(jí)顆粒大小分布結(jié)果說(shuō)明了

P.

rubens

23229將rPSRF進(jìn)一步降解為納米級(jí)顆粒。

圖5 Penicillium rubens 23229對(duì)rPSRF肥料作用的不同顆粒大小的粒度分布Fig.5 Particle size distribution of Penicillium rubens 23229 on rPSRF fertilizer

2.5 P. rubens 23229 對(duì)rPSRF的降解產(chǎn)物分析

PSRF經(jīng)熱處理后,剩余的部分為抗熱解肥料(rPSRF)。研究

P.

rubens

23229 與rPSRF共培養(yǎng)期間，甲醛、磷含量以及電導(dǎo)率隨時(shí)間的變化趨勢(shì)，結(jié)果見(jiàn)圖6。從圖6(a)中可以看出，在rPSRF肥料中加入了產(chǎn)紅青霉后，溶液中磷的含量在24 h內(nèi)顯著升高至0.791～19.228 μg/mL；2～7 d內(nèi)磷的含量趨于穩(wěn)定，溶液中的磷含量最高達(dá)21.520 μg/mL。相比較而言，空白對(duì)照組在0～7 d時(shí)間中磷含量變化區(qū)間為0.127～1.573 μg/mL。磷是PSRF高分子肥料的組成部分，游離磷含量的增加，說(shuō)明肥料在降解過(guò)程中釋放了磷酸根?？瞻捉M經(jīng)過(guò)熱處理，自然降解速率較低，磷含量較低，而有

P.

rubens

23229存在時(shí)，顯著提高了肥料大分子的降解速度。磷酸根是菌種生長(zhǎng)的重要物質(zhì)，從第1天之后產(chǎn)紅青霉組磷含量雖有波動(dòng)，但總體保持在18.187～21.520 μg/mL范圍內(nèi)，這可能是磷酸根在肥料降解和菌種利用速度之間達(dá)到的一種動(dòng)態(tài)平衡。甲醛是PSRF合成的單體之一，也是其降解的終端產(chǎn)物之一。從圖6(b)可以看出，空白對(duì)照組在試驗(yàn)期內(nèi)甲醛含量無(wú)顯著變化，含量均低于0.001 8 mg/mL。有

P.

rubens

23229存在時(shí)，體系中甲醛含量從0.015 7 mg/mL迅速增加到0.134 0 mg/mL，并在隨后的5 d內(nèi)持續(xù)增加，最高達(dá)到0.213 0 mg/mL，提高到初始甲醛含量的13.6倍，與對(duì)照相比差異顯著(

P

<0.05)。與磷酸根一樣，甲醛也是微生物生長(zhǎng)可利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，尤其在無(wú)其他碳源存在的情況下，甲醛是重要的碳源，甲醛含量理論上是肥料降解和微生物利用之間的動(dòng)態(tài)平衡結(jié)果。以上結(jié)果說(shuō)明

P.

rubens

23229可以降解rPSRF肥料并利用其作為營(yíng)養(yǎng)素生長(zhǎng)繁殖。在rPSRF中加入了產(chǎn)紅青霉后，電導(dǎo)率變化情況見(jiàn)圖6(c)。在第1天，電導(dǎo)率由123.3 μS/cm增加到220.0μS/cm，增加了96.7 μS/cm，是空白對(duì)照(CK)的電導(dǎo)率在1 d中增加量28.9 μS/cm(31.2～60.1 μS/cm)的3.35倍，差異顯著(

P

<0.05)。試驗(yàn)組2～6 d的變化趨勢(shì)比較平緩，可能是由于

P.

rubens

23229的大量繁殖對(duì)溶液中離子消耗，6～7 d，試驗(yàn)組的電導(dǎo)率又有了上升趨勢(shì)，菌種繁殖相對(duì)飽和對(duì)抗熱解肥料降解的離子小于消耗的離子，故電導(dǎo)率開(kāi)始增加。試驗(yàn)組的整體趨勢(shì)與磷含量變化比較一致，說(shuō)明了磷酸根離子的對(duì)電導(dǎo)率的變化有一定的影響。對(duì)照組整體上趨勢(shì)比較平緩，說(shuō)明了抗熱解肥料自身的緩慢降解，導(dǎo)致電導(dǎo)率的逐步增加。

圖6 Penicillium rubens 23229與rPSRF肥料共培養(yǎng)過(guò)程中磷含量(a)、甲醛含量(b)以及電導(dǎo)率(c)隨時(shí)間的變化趨勢(shì)Fig.6 Changes of phosphorus content (a), formaldehyde content (b) and electrical conductivity (c) of Penicillium rubens 23229 on rPSRF fertilizer

2.6 P. rubens 23229 無(wú)菌發(fā)酵液性質(zhì)初步分析

利用鉬酸銨分光光度法檢測(cè)磷含量分析

P.

rubens

23229無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)rPSRF的降解能力，結(jié)果見(jiàn)圖7(a)?？芍号c對(duì)照組磷含量(0.127～0.832 μg/mL)相比，加入以PSRF肥料培養(yǎng)

P.

rubens

23229無(wú)菌發(fā)酵液后，rPSRF和

P.

rubens

23229無(wú)菌發(fā)酵液混合體系中磷含量持續(xù)增加，最高達(dá)10 057.143 μg/mL，差異顯著(

P

<0.05)。說(shuō)明在無(wú)菌的發(fā)酵液中含有rPSRF降解酶，而且該酶為菌種產(chǎn)生的胞外酶。無(wú)菌發(fā)酵液中磷含量的最大值遠(yuǎn)高于有菌存在時(shí)的量(21.520 μg/mL)，證實(shí)了菌體在降解后對(duì)其中磷元素的利用。相反，察氏培養(yǎng)基培養(yǎng)

P.

rubens

23229的無(wú)菌發(fā)酵液與rPSRF共培養(yǎng)后，系統(tǒng)中磷含量增加很少(最大值87.054 μg/mL)。究其原因可能是察氏培養(yǎng)基配方中本身含有的磷元素，在此過(guò)程幾乎沒(méi)有因?yàn)榉柿辖到舛略龅牧住Ｒ陨辖Y(jié)果表明在不含PSRF的察氏培養(yǎng)基中無(wú)降解酶產(chǎn)生，也即降解酶的產(chǎn)生必須有PSRF的存在，受PSRF誘導(dǎo)產(chǎn)生。利用乙酰丙酮分光光度法檢測(cè)甲醛含量分析

P.

rubens

23229無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)rPSRF的降解能力，甲醛含量變化結(jié)果見(jiàn)圖7(b)?？梢?jiàn)：以PSRF肥料培養(yǎng)

P.

rubens

23229無(wú)菌發(fā)酵液中甲醛的含量隨著時(shí)間的變化整體呈上升趨勢(shì)，由0.169 0 mg/mL增加到最高值0.200 0 mg/mL；Czapek無(wú)菌發(fā)酵液中甲醛的含量由0.037 8 mg/mL增加到最高值0.139 0 mg/mL；空白對(duì)照中甲醛含量無(wú)顯著變化，均低于0.001 8 mg/mL。PSRF肥料無(wú)菌發(fā)酵液中，最初的甲醛含量比Czapek無(wú)菌發(fā)酵液的甲醛含量高，是由于發(fā)酵液中含有初期降解PSRF肥料產(chǎn)生的甲醛，而PSRF肥料無(wú)菌發(fā)酵液中的誘導(dǎo)酶要優(yōu)于Czapek無(wú)菌發(fā)酵液。最終穩(wěn)定后，PSRF肥料無(wú)菌發(fā)酵液中最高的甲醛含量0.200 0 mg/mL高于Czapek無(wú)菌發(fā)酵液中最高的甲醛含量0.139 0 mg/mL，說(shuō)明不同發(fā)酵液中的酶種類(lèi)含量不同，所能降解rPSRF的產(chǎn)生甲醛的結(jié)構(gòu)有限，故降解穩(wěn)定后，PSRF肥料無(wú)菌發(fā)酵液中的酶降解rPSRF生成甲醛的能力優(yōu)于Czapek無(wú)菌發(fā)酵液。溶液電導(dǎo)率的變化趨勢(shì)見(jiàn)圖7(c)。Czapek無(wú)菌發(fā)酵液的電導(dǎo)率增加量為280 μS/cm，是空白對(duì)照(CK)的電導(dǎo)率在7天中增加量182 μS/cm的1.538倍；PSRF肥料無(wú)菌發(fā)酵液的電導(dǎo)率增加量為1 890 μS/cm，是空白對(duì)照(CK)的電導(dǎo)率增加量182 μS/cm的10.385倍，差異顯著(

P

<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明在有PSRF存在時(shí)其降解酶活性更強(qiáng)，受PSRF誘導(dǎo)產(chǎn)生。

圖7 無(wú)菌發(fā)酵液對(duì)PSRF肥料作用的磷含量(a)、甲醛(b)以及電導(dǎo)率(c)的變化情況Fig.7 Changes of phosphorus content (a), formaldehyde contend (b) and the electrical conductivity (c) of sterile fermentation broth on PSRF fertilizer

3 討 論

本研究以高分子緩釋肥料PSRF為唯一碳源和氮源，從土壤中篩選出1株高分子脲醛降解菌，經(jīng)鑒定為產(chǎn)紅青霉

Penicillium

rubens

CGMCC 23229。產(chǎn)紅青霉菌廣泛存在于土壤、海藻、食品等樣品中，該菌以發(fā)霉的哈密瓜、未發(fā)酵的葡萄汁、啤酒瓶蓋殘留物質(zhì)等作為營(yíng)養(yǎng)來(lái)源。產(chǎn)紅青霉菌的次生代謝產(chǎn)物包括青霉素等，另外有些萜烯類(lèi)、聚酮類(lèi)、酰胺類(lèi)化合物等次生代謝物還可刺激植物生長(zhǎng)發(fā)育、制備西瓜霜等。高分子材料降解菌包括降解塑料的

Marinomonas

、降解脲醛的低聚物亞甲基脲等的菌種

Ralstonia

paucula

、

Burkholderia

sp.和

Rhodococcus

sp.等，主要為細(xì)菌，真菌報(bào)道不多。本研究首次篩選到的脲醛高分子降解菌產(chǎn)紅青霉為真菌，一方面豐富了高分子材料生物降解菌的種類(lèi)；另一方面，在十幾份土壤樣本近百個(gè)篩選樣品中最終只篩選分離到產(chǎn)紅青霉，沒(méi)有篩選到他微生物尤其是已有報(bào)道的細(xì)菌降解菌，分析其原因如下：一方面可能是能夠以脲醛肥料為唯一碳源和氮源進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物較少；另一方面也可能是產(chǎn)紅青霉在篩選培養(yǎng)基這種營(yíng)養(yǎng)貧瘠的條件下生存時(shí)由PSRF誘導(dǎo)同時(shí)產(chǎn)生了青霉素等抗生素，抑制了土壤中原本可能降解代謝脲醛高分子肥料的其他微生物，包括某些細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖。高分子聚合材料的降解受光、熱、酸等物理化學(xué)的影響，生物降解通常從無(wú)定型區(qū)開(kāi)始，對(duì)結(jié)構(gòu)緊密的結(jié)晶區(qū)較難發(fā)揮作用。脲醛高分子肥料中間代謝物如亞甲基脲、二甲基三脲、異丁烯二脲、丁烯二脲等，此類(lèi)化合物分子量小、溶解性高，易為微生物利用，篩選到的降解菌也主要為細(xì)菌。對(duì)于結(jié)構(gòu)緊密、分子量更大、溶解性小高分子聚合材料，微生物降解難度增大，尚未見(jiàn)報(bào)道。為了解決大分子降解的問(wèn)題，有研究先使用酶解將高分子材料降解為微生物可以利用的聚合物單體，進(jìn)而再進(jìn)行微生物降解研究。本研究篩選得到的

P.rubens

23229能夠?qū)Ω叻肿涌篃峤夥柿?rPSRF)進(jìn)行降解，并對(duì)其降解酶進(jìn)行初步研究，試圖探究高分子脲醛緩釋肥料從高聚物到中間代謝物再到甲醛和尿素的生物降解的全過(guò)程。根據(jù)本研究結(jié)果推測(cè)脲醛在土壤中可能存在一條完整的生物降解鏈，即：1)由青霉菌等真菌產(chǎn)生降解酶對(duì)不溶性的大分子脲醛肥料進(jìn)行第一步降解；2)產(chǎn)生小分子中間代謝物后，再由土壤中細(xì)菌類(lèi)降解菌進(jìn)一步降解。微生物是土壤生態(tài)的重要組成部分，對(duì)肥效及植物生長(zhǎng)至關(guān)重要。闡明微生物對(duì)肥料的降解機(jī)制及影響因素對(duì)于緩釋效果及肥效有一定的理論意義與應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié) 論

以含氮磷鉀的高分子脲醛緩釋肥料(PSRF)為唯一碳源和氮源分離和篩選得到1株脲醛高分子肥料降解菌，經(jīng)鑒定為

Penicillium

rubens

CGMCC 23229；該菌可將結(jié)構(gòu)緊密的抗熱解不溶性大顆粒PSRF降解為小分子碎片，釋放出含磷、甲醛等小分子化合物；該菌株產(chǎn)生的降解酶可分泌至發(fā)酵液中，且受PSRF誘導(dǎo)產(chǎn)生。